Summary
この原稿が縦2光子顕微鏡を用いたin vivoでのアミロイド斑の蓄積の間に脳血管系のリモデリングを追跡するための手順を説明します。間引き頭蓋骨製剤は、アルツハイマー病のマウスモデルにおける脳損傷の進行を評価するために、蛍光色素の可視化を可能にします。
Abstract
脳血管系のリモデリングは、脳の病理の共通の特徴です。 in vivoでのイメージング技術は、脳血管可塑性または損傷が残業を発生し、神経活動や血液の流れに関連して検出することが基本です。 生体内では 2光子顕微鏡は、生きている脳内の大規模な細胞単位の構造的および機能的可塑性の研究を可能にします。具体的には、間引き頭蓋骨ウィンドウの準備は重要な脳の炎症を誘発することなく、関心領域（ROI）の皮質領域の可視化を可能にします。皮質ROIの反復的なイメージングセッションは、多数のCNS疾患の進行中に、時間をかけて病気の特徴の特徴付けを提供する、実現可能です。脳の250μmの範囲内軟膜構造にアクセスするこの技術は、遺伝子細胞マーカーおよび/または生体染色色素によってコードされた蛍光プローブの検出に依存しています。後者（ 例えば、蛍光デキストラン）はLUMINをマッピングするために使用されています脳血管構造のアルコンパートメント。本明細書に記載のプロトコルに密接には、アルツハイマー病（AD）の進行を評価するためのアミロイド沈着のインビボマーカー、メトキシO4の使用です。我々はまた、血管の変化およびアミロイド沈着を追跡するために使用されるポスト取込み画像処理を説明します。 ADのモデルに現在着目して、記載されているプロトコルは、病理学的な脳血管変更が発生し、他のCNS障害に関連しています。
Introduction
脳血管系は、解剖学的および機能的ニューロンに結合されている多細胞構造です。血管の動的なリモデリングは、脳の発達全体および中枢神経系（CNS）1,2の病状の進行中に発生します。広く脳損傷が、てんかん、アルツハイマー病（AD）、外傷性脳損傷および脳炎3,4を含むいくつかのCNS疾患の顕著な特徴であることが認められています。発症から慢性期に、CNS疾患をモデル化するときしたがって、in vivoでの脳血管の変化を追跡することは重要になります。脳血管の修飾は、しばしば、神経損傷または可塑性と同時に起こるように、神経血管系の画像化は、CNS疾患の病態生理学を解読するためのキーのエントリポイントを表します。
このプロトコルは、マウスモデルにおいて脳血管系の再構築を追跡するために、長手方向の二光子ベースの手順を説明しますAD、アミロイド形成性プラーク沈着5-7による大と小口径血管に脳血管の欠陥によってマークプログレッシブ病理。この手順では、病気の経過を通して神経血管リモデリングに対するアミロイド沈着の可視化とその位置と成長の追跡を可能にします。バイタル蛍光色素は、トランスジェニックADマウス8における脳血管およびアミロイド斑の可視化のための各撮像セッションの前に注入されます。薄くなった頭蓋骨の頭蓋窓を通してROIのイメージングセッションを非侵襲的であり、生きているマウスの脳2,5,9,10に神経血管リモデリングを評価するための選択の方法を繰り返します。
以下の手順は、外科プロトコル、画像取得および処理の概要を説明します。主に大軟膜と貫通細動脈における脳アミロイド血管症（CAA）の早期の進行を特徴としています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
マウスは、食物、水を自由に摂取へのアクセスを許可し、12時間の明暗サイクルで維持されています。実験動物に関わるすべての手順は、国家と欧州の法律に準拠し、教育や科学研究（CEEA-LR-00651から01）のためのフランスの省によって承認されました。 6トランスジェニック5xFADと4同腹の野生型（WT）対照マウスの合計は、この手順のために使用されました。
1.術前の準備
- 腹腔内（IP）メトキシX04（10mg / kgの）Aβ沈着物11を標識する手術前48時間を注入。
- 無菌の人工脳脊髄液（aCSFの）（120 mMのNaClを、26.2 mMの炭酸水素ナトリウム、2.5 mMの塩化カリウムを、準備1 mMののNaH 2 PO 4、1.3のMgCl 2、10 mMグルコース、95％O 2/5％CO 2の前とバブル2.5 mMのCaCl 2を）加えます。
- 無菌の前にオートクレーブまたはホットビーズ滅菌器を使用して、手術道具（はさみ、ピンセット、カミソリの刃とドリルビット）を滅菌します手術。
- 70％エタノールで手術用ベンチや顕微鏡プレートを清掃し、清潔な吸収性の布でカバーしています。
- ケタミン/キシラジン（75 mgの/ kgおよび10mg / kg、それぞれ）と鎮痛剤ケトプロフェン（2.5ミリグラム/キログラム）IPを注入します。
- 足や尾のピンチで麻酔の適切なレベルを確認してください。
- 目に無菌眼軟膏を適用し、ウィスカを避けながら毛皮（耳、鼻）を剃ります。脱毛クリームであれば、それは慎重に皮膚刺激を防止するために、水ですすぎが続いているとして使用することができます。かみそりの刃で、残りの毛を剃ります。ポビドンヨード消毒液で皮膚を滅菌します。
- 双眼顕微鏡下でマウスを置き、鼻に耳から皮膚切開を行います。頭蓋骨を露出するように横向きに肌を引き出します。骨膜を切開し、繰り返し可能な出血を止めるために、滅菌aCSFので頭蓋骨をすすぎます。
2.血管系標識および間伐スカルウィンドウの準備（40分）
- 綿棒で眼軟膏を削除します。眼科用局所麻酔剤（テトラ1％）の低下を適用し、優しく突起を達成するために、眼窩の周りの皮膚に圧力をかけます。
- ヤーデニと同僚12によって記載された手順以下の眼窩に、デキストラン（70 kDaの）（皮下インスリン注射針を100mg / kgまたは50 mg / mlで溶液50μl）と結合したフルオレセインイソチオシアネート（FITC）を注入します。目に無菌眼軟膏を適用します。
- 皮膚が後退し、頭蓋骨が選択された撮像領域の周り清潔で乾燥していることを確認してください。デバイスをマウントヘッドの窓周りのシアノアクリル接着剤の少量を適用し、数秒10のための穏やかな圧力を適用し、ターゲット領域の周囲、及び接着剤（積み重ねかみそり刃からなる、 図1を参照）。
- 領域があることを確認すること、デバイスをマウントヘッドの窓の縁に皮膚の端を引いてドライ。皮膚および獣医グレードのシアノアクリル接着剤の少量のウィンドウの端を固定し、乾燥した（ 図1）になるまで待ちます。
- ヘッドマウント装置を使用しての段階で動物を固定します。滅菌aCSFのですすぎ、よく皮膚やヘッドマウントデバイスとの間が完全に密閉されていることを確認してください。正常体温を維持するために、生存毛布にマウスを包みます。
- 以前に10を説明したようにaCSFの溶液中に頭蓋骨の間伐を行います。頭皮が完全に除去されないことに注意してください。定期的に骨の破片をクリアすると、組織の過熱を回避するために、aCSFのを変更します。残りの骨の破片が短い空気パフを用いて除去することができます。 aCSFの溶液は、穿孔によって作成された振動を減衰させます。
注：マウスの頭蓋骨の厚さは、動物の年齢と関心領域に応じて80〜150ミクロンの間で変化します。 - （中程度の速度でと0.7ミリメートルバリ）歯科用ドリルを使用すると、エリア1に頭蓋骨の表面を薄く開始します。頭蓋骨への定期的な上下動パラレルを使用して削除直径0ミリメートル海綿骨の大部分（最初の40から70ミクロン）。 aCSFのごとに20〜30秒を交換し、3-4秒に中断されない掘削を制限することを忘れないでください。縫合糸の近くに骨が高度に血管であることに注意してください。 aCSFのが最終的な出血を止めるためにゲルフォームを予め浸し適用します。
- 過度の圧力がかからないように注意しながら、頭蓋骨の間伐を続行するには鋭利な使い捨ての眼科顕微ブレードを使用してください。 35ミクロン - 最後の領域は直径20の厚さと、約0.5mmです。
注：これにより、骨の再成長および瘢痕化のために、それは、各撮像セッションでウィンドウをさらに薄くする必要があります。
3.二光子顕微鏡（45分）
- 必要に応じて、適切な麻酔を維持するために19ミリグラム/ kgのケタミン注射します。
- 二光子レーザー顕微鏡（headmountステージに固定された）マウスを転送します。 20X水浸OBJを使用して、、1.0の開口数ectiveエピ蛍光ランプを用いた光フィールドの中央に薄く頭蓋窓を探します。目的は常にaCSFの中に浸漬されていることを確認してください。
- モードロックパルスレーザーチタン（Ti-サファイア680-1040nm）でレーザスキャンを開始します。それぞれ青と緑のチャンネルにメトキシXO4およびFITCデキストランの放出された蛍光を検出するために、750 nmで励起波長を設定します。
注：顕微鏡は、506 nmおよび555 nmで2ビームスプリッタを持っています。青色光は、470±12 nmのフィルターを備えたNDD検出器によって捕捉されます。緑色光は、525±25 nmのフィルターを備えた高感度のGaAsP検出器によって捕捉されます。目的から放出された最大のレーザパワーは、レーザ誘起組織の損傷を避けるために、10ミリワットを超えてはなりません。 - ROIの正確な再局在化のための3Dマップを作成するために、0.7X数値ズームで、低倍率のスタック（2ミクロンステップ500ミクロン×500ミクロン、512×512ピクセル）を取得後の時点で。
- 2X数値ズーム（;1μmのステップは200μm×200μmで、512×512ピクセル）で4高いデジタル倍率画像のモザイクを取得します。イメージングソフトウェアを使用すると、すべての領域をキャプチャするために200μm以下の手順でウィンドウを移動します。スタックの深さは、モザイクの各画像に軟膜表面から出発し、一般的には250μmです。
- 顕微鏡からマウスを削除する前に、写真を撮るか、イメージング分野の将来の再局在化のための軟膜血管系の手描きの2Dマップを作ります。
4.リカバリと再イメージング
- 下に頭蓋骨を保持しながらトラクションを適用することにより、ヘッドマウントデバイスを削除します。任意の接着剤は、頭蓋骨や皮膚に付着したままの場合、細かい鉗子で慎重にそれを削り取ります。頭皮を縫合し、ホームケージに戻す前に、麻酔からの回復を監視するために加熱されたケージにマウスを置きます。私は、縫合糸への局所抗生物質のクリームを適用し、ケトプロフェン（2.5ミリグラム/キログラム）を注入しますPは2日後。
- 繰り返しは、繰り返しイメージングセッションのために1.1〜2.5を繰り返します。必要であれば、画像の最適な品質を確保するために顕微ブレードと骨を剃ります。
注：イメージングセッションの間の間隔は1ヶ月より長い場合、歯科用ドリルで追加の薄型化が必要になることがあります。 - 前回のセッション（ステップ3.6）から取られた軟膜血管系の2Dマップに従って落射蛍光光を用いて顕微鏡下にマウスを置きます。
- 二光子レーザー走査を開始し、ステップ3.4で得られた3次元地図を用いたマイクロメートルスケールでのアラインメントを達成するために顕微鏡のステージを調整します。ステップ3.5で説明したように、詳細な撮影に進みます。
5.買収後三次元再構成と画像解析
- 例えばIMARIS（バージョン8.0及び7.7.2を使用）などの3D画像解析ソフトウェアを用いて脈管構造およびアミロイド沈着の三次元再構成を得ます。 画像スタックの深さ全体で2つのチャネルの理想的なコントラストを得るために、画像処理メニューやコントラスト変化サブメニューのノーマライズレイヤプラグインを使用します。
- 同時に全ての時点で同じ領域の画像を開き、常に異なる時点を比較するために並行して処理します 。
- フィラメントトレーサーモジュールを使用してトレース容器。
- 、新しいフィラメントを作成するために、フィラメントのアイコンをクリックして自動トレーサーをスキップして、自動パス方法を選択します。
- 選択されたチャンネルは、血管画像に対応していることを確認してくださいとポインタの選択機能を使用して、開始点を決定するために、シフト+コントロールキーを押しながらイメージングセッション間で保存されている血管分岐部でクリックします。ポインタの選択機能を使用して、フィラメントのエンドポイントを選択するには、Shiftキーを押しながらクリックします。
注：obtaiの比較NEDスケルトンは、血管系の構造変化が表示されます。
- 新しいプラークを追跡するために、平面分析による平面を行います。 Aβプラークの成長を追跡するための青チャンネルに表面モジュールを適用します。新しいサーフェスを作成し、自動化された表面の作成に進むには、表面のアイコンをクリックしてください。バックグラウンド信号を設定し、減算するしきい値メソッドを使用します。統計メニューは、個々のアミロイド沈着物の表面に関するデータを提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
このプロトコルは、残業脳血管アミロイド沈着物を可視化するための方法を説明します。蛍光染料は、アミロイド沈着（メトキシXO4）11を標識することおよび脳血管内腔（FITC-デキストラン）1を埋めるために注入しました。 3D画像分析ソフトウェアモジュールは、連続した時点で撮像視野一定の視野の3D画像を作成するために使用されました。 5XFADマウス5（ADの遺伝モデル）ほとんどのAβ沈着物は、（ 図2）実質で成長し、周り（ 図3）血管を貫通し、年齢の3と4ヶ月の間に表示されるショーの体性感覚皮質で得られた代表的な画像。プラーク堆積は重要なリモデリングおよび隣接脳血管系の時折閉塞（ 図2）と同時に発生します。プラークサイズの減少のみまれ、これはプラークaの工程であることを示し、観察されました ccumulation。 図2と図 3は、実質および血管の周りのアミロイド生成性負荷が体性感覚皮質の血管新生および血管閉塞に関連付けられていることを示しています。閉塞が主に小口径の血管で発生したのに対し、血管アミロイド斑および血管閉塞との関係は、ほとんどの血管プラークは大きな貫通動脈に蓄積されたことを考えると、依然として不明です。
1.実験のセットアップを図。 （A）ヘッドのセットアップ。ステージがカスタムメイドなのです。ヘッドマウントデバイスは、以前に10記載されているように構築された積層型カミソリの刃で構成されています。頭の中でロックされたマウスの（B）の表示には、デバイスをマウントします。 （C）頭蓋骨に接着デバイスと皮膚のビュー。エッジは、標的領域に集中しています。S / ftp_upload / 54796 / 54796fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
年齢の4と5ヶ月で5xFADマウス上の微小血管系およびアミロイド沈着の二つの再構成画像の図2.比較。アミロイド斑は、白アスタリスクで示され、5ヶ月に現れる新しいプラークは、黄色のアスタリスクで示されています。プラーク減少のまれなインスタンスは、血管閉塞が赤い矢印で示されている間、新たに形成された微小血管は黄色の矢印で示されているオレンジ色のアスタリスクで示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
生後3、4と5ヶ月で体性感覚皮質における3大と小口径船舶図。大口径血管（白アスタリスク）上のアミロイド血管沈着物の（A）の成長。 （B）アミロイド斑はまた、小口径血管（黄色のアスタリスク）で観察することができます。赤い矢印は、閉塞血管を示しています。ホワイトアスタリスクは、成長するアミロイド斑を示しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
in vivoでの 2光子顕微鏡のためのオープン頭蓋骨技術は大きな撮像視野13,14の無制限のイメージングセッションの利点を提供しています。しかし、この技術は、互換性のない、多くの場合、関心14の領域における炎症を生成または神経血管リードアウト15に影響を与えます。逆に、薄くなった頭蓋骨の頭蓋技術は、脳血管の構造およびプラーク蓄積10,14の信頼性のイメージングを可能にする、神経炎症にはなりません。この技術によって提示された第2の利点は、間引き頭蓋骨ウィンドウの成功率は、経験豊富なマニピュレータのための90％に80％にまで達することができるということです。成功のための主要な後退は、過度の間伐と究極の破壊につながる骨の厚さの感謝の欠如です。双眼顕微鏡の経験と優れた光学系は、この問題が制限されます。多くの制限は、しかし、この手法に影響します。まず、撮像深さは限定COでオープン頭蓋骨の手順にmpared。第二に、時間をかけて、骨の上にある瘢痕組織は、経頭蓋イメージングの品質を低下させることができます。第三に、頭蓋骨は、各セッションでもう少し薄くする必要があることを考えると4つ以上のイメージングセッションに進むことは困難です。これにより、セッションの間に薄く増分を最適化するために、実験の開始時に撮像セッションの数を決定することが重要です。代替的に、カバーガラスで接着間引き頭蓋骨製剤からなる慢性頭蓋窓は、以前時間16にわたる骨組織の再成長を制限することが記載されています。効率的なものの、私たちは数週間、骨の再成長遅延、この技術は最終的に品質、深さと画像の細胞内解像度に干渉することが判明したときに、より長い期間（マルガリータ、アランゴ-LievanoとフレディJeanneteau、未発表データ）の後、イメージングを再。その限界にもかかわらず、二光子経頭蓋microscOPY繰り返し薄くなった頭蓋骨の準備を介して神経血管の変化と炎症が起こる慢性疾患モデルにおける蛍光マーカーを追跡するために選択される方法です。
骨に加わる圧力が出血を避けるために、フラット頭蓋骨ウィンドウを確実にするために最小化されるべきであるとして、頭蓋骨の最適間伐は、主要な技術的なステップを表します。出血および不均一な頭蓋骨のウィンドウが瘢痕化し、骨の凹凸の再成長を促進することができます。過度の穴あけ、またはレーザー損傷後の過熱第1の撮像セッション中に過度の間伐は、また、頭蓋骨窓を介して信号の明瞭度を損なうことができます。後者の問題は、定期的に、掘削中aCSFの媒体を変更する準備を冷却、断続的に穿孔し、骨を研磨する際にきれいな鋭いツールを使用して制御することができます。追加の重要なステップ（ii）はRETRを、呼吸に関連した動きを低減するためにプレートをヘッドマウントに頭蓋骨の（ⅰ）固定を含みますO-軌道注入し、すべての船舶の信頼性の高い可視性、（iii）は、将来の移転のための関心領域をマッピング、および（iv）前、パーとイメージングセッション間で術後のケア。
研究は神経血管構造を標的CNS薬の有効性と安全性を評価するためには、こちらをまとめる方法論は、分子が脳実質内や船舶でのアミロイド沈着を軽減または予防、 例えば 、ことができます。また、生きている脳の長手方向の2光子顕微鏡は、アミロイド形成の追跡および前認知力低下の発症ADの初期段階での神経血管系への影響を、可能にします。大きなアミロイド斑のクリアランスの欠如は、疾患の病態生理17を悪化させ、脳血管系に有害な影響を持つことができます。新しい蛍光生体染色色素の出現は、レビー小体、synucleopathy、プリオン凝集体、ハンチンチン凝集体を標識するremod神経血管系の将来の達成の可能性をサポートするために、他の神経変性疾患18の進行中に研究をeling。この技術は、インビボおよび実験モデルの構造と機能の細胞の相互作用を調査するために染料を組み合わせて、いくつかのマウス系統（SR101、メトキシX04、デキストラン、レクチン）と遺伝マーカー（thy1YFP、CX3CR1-GFP、NG2-DsRedを）に適合されています神経血管系の正常な生理学から逸脱。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者には、競合する金融利害関係を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、リーグ・フランセーズcontre L'épilepsie（MA-Lに）、（FJ）に研究所ナショナル・デ・ラ・サンテら・デ・ラ・RECHERCHEMédicaleグラントAVENIR R12087FSは、モンペリエの大学からの助成金（FJ）と補助金を承認したいと思います連盟から（NM）にラRECHERCHEシュルルCerveauを注ぎます。私たちは、モンペリエのin vivoイメージングのコアプラットフォームの施設内IPAMでChrystelラフォンの技術支援を認めます。また、原稿を校正するためのメアリーVernov（ワイルコーネル医科大学を）感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| methoxy-X04 | tocris | 4920 | use 10 mg/kg |
| FITC-Dextran 70 Kda | sigma | 46945 | use 100 mg/kg |
| gelfoam/Bloxang | Bausch and Lomb | ||
| micorsurgical blade | surgistar | 6900 | must be sharp and not dented |
| povidone-iodine | betadine | antisceptic solution | |
| binocular stereomicroscope | olympus | SX10 | optimal image contrast is crucial for this procedure |
| 2-photon microscope | zeiss | Zeiss LSM 710mp | |
| fine scissors-toughcut | Fine science tools | 14058-09 | this scissors are optimized for cutting skin and soft tissue |
References
- Harb, R., Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. In vivo imaging of cerebral microvascular plasticity from birth to death. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (1), 146-156 (2013).
- Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. Perturbed neural activity disrupts cerebral angiogenesis during a postnatal critical period. Nature. 505 (7483), 407-411 (2014).
- Masamoto, K., et al. Microvascular sprouting, extension, and creation of new capillary connections with adaptation of the neighboring astrocytes in adult mouse cortex under chronic hypoxia. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (2), 325-331 (2014).
- Marchi, N., Lerner-Natoli, M.
- Giannoni, P., et al. Cerebrovascular pathology during the progression of experimental Alzheimer's disease. Neurobiol Dis. 88, 107-117 (2016).
- Kimbrough, I. F., Robel, S., Roberson, E. D., Sontheimer, H. Vascular amyloidosis impairs the gliovascular unit in a mouse model of Alzheimer's disease. Brain. 138 (Pt 12), 3716-3733 (2015).
- Herzig, M. C., et al. Abeta is targeted to the vasculature in a mouse model of hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis. Nat Neurosci. 7 (9), 954-960 (2004).
- Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. J Neurosci. 26 (40), 10129-10140 (2006).
- Liston, C., et al. Circadian glucocorticoid oscillations promote learning-dependent synapse formation and maintenance. Nat Neurosci. 16 (6), 698-705 (2013).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).
- Klunk, W. E., et al. Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative. J Neuropathol Exp Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Cao, V. Y., et al. In vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons. J Vis Exp. (71), (2013).
- Holtmaat, A., et al. Long term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).
- Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J Vis Exp. (43), (2010).
- Joseph-Mathurin, N., et al. Amyloid beta immunization worsens iron deposits in the choroid plexus and cerebral microbleeds. Neurobiol Aging. 34 (11), 2613-2622 (2013).
- Sadowski, M., et al. Targeting prion amyloid deposits in vivo. J Neuropathol Exp Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).
