Summary

Céfopérazone traité Souris Modèle de Cliniquement pertinentes<em> Clostridium difficile</em> Strain R20291

Published: December 10, 2016
doi:

Summary

Ce protocole décrit le modèle de souris céfopérazone d'infection à Clostridium difficile (CDI) en utilisant une souche cliniquement pertinente et génétiquement traitable, R20291. L' accent mis sur la surveillance clinique de la maladie, C. énumération bactérienne difficile, la toxine cytotoxicité, et des changements histopathologiques tout au long de CDI dans un modèle de souris sont détaillés dans le protocole.

Abstract

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and consequently poses an urgent threat to public health. Recurrence of a C. difficile infection (CDI) after successful treatment with antibiotics is high, occurring in 20-30% of patients, thus necessitating the discovery of novel therapeutics against this pathogen. Current animal models of CDI result in high mortality rates and thus do not approximate the chronic, insidious disease manifestations seen in humans with CDI. To evaluate therapeutics against C. difficile, a mouse model approximating human disease utilizing a clinically-relevant strain is needed. This protocol outlines the cefoperazone mouse model of CDI using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Techniques for clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol. Compared to other mouse models of CDI, this model is not uniformly lethal at the dose administered, allowing for the observation of a prolonged clinical course of infection concordant with the human disease. Therefore, this cefoperazone mouse model of CDI proves a valuable experimental platform to assess the effects of novel therapeutics on the amelioration of clinical disease and on the restoration of colonization resistance against C. difficile.

Introduction

Clostridium difficile est un anaérobie, bacillus sporulé Gram positif qui provoque la vie en danger de la diarrhée 1. Infection à C. difficile (ICD) est associée à une augmentation de la morbidité et la mortalité humaines et les résultats dans plus de 4,8 milliards $ en coûts de soins de santé par an 1-4. En 2013, les Centers for Disease Control and Prevention catégorisés C. difficile comme un risque urgent de résistance aux antibiotiques, ce qui indique qu'il constitue une menace urgente pour la santé publique 1. Actuellement, le traitement antibiotique vancomycine et métronidazole sont considérés comme la norme de soins pour CDI 5. Malheureusement, la récurrence du CDI après un traitement réussi avec des antibiotiques est élevée, se produisant dans 20 – 30% des patients 2,5-7. Par conséquent, la découverte de nouveaux agents thérapeutiques contre cet agent pathogène entérique est nécessaire. Pour évaluer la thérapeutique contre C. difficile, un modèle animal approchant la maladie humaine en courant alternatifsouche linically pertinente est nécessaire.

Dans un premier temps , les postulats de Koch ont été établies pour C. difficile en 1977 en utilisant un modèle de hamster syrien clindamycine traité 8. Ce modèle est encore utilisé aujourd'hui pour étudier les effets des toxines de C. difficile sur la pathogenèse 9,10. Cependant, le CDI dans le modèle hamster entraîne des taux de mortalité élevés et ne se rapproche pas les manifestations de la maladie insidieuse chroniques qui peuvent être vus chez l' homme avec CDI 10,11. Sur la base de l'accessibilité et de disponibilité des plates-formes réactif de souris dans la recherche d'un modèle de souris de la CDI est pertinente.

En 2008, un modèle de souris robuste de CDI a été créé par le traitement des souris avec un cocktail d' antibiotiques dans l' eau potable (kanamycine, gentamicine, la colistine, le métronidazole et la vancomycine) pendant 3 jours , suivie d'une injection intrapéritonéale de clindamycine 12. Cette souris rendues sensibles à la colite CDI et sévère. Dépendretion de la dose d'inoculum administré, une gamme de signes cliniques et la létalité peut être observée en utilisant ce modèle. Depuis ce temps, divers traitements antibiotiques ont été étudiés qui modifient le microbiote intestinal murin, ce qui diminue la résistance à la colonisation au point où C. difficile peut coloniser le tractus gastro – intestinal (revue dans Best et al. Et Lawley & Young) 13,14.

Plus récemment, une céphalosporine à large spectre, céfopérazone, étant donné dans l'eau de boisson pendant 5 ou 10 jours rend reproductible des souris sensibles à la CDI 15. Depuis l' administration des céphalosporines de troisième génération sont associés à un risque accru de CDI chez l' homme, l' utilisation du modèle de céfopérazone reflète plus fidèlement la maladie 16 d'origine naturelle. Céfopérazone souris traitées sensibles à C. difficile ont été provoquées avec les deux spores de C. difficile et les cellules végétatives de diverses souches cliniques allant dansla pertinence et la virulence 17. Malgré certaines des études originales utilisant des cellules végétatives C. Difficile comme la forme infectieuse, spores de C. difficile sont considérés comme le principal mode de transmission 18.

Dans la dernière décennie, C. difficile R20291, a / BI / 027 souche NAP1, a vu le jour, ce qui provoque des épidémies de CDI 19,20. Nous avons cherché à déterminer l'évolution clinique de la maladie , lorsque les souris céfopérazone traités ont été exposés à la souche de C. difficile cliniquement pertinente et génétiquement traitable, R20291. Ce protocole détaille l'évolution clinique, y compris la perte de poids, la colonisation bactérienne, la toxine cytotoxicité, et des changements histopathologiques dans le tractus gastro – intestinal des souris infectées avec des spores de C. difficile R20291. Dans l'ensemble, ce modèle de la souris se révèle être une plate-forme expérimentale précieuse pour CDI approchant la maladie humaine. Ce modèle de souris caractérisé peut donc être utilisée pour évaluer les effetsde nouveaux produits thérapeutiques sur l'amélioration de la maladie clinique et sur la restauration de la résistance à la colonisation contre C. difficile.

Protocol

Déclaration éthique: La Commission institutionnelle animale soin et l'utilisation (IACUC) à la North Carolina State University College of Veterinary Medicine (NCSU) a approuvé cette étude. Le NCSU Animal Care et Utiliser la politique applique les normes et les lignes directrices énoncées dans la Loi sur la Loi et Extension de recherche en santé du bien – être des animaux de laboratoire 1985. animaleries à NCSU adhérer aux lignes directrices énoncées dans le Guide pour le soin et l' u…

Representative Results

Au cours d'une étude représentative, 5-week-old C57BL / 6 souris WT ont été prétraités avec céfopérazone dans leur eau potable (0,5 mg / ml) pendant 5 jours et autorisés par jour 2 se laver avec de l'eau potable régulière. Les souris ont été provoquées avec 5 à 10 spores de C. difficile R20291 par gavage oral au jour 0 (figure 1A). Les souris ont été surveillés pour la perte de poids et les signes cliniques (léthargie, inapp…

Discussion

This protocol characterizes the clinical course, including weight loss, bacterial colonization, toxin cytotoxicity, and histopathological changes in the gastrointestinal tract, of antibiotic-treated mice challenged with C. difficile R20291 spores. There are several critical steps within the protocol where attention to detail is essential. Accurate calculation of the C. difficile spore inoculum is critical. This calculation is based on the original C. difficile spore stock enumeration, which sho…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Trevor Lawley at the Wellcome Trust Sanger Institute for C. difficile R20291 spores and James S. Guy at the North Carolina State University College of Veterinary Medicine for Vero cells, both utilized in this manuscript. Animal histopathology was performed in the LCCC Animal Histopathology Core Facility at the University of North Carolina at Chapel Hill, with special assistance from Traci Raley and Amanda Brown. The LCCC Animal Histopathology Core is supported in part by an NCI Center Core Support Grant (2P30CA016086-40) to the UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. We would also like to thank Vincent Young, Anna Seekatz, Jhansi Leslie, and Cassie Schumacher for helpful discussions on the Vero cell cytotoxicity assay protocol. JAW is funded by the Ruth L. Kirschstein National Research Service Award Research Training grant T32OD011130 by NIH. CMT is funded by the career development award in metabolomics grant K01GM109236 by the NIGMS of the NIH.

Materials

#62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner  SSS Navigator 48027 This product will require dilution as recommended by the manufacturer
0.22 μm filter Fisherbrand 09-720-3 Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Needs to be heated in water bath at 37C prior to use
0.4% Trypan Blue Gibco 15250-061
1% Peniciilin/Streptomycin Gibco 15070-063
10% heat inactivated FBS Gibco 16140-071 Needs to be heated in water bath at 37C prior to use
1ml plastic syringe  BD Medical Supplies 309628
1X PBS Gibco 10010-023
2 ml Micro Centrifuge Screw Cap Corning 430917
96 well cell culture flat bottom plate Costar Corning CL3595
96 well filter plate Millipore MSGVS2210
Adhesive Seal ThermoScientific AB-0558
Bacto Agar Becton Dickinson 214010 Part of TCCFA plates (see below)
Bacto Proteose Peptone Becton Dickinson 211684 Part of TCCFA plates (see below)
Cefoperazone MP Bioworks 199695
Cefoxitine Sigma C47856 Part of TCCFA plates (see below)
Clostridium difficile Antitoxin Kit Tech Labs T5000 Used as control for Vero Cell Assay
Clostridium difficile Toxin A List Biological Labs 152C Positive control for Vero Cell Assay
D-cycloserine Sigma C6880 Part of TCCFA plates (see below)
Distilled Water Gibco 15230
DMEM 1X Media Gibco 11965-092 Needs to be heated in water bath at 37C prior to use
Fructose Fisher L95500 Part of TCCFA plates (see below)
Hemocytometer Bright-Line, Sigma Z359629
KH2PO4 Fisher P285-500 Part of TCCFA plates (see below)
MgSO4 (anhydrous) Sigma M2643 Part of TCCFA plates (see below)
Millex-GS 0.22 μm filter Millex-GS SLGS033SS Filter for TCCFA plates 
Na2HPO4 Sigma S-0876 Part of TCCFA plates (see below)
NaCl Fisher S640-3 Part of TCCFA plates (see below)
Number 10 disposable scalpel blade Miltex, Inc 4-410
PCR Plates Fisherbrand 14230244
Plastic petri dish Kord-Valmark Brand 2900
Sterile plastic L-shaped cell spreader Fisherbrand 14-665-230
Syringe Stepper Dymax Corporation T15469
Taurocholate Sigma T4009 Part of TCCFA plates (see below)
Ultrapure distilled water Invitrogen 10977-015
C57BL/6J Mice The Jackson Laboratory 664 Mice should be 5-8 weeks of age
Olympus BX43F light microscope Olympus Life Science
DP27 camera Olympus Life Science
cellSens Dimension software  Olympus Life Science

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Cite This Article
Winston, J. A., Thanissery, R., Montgomery, S. A., Theriot, C. M. Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291. J. Vis. Exp. (118), e54850, doi:10.3791/54850 (2016).

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