Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

ve Cefoperazone-tedavi edilmiş fare modeli klinik olarak ilgili doi: 10.3791/54850 Published: December 10, 2016

Summary

Bu protokol klinik olarak ilgili ve genetik uysal gerginlik, R20291 kullanarak Clostridium difficile enfeksiyonu (CDI) sefoperazon fare modeli özetliyor. Klinik hastalık izleme, C. difficile bakteriyel numaralandırma, toksin sitotoksisite ve bir fare modelinde CDI genelinde histopatolojik değişikliklere vurgu protokolde ayrıntılı olarak verilmiştir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Clostridium difficile hayatı tehdit eden ishal 1 neden olan bir anaerobik, gram pozitif, spor oluşturan basildir. C. difficile enfeksiyonu (CDI) yıl 1-4 başına sağlık maliyetlerinde üzerinde 4800000000 $ artmış, insan morbidite ve mortalite ve sonuçları ile ilişkilidir. 2013 yılında, Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri kamu sağlığı 1 acil tehlike teşkil ettiğini gösteren, acil antibiyotik direnç riski C. difficile kategorize. Şu anda, antibiyotik vankomisin ile tedavi ve metronidazol CDI 5 için standart bakım olarak kabul edilir. Hastaların 2,5-7% 30 - Ne yazık ki, antibiyotik başarılı tedavi sonrası CDI tekrar 20 meydana gelen, yüksek. Bu nedenle, bu enterik patojene karşı yeni terapötiklerin keşfi gereklidir. C. difficile, ac insan hastalığı yaklaşan bir hayvan modelinde karşı ilaç gruplarına değerlendirmeklinically-İlgili suşu gereklidir.

Başlangıçta, Koch Postülatları bir klindamisin ile tedavi edilen Suriye hamster modeli 8 kullanılarak 1977 yılında C. difficile için kurulmuştur. Bu model hala patogenezi 9,10 C. difficile toksin etkilerini araştırmak için bugün kullanılmaktadır. Ancak, CDI Hamster modelinde yüksek mortalite oranları ile sonuçlanır ve CDI 10,11 insanlarda görülebilir kronik sinsi hastalık belirtilerinin yaklaştığı değildir. Araştırmada sıçangil platformlar erişilebilirlik ve reaktif durumuna göre, CDI bir fare modeli uygundur.

2008 yılında, CDI sağlam bir fare modeli klindamisin 12 bir intraperitoneal enjeksiyon, ardından 3 gün bir antibiyotik içme suyu kokteyl (kanamisin, gentamisin, kolistin, metronidazol ve vankomisin) fareler muamele edilmesiyle kurulmuştur. CDI ve şiddetli kolit duyarlı Bu hale fareler. bağlıuygulanan aşı doz ing, klinik belirti ve letalitesinin bir dizi bu model kullanılarak görülebilir. Bu zamandan beri, çeşitli antibiyotik rejimleri C. difficile gastrointestinal sistem kolonize olabilir noktaya kolonizasyon direnci azalan, fare bağırsak Mikrobiyota değiştiren incelenmiştir (En ark gözden geçirdik. Ve Lawley & Young) 13,14.

Daha yakın zamanlarda, 5 ya da 10 gün boyunca içme suyu verilen geniş spektrumlu sefalosporinler, sefoperazon, tekrarlanabilir CDI 15 duyarlı fare oluşturur. Üçüncü kuşak sefalosporin verilmesinin insanlarda CDI riski ile ilişkili olduğundan, sefoperazon modelinin kullanımı daha doğru bir hastalık 16 doğal olarak meydana gelen yansıtır. Sefoperazon ile tedavi edilen C. difficile duyarlı fareler C. difficile sporlarının ve klinik olarak değişen suşları çeşitli bitkisel hücreler hem meydan edilmiştiralaka ve virülans 17. Bulaşıcı form olarak C. difficile vejetatif hücreleri kullanılarak özgün çalışmaların bazılarında rağmen, C. difficile sporlarının iletim 18 ana mod olarak kabul edilir.

Son on yılda, C. difficile R20291, bir NAP1 / BI / 027 suşu, CDI 19,20 salgınlara neden ortaya çıkmıştır. Biz sefoperazon ile tedavi edilmiş fareler klinik olarak ilgili ve genetik uysal C. difficile suşu, R20291 aşılandığında hastalığın klinik seyrini belirlemeye çalıştık. Bu protokol kilo kaybı, bakteri kolonizasyonu, toksin sitotoksisite ve C. difficile R20291 sporları ile meydan farelerin gastrointestinal sistemde histopatolojik değişiklikler de dahil olmak üzere, klinik seyir ayrıntıları. Genel olarak, bu fare modeli CDI insan hastalığı yaklaştırmak için değerli bir deney platformu olduğunu kanıtlamaktadır. Bu özelliği, fare modeli, etkilerini değerlendirmek için kullanılabilirklinik hastalığın iyileştirilmesi ve C. difficile karşı kolonizasyon direnci restorasyonu yeni tedavi yöntemleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etik Açıklama:
Veteriner North Carolina State University College'da Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) (NCSU) bu çalışmayı onayladı. NCSU Hayvan Bakım ve politika Kuzey Carolina Devlet 1985. Laboratuar hayvanları tesislerinin Hayvan Refahı Yasası ve Sağlık Araştırması Uzatma Yasası belirtilen standartlar ve ilkeler Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı için Kılavuzu'nda belirtilen kurallara uymak geçerlidir kullanın. Hayvanların sağlık durumları günlük olarak değerlendirildi ve can çekişen hayvanlar insanca ikincil tedbirlerle takip CO 2 boğulma tarafından ötenazi uygulandı. Eğitimli hayvan teknisyenleri veya veteriner bu çalışma sırasında bir AAALAC akredite tesiste hayvancılık yapılmaktadır.

İçme Suyu Antibiyotik Cefoperazone'un 1. İdare C. difficile Kolonizasyon ve Hastalıklara Hassasiyetinin Başarmak için

NOTLAR: 5 ila 8 haftalık C57BL / 6 WT farelerin (kadın ve erkek)önce antibiyotik su yönetimini başlamadan satın alınan ve 1 hafta boyunca karantinaya alındı. karantina takiben fareler otoklava gıda, yatak ve su ile yerleştirildi. Kafes değişiklikleri laminer akış kaputu laboratuvar personeli tarafından haftada yapıldı.

  1. 7 gün önce cebine hedeflenen gün (Şekil 1), steril damıtılmış su içinde sefoperazon (0.5 mg / ml) hazırlayın.
  2. sefoperazon su ile otoklava su şişeleri (0.5 mg / ml) doldurun ve her bir fare kafes içine yerleştirin.
    NOT: adımlarda 1.1 ve 1.2 gösterildiği gibi sadece Taze hazırlanmış sefoperazon su, 5 günlük dönemde yapılan ve 2 günde dışarı değiştirilmelidir. kurumsal çevre sağlığı ve güvenlik yönergeleri izleyerek sefoperazon suyun uygun şekilde imha edilmesi tavsiye edilir.
  3. sefoperazon su 5 gün sonra, steril distile su ile dolu otoklava su şişeleri ile şişeleri değiştirin. Deney süresince farelere bu içme suyu verin.

2. C. difficile Spore İnokulum hazırlanması ve Fareler Oral Gavaj

NOT: Başlamadan önce, aşağıdaki öğelerin en az 24 saat süreyle anaerobik odasına yerleştirilir emin olun: 1x fosfat tamponlu salin (PBS; Malzemeler bakınız), taurokolat sikloserin sefoksitin fruktoz agar (TCCFA) plakaları (Materyaller ve ek dosyasına bakın ) ve steril bir L-şekilli ayırıcı.

Not: C. difficile sporları ile tehdit Fareler Biyolojik Güvenlik Seviye 2 hayvan tesisine yerleştirilmiştir edilmelidir.

  1. Daha önceden hazırlanmış ve steril su 21,22 4 ° C 'de muhafaza edilmiştir (Bu durumda, R20291 olarak) istenen suşun bir C. difficile spor stok elde edilir. Kullanmadan önce bu spor stokunun numaralandırma belirleyin.
  2. Bilinen konsantrasyonda spor stoku (spor / ml) göre istenen seyreltme 25 ul başına 10 5 sporları elde etmek için hesaplanır. inokulum hacmi sağlamak tüm aşılamak için yeterliDeneyin (fare başına 25 ul), fareler inokulum numaralandırma (yaklaşık 30 ul) gerçekleştirmek için, ve pipetleme hatası hesaba.
  3. Vortex orijinal C. difficile spor stok. Daha sonra, bir vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüpü içinde, steril su içinde, orijinal C. difficile spor stoku (adım 2.2) hesaplanan hacmi tekrar süspansiyon. Laminer akış kaputu aerobik bu gerçekleştirin. Bu seyreltilmiş karışımı belirlemek "spor inokulum."
  4. 65 ° C su banyosu içine spor inokulum yerleştirin ve 20 dakika ısıtın.
    Not: Bu adım sadece aktif C. difficile sporlarının ısıl işlem sonrası kalmasını sağlayacaktır.
  5. Laminer akış kaputu içinde, ısıtmalı spor inokulum 50 ul almak steril bir mikrosantrifüj tüp içinde yerleştirin ve anaerobik odasına 23 içine geçer. spor sayımı için bu örneği kullanmak.
  6. Laminer akış kaputu içinde kalan ısıtılmış spor aşı int yükoa 1 ml şırınga steril ampul uçlu mide gavaj iğne takılı. fareler arasında dozaj doğru ve hızlı tekrarı sağlamak için manuel şırınga step yararlanın. sonda iğne kullanmadan önce ısıtılmış spor inokulum ile dolu olduğundan emin olun.
    Not: her fare için yeni bir steril gavaj iğnesi gerekli değildir. C. difficile sporların çeşitli dozları tatbik edilir, ancak yeni bir gavaj iğnesi Her bir doz önerilmektedir.
    NOT: C. difficile sporlarının geleneksel dezenfektanlara karşı oldukça dirençlidir. Bu nedenle, 62. Perisept sporların dezenfektan olarak bir sporisidal dezenfektan kullanımı gereklidir. Üretici C. difficile sporlarını yok etmek için bir 2-min temas süresini önerir.
  7. Gavaj spor inokulum 25 ul her bir fare. boynun gevşek cilt tarafından geri kafasını hareketsiz kılmak için hayvan tutarak yavaşça her fare kısıtlamaktadır. parmağı kullanarak daha fazla hayvanın kafasını ve hareketsizözofagus uzamış. hayvan seslendirmek ya da kısıtlama sırasında sıkıntı diğer belirtileri göstermeye olmadığından emin olun.
    Not: gavaj ile farelere verilen toplam hacmi 10 ml / kg vücut ağırlığı (0.1 ml / 10 g) olmalıdır.
  8. dik, dikey konumda fare korumak ve yavaşça ağzının kenarından içine sonda iğne geçmektedir. ağız çatı boyunca sonda iğne yönlendirin ve yavaş yavaş yemek borusuna doğru sonda iğne ilerlemek.
    NOT: Herhangi bir direnç ile karşılaşılırsa, gavaj iğne trakea içine giren olabilir ve bu nedenle ileri DEĞİL, daha ziyade hemen kaldırılır ve yeniden konumlandırılmış.
  9. sonda iğne özofagusa yaklaşık yarım sonra, ısıtmalı spor inokulum 25 ul enjekte ve yavaşça yemek borusu gelen sonda iğneyi çıkartın.
    NOT: sonda iğne Zoraki ilerleme yemek borusu veya mide yırtılmasına neden olabilir. gavaj iğne ilerleyen Bu nedenle, direnç ise, Hemen çıkarın ve sonda iğne yeniden konumlandırmak için en iyisidir.
  10. kendi kafesine hayvan dönün ve bu istenmeyen trakeal yönetimini veya ısıtılmış spor inokulum aspirasyon gösterebilir olarak, herhangi bir öksürük ya da solunum sıkıntısı belirtileri gözlemlemek.
    NOT: Fareler antibiyotik tedavisi sonrası C. difficile son derece duyarlı olan; kafesleri esastır arasında nedenle, önlemler çapraz bulaşmayı önlemek için. kontroller olarak ele antibiyotik ama karşı konulmaz fareler yönetirken bu özellikle önemlidir.
  11. tüm fareleri aşılamak sonra, steril bir mikrosantrifüj tüpe kalan ısıtılmış spor inokulum yerleştirin ve spor sayımı için anaerobik odasına geçmek.
  12. ısıtmalı spor inokulum sayımı için ve kalan zorla ağız yolundan verilmiştir ısıtmalı spor inokulum (adım 2.4), 1x PBS her inokulum 01:10 seri dilüsyonları olun. 5 dilüsyonları (yani, 10 -1 ile - 4 yapmak ve plaka tavsiye edilir10 -5).
  13. aseptik teknik kullanılarak, tek bir TCCFA plaka üzerine her seri seyreltme 100 ul aktarın.
  14. steril L şeklinde bir dağıtıcı ile eşit levha boyunca ortama tatbik seyreltme yayıldı. Hatta seyreltilmiş inokulum yayılan sporların doğru numaralandırma için esastır.
  15. 37 ° C'de 24 saat boyunca anaerobik olarak inkübe edin. 24 saat sonra, C. difficile koloni oluşturan birimler (CFU) hacmi 25 ul (0.025 mi) içinde farelere uygulanan enfektif dozu (takviye dosyası "Örnek hesaplamalar" bölümüne bakın) elde etmek üzere sayılabilir. C. difficile kolonileri sarı düz ve soluk ve düzensiz kenarları ve buzlu cam görünümü 24 var.
    NOT: Bakteriyel sayımı için tespit limiti 10 2 CFU olduğunu.

C. difficile Enfeksiyon boyunca Hastalık 3. İzleme Fare Kilo Kaybı ve Klinik Belirtiler

  1. tartılırantibiyotik kapalı 2 günlük bir iyileşme (gün 0) sonra, önce ve 5 gün sefoperazon, antibiyotik tedavisi sonrası nimals, ve daha sonra deney süresince.
    NOT: Her gün tutarlı bir seferde ağırlıkları alın. Ağırlıklar meydan gün (gün 0) C. difficile enfeksiyonu boyunca karşılaştırma için ilk başlangıç ağırlığı olarak kullanılması gerektiğini aldı.
  2. Bir biyogüvenlik kabini içine dijital bir ölçek yerleştirin. ölçek üzerine steril bir plastik behere koyun ve plastik beher ağırlığını daralayın. Sonra, yavaşça kuyruk tabanı ile fare pick up ve plastik beher içine yerleştirin.
    1. geri ölçekte behere koyun. Fare kaçış olmadığından emin olmak için beher üstünden elini getirin. istikrarlı bir ağırlık elde etmek için 3 sn - 2 adet sürebilir. Sonra, yavaşça geri kafesin içine fare koyun. Bu ağırlık kaydedebilir ve bu kafeste her fare için bu işlemi tekrarlayın.
      NOT: önlemler çapraz Contamina önlemek için alınması zorunludurkafesler arasında yon ağırlıklarını alırken. Farelerin oluşturduğu her bir kafes tartım için kendi plastik kabı olması gerekir. plastik kap her kullanım arasında bir sporisidal maddesi ile dezenfekte edilmiş ve steril alüminyum folyo ile kaplanmış olmalıdır.
  3. Günde iki kez (en azından) uyuşukluk, iştah, ishal kaybı ve kambur duruş dahil olmak üzere klinik şiddetli C. difficile enfeksiyonu belirtileri, meydan hayvanlar izleyin.
  4. Insanca onların ilk bazal vücut ağırlığının% 20 kaybedersiniz hayvanları euthanize ve / veya (adım 3.3 listelenen) C. difficile enfeksiyonu ciddi klinik belirtiler gelişir.
    NOT: başlangıç bazal vücut ağırlığı% 20 kayıp değil emin olmak için, deney sırasında gerektiği gibi C. difficile enfeksiyonu klinik belirtilerini gösterir Fareler tartılmalıdır. Deneyde erken zaman noktalarında sırasında, bu iki günde ölçümler anlamına gelebilir.

C. difficile 4. Bakteriyel numaralandırmaFare Dışkı ve Çekal İçerikten

NOT: 1x PBS (Malzeme), TCCFA plakaları (Malzeme bakınız), steril bir L-şekilli yayma ve steril mikrosantrifüj tüpleri ve / veya: Başlamadan önce, aşağıdaki öğelerin en az 24 saat süreyle anaerobik odasına yerleştirilir emin olun dilüsyonları için PCR plakaları.

  1. C. difficile Numaralama Örnekleri Alınması
    NOT: dışkı veya çekal içeriği elde etmek öncesinde, analitik bir ölçekte steril mikrosantrifüj tüpler tartın. Dört ondalık basamağa (ör 0,9864 g) yuvarlama tüp tarafında boru ağırlığı kaydedin. Bu ağırlık gösterelim "tüp ağırlığı." Toplanan Her numune steril, tartılmış mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilmelidir.
    1. Fare dışkı steril koleksiyon
      1. Yavaşça boynun gevşek cilt tarafından geri kafasını hareketsiz kılmak için hayvan tutarak her fare dizginlemek. t, yavaşça hayvanın kuyruk dizginlemek için pinky parmağınızı kullanınhus anüs açığa. hayvan seslendirmek ya da kısıtlama sırasında sıkıntı diğer belirtileri göstermeye olmadığından emin olun.
      2. doğrudan hayvanın anüs altında steril, tartılır ependorf tüp tutun. Tüp fare ile doğrudan temas etmediğini zorunludur.
        1. Hayvan defecates olarak, bir tüp içine dışkı pelet toplar. Tüm dışkı örnekleri toplanır kadar oda sıcaklığında tüpü bulundurun. Bir fare arınmak için Bu nedenle dışkı toplamak için tekrar denemelerini gerektiren, birkaç dakika sürebilir.
      3. Analitik ölçekte dışkı içeren tüpler tartılır. Dört ondalık basamağa (örn 1,0021 g) yuvarlama, tüp ağırlığını kaydedin. olarak elde kilo gösterelim "nihai tüp ağırlığı."
      4. doğrudan dışkı toplama sonra bakteri sayımı için anaerobik odasına dışkı örnekleri geçmektedir.
    2. Otopsi sırasında fare çekal içeriği steril koleksiyon
      1. İkincil tedbirler tarafından takip CO 2 boğulma tarafından insani ötenazi sonra, çekum 25 elde etmek için bir nekropsi gerçekleştirin. çekum gastrointestinal sistemin büyük, virgül şeklinde bölümdür.
      2. steril plastik Petri kabı üzerine çekum yerleştirin. tek kullanımlık steril hayır kullanın. 10 neşter bıçak çekal içeriğini ortaya çıkarmak için kesenin kör ucundan açık çekum kesmek için.
        1. Yavaşça neşter bıçağı ile hafif bir basınç uygulayarak ve çekum çizi kısmına doğru içeriği süpürme yoluyla çekal içeriğini ayıklayın.
          NOT: Bakım histopatolojik inceleme için sunulacaktır çekal doku, bozmayacak alınmalıdır.
      3. toplanmasını hemen izleyen bir steril, tartılır mikrosantrifüj tüp içine çekal içeriğini yerleştirin. çekal içeriği sadece yaklaşık 10 mg bakteriyel sayımı için gereklidir.
      4. Analitik skal üzerinde çekal içeriği barındıran tüpleri tartmake. Dört ondalık basamağa (örn 1,0021 g) yuvarlama, tüp ağırlığını kaydedin. olarak elde kilo gösterelim "nihai tüp ağırlığı."
      5. Bakteriyel numaralandırma için anaerobik odasına çekal içerik örnekleri geçirin.
  2. C. difficile bakteriyel numaralandırma
    1. C. difficile için numaralandırılan edilecek içeriklerin (dışkı veya çekal) son ağırlığını hesaplayın. dan "nihai tüp ağırlığı" çıkarılarak bu yapılan "tüp ağırlığı."
    2. 1X PBS içine içeriğinin 1:10 seyreltme hesaplayın ve buna göre tekrar süspansiyon. fekal pelet, (ek dosya "Örnek Hesaplamalar" bölümüne bakınız) yavaşça çözelti içine pelet bozmaya pipet ucu kullanın.
    3. Anaerobik içeriği oturuşmaya bırakılmış, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında, bu yeniden süspansiyon haline örnekleri inkübe edin.
    4. enum 1x PBS içinde, her numune için seri seyreltileriçeriği (dışkı veya çekal) gramı başına CFU durmasýna. anaerobik bu gerçekleştirin.
    5. aseptik teknik kullanılarak, TCCFA plakalarına her seri seyreltme 100 ul aktarın. steril bir L-şekilli serpme kullanarak, eşit plaka üzerinde yaymak için medyaya uygulanan seyreltme yayıldı. Hatta seyreltme yayılma kolonilerin doğru sayım için gereklidir.
    6. 37 ° C'de 24 saat boyunca anaerobik olarak inkübe edin. Bu zamanda, içerik (dışkı veya çekal) gramı başına CFU elde etmek için C. difficile koloniler numaralandırmak. C. difficile kolonileri sarı düz ve soluk ve düzensiz kenarları ve buzlu cam görünümü 24 var.
      NOT: Bu protokol, ileum ve kolon içerik de dahil olmak üzere, diğer sıçangil GI içeriğine, C. difficile numaralandırmak için kullanılabilir. PCR plakaları seri dilüsyonları yapmak için kullanılabilir.

5. Vero Hücre Sitotoksisite Tahlili C. difficile Toksin Cytotoxi belirlememizeŞehir

NOT: Bu deney örnekleri Nekropside toplandı ve -80 ° C'de saklandı fare modeli tamamlandıktan sonra yapılması tavsiye edilir. Aseptik hücre kültürü teknikleri, bu tahlil sırasında Vero hücreleri kirlenmesini önlemek için gereklidir. Bu protokol gerçekleştirmek için 2 gün sürer. Tüm dışkı ve bu deneyde kullanılan bağırsak içeriği tartılmış steril mikrosantrifüj tüpü içinde saklanmalıdır (ile gösterilir "boru ağırlığı" yukarıya bakın). (Içindekiler dahil) son tüp ağırlığı en yakın dört ondalık basamağa analitik bir ölçekte aracılığıyla ölçülür (yukarıdaki bölümüne bakınız). Çok kanallı bir pipet kullanın Bu deney için tavsiye edilir.

Not: başlamadan önce, aşağıdaki öğeler mevcut sağlamak olduğu: Vero hücreleri, DMEM 1x "olarak ifade% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ortam (Eagle ortamı (DMEM) 1x Dulbecco modifikasyonu medya, "Malzemeler ve tamamlayıcı dosyasına bakın),% 0.25Ultra saf su içinde 1 ug / ml, 3 ul tripsin-EDTA, 1 x PBS,% 0.4, tripan mavisi, 96 çukurlu bir hücre kültürü düz tabanlı plaka, 96 oyuklu filtre plakası, Clostridium difficile toksin A (eş-payı ve -80 ° C) mağaza, Clostridium difficile Antitoksin, hesaplamalar ve plaka haritaları için bir çalışma sayfası (;) ek dosyalarına bakın.

Not: Dikkat C. difficile ve toksin personel poz için bu tahlil sırasında alınmalıdır.

  1. Vero hücreleri, bölme (Gün 1)
    1. 37 ° C su banyosu içinde DMEM 1x ortamı,% 0.25 tripsin-EDTA ve 1 x PBS ısıtın.
    2. Hücre kültürü inkübatöründe (37 ° C ve% 5 CO2) Vero hücrelerinin bir şişeyi elde edilir ve steril hücre kültürü laminar akış başlığı içinde yerleştirin. Kullanmadan önce kaputu ve ekipman aşağı silmek için% 70 etanol kullanın. serolojik pipet kullanarak, Vero hücrelerinde çıkarın ve bir atık c içine atmak için doku kültürü şişesi medya aspiratOntainer.
    3. 1x PBS, 5 ml Vero hücreleri durulayın doku kültür şişesi içinde (önceden ısıtılmış). PBS aspire ve bir atık kabı içine atın.
    4. doku kültür şişesine% 0.25 tripsin-EDTA 5 ml. 3 dakika - 2 bir temas zaman tanıyın. Bu süre içinde, hücreler şişe yüzeyinden gelmeye başlar gözlemleyin. Yavaşça Vero hücreleri gevşetmek için yan doku kültürü şişesi yan sallayın.
    5. Tripsin-EDTA ile temas süresinden sonra, hemen doku kültür şişesi içine DMEM 1x ortam 5 ml. Bu Tripsin-EDTA nötralize edecektir. hafifçe balonun arkasında kapalı herhangi bir bekâr Vero hücreleri yıkamak için bu çözümü kullanın. Sonra, 15 ml konik tüp içine bu karışımı aktarmak için bir serolojik pipet kullanın.
    6. 180 x g'de 5 dakika ve 25 ° C'de konik tüp Vero hücreleri santrifüj. santrifüj düzgün dengeli olduğundan emin olun. Santrifüjden sonra, konik tüp altındaki Vero hücreleri görünür bir pelet görüyoruz. DISR özen gösterinBu pelet upt. konik tüp süpernatant kapalı aspire ve atın.
    7. DMEM 1x ortam 3 ml Vero hücreleri tekrar.
  2. Vero hücre sayımı
    1. % 0.4 tripan mavisi, 100 ul (Kademe 5.1.7 yapılan) Vero hücre süspansiyonu 100 ul ekle. Yavaşça yukarı ve aşağı çözüm pipetleme karıştırın.
    2. Bir hemasitometre her bölmeye Bu karışımın 10 ul ekle.
    3. hemasitometre dört parçaya içinde yaşayan hücrelerin sayısını. Ölü Vero hücreleri Tripan Blue alacak ve böylece (bu hücrelerin sayılmamalıdır) mavi boyanmış olacaktır. Bu numaraları kaydedin "Vero hücre çalışma sayfası," sağladı.
    4. Tüm dört çeyrek daireye canlı Vero hücrelerinin toplam sayısını toplamak ve ortalama hesaplamak. Hücrelerden çok 2 100 yana ul seyreltme faktörü, sıvının 200 ul'lik toplam içindedir.
    5. düzeltme faktörü ile çarpın "vermek; hücre sayısı / ml "hemasitometre kullanırken, düzeltme faktörü her zaman 10 4'tür vermek için toplam hacim ile çarpın." hücrelerinin toplam sayısını "..
  3. Her deney için Wells Gerekli Sayısını Belirleme
    NOT: Tek bir örnek (dışkı ya da bağırsak içeriği ya) nüsha halinde yapılacak 24 ayrı kuyu gerektirir. Oyuk başına 10 5 Vero hücre konsantrasyonunda (90 ul toplam hacim) gereklidir.
    NOT: Bir gece boyunca 37 ° C, oyuk başına 10 3 Vero hücreleri bir konsantrasyonda Vero hücre 96 oyuklu plakalar inkübe isterse uzun kuluçka süresi hesaba önerilir. Vero hücre çalışma sayfası içinde Hesaplamalar bu değişiklikleri hesaba ayarlanması gerekir.
    1. (Kademe 5.2 arasında, Vero hücre çalışma sayfası, Resim kullanın) mevcuttur Vero hücreleri miktarına göre kullanılabilir kuyu sayısı belirler.
    2. hacmi belirlemekİstenen kuyu sayısı doldurmak için gerekli Vero hücre süspansiyonu (numune sayısına göre test edilir). herhangi bir ek hacim (sağlanan Vero hücre çalışma sayfası kullanın) hata pipetleme için hesaba eklenir emin olun.
    3. Deney için gerekli hacmi elde etmek için DMEM 1x medya (Kademe 5.1.7 elde edilen) Vero hücre süspansiyonu seyreltilir.
  4. 96 oyuklu bir hücre kültür plakasına Tohum Vero hücreleri,
    1. Aşama 5.3.2 arasında Vero hücre yeniden süspansiyon kullanılarak, 96 çukurlu bir hücre kültürü düz tabanlı plakanın her oyuğuna Vero hücre süspansiyonu 90 ul bir çok kanallı pipet kullanın.
    2. Oyuklara toksini (örnekler) ilave edilmeden önce 4 saat en az CO2, 37 ° C'de bir hücre kültür inkübatörü içinde Vero hücreleri ile plaka inkübe ve% 5. Bu inkübasyon süresi Vero hücreleri her bir alt uymak sağlayacaktır.
  5. (Dışkı veya Örneklerinden Stok Çözümleri oluşturmaBağırsak İçerik)
    NOT: Tüm numuneler analitik bir ölçekte aracılığıyla ölçülen "tüp ağırlığı" ve "nihai tüp ağırlığı" olmalıdır. hesaplamalar için Vero hücre çalışma sayfası kullanın.
    1. içeriğinin ağırlık hesaplayın. mg için g dönüştürmek, sonra ul mg. 1x PBS içinde bir 1:10 seyreltme yapmak için gerekli çözümün ul nihai toplam sayısını hesaplayın. örnek eklemek için 1x PBS toplam miktarını hesaplayın.
    2. örnek (yukarıda hesaplanan) 1x PBS toplam hacim. aerobik, bu gerçekleştirin ve aseptik teknik kullanılarak. fekal pelet, yavaşça çözelti içine pelet bozmaya pipet ucu kullanın.
    3. Numuneler vorteksle ve daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3,522 x g'de santrifüj. santrifüj düzgün dengeli olduğundan emin olun. pelet bozabilir ve çözelti içine numuneyi tekrar süspansiyon için dikkatli olun.
      NOT: Yalnızca birkaç örnek işleniyor eğer Adım 5.5.3 sırasında, içeriği sterilize edilebilir96 çukurlu bir filtre plakası kullanılması yerine tek bir 0.22 mikron filtre içinden geçirilerek. Bazı örnekler bu tekniği kullanarak tüm hacim içeriği sterilize etmek için birden çok filtre gerekebilir.
    4. süpernatan 150 ul alarak ve 96 çukurlu bir filtre plakası üzerinde ayrı ayrı oyuklarına yerleştirerek Örnek / PBS karışımı sterilize edin. içeriği bu plaka filtre böylece 96 çukurlu bir hücre kültürü düz tabanlı plaka üzerine güvenli bir şekilde filtre plakası yerleştirin.
    5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 431 x g'de filtre plakası / hücre kültürü levha istifi santrifüjleyin. santrifüj düzgün dengeli olduğundan emin olun ve filtre plakası / hücre kültürü plakası yığını sıkıca hizalanmış olduğunu ve santrifüj sırasında kayması olmaz.
      NOT: Bu filtrelenmiş içerik seyreltme plakaları kullanılacaktır 10 -1 hisse senedi vardır.
    6. buz üzerine süzüldü örnekleri ile plaka koyun.
  6. Oluşturma Seyreltme Plate 1.
    NOT: Sulandırma Plate 1. (1 DP #) pozitif (C. difficile Toksin A) ve negatif (1x PBS) kontrollere (Vero hücre çalışma sayfası DP 1. düzeni bakınız) da dahil olmak üzere numune başına 6 kuyu, gerektirecektir.
    1. Bu deney için pozitif kontrol (C. difficile Toksin A) hazırlamak için, -80 ° C ila 3 ul alikotları (1 ug / ul) elde edilir ve 0.01 ug / ml bir nihai konsantrasyon elde edildi, ultra saf su 297 ul ekle. buz üzerine yerleştirin.
    2. Her bir örnek için onların yoğunluktaki (10 -1 -6 10) ile kuyu Etiket ve pozitif ve negatif kontroller göstermektedir (DP 1. düzeni bakınız).
    3. Her bir oyuğa 1x PBS uygun bir şekilde artırmıştır. 10 -1 kuyu NO PBS ekleyin. 10 -2 -6 ila 10 kuyuları, 1x PBS 90 ul ekleyin.
    4. Her bir oyuğa numune, uygun bir şekilde artırmıştır. 10 -1 kuyu, her bir örnek için 10 -1 stokunun 100 ul ekleyin (filtre plat gelen Adım 5.5.7 bkze). 10 -2 10 -6 kuyuları, seri dilüsyonları yapmak; 10 -1 kuyudan 10 ul alarak ve iyi 10 -2 ekleyerek başlayın. 10 -6 seyreltme dışarı seri dilüsyonları devam edin.
    5. şeffaf plastik yapıştırıcı mührü ile DP # 1 tabak kapatın ve buz üzerine yerleştirin.
  7. Oluşturma Seyreltme Plate 2.
    NOT: Sulandırma Plakası (DP # 2) pozitif ve negatif kontroller de dahil olmak üzere her bir örnek, (Vero hücre çalışma sayfası DP 2. düzeni bakınız) 6 kuyu 2 şeritli gerektirecektir.
    1. Her bir örnek için onların yoğunluktaki (10 -1 -6 10) ile kuyu Etiket ve pozitif ve negatif kontroller göstermektedir (DP 2. düzeni bakınız). ya da ( "antitoksin kuyu" olarak belirtilen) antitoksin ile örnek adı ( "örnek kuyu" olarak belirtilen) örnek adı ile kuyu etiketleyin.
    2. Bu test için gerekli antitoksin miktarını hesaplayın. NOT: antitoksin 25x stokihtiyacı Çözelti 1 x PBS içinde 1:25 seyreltilir. buz üzerinde hazırlanan antitoksin 1x çözüm yerleştirin.
    3. Için "örnek kuyu," iyi ki numunenin tüm yoğunluktaki (10 -1 -6 10) her 1x PBS 20 ul ekleyin. Için "antitoksin kuyuları," iyi ki numunenin tüm yoğunluktaki (10 -1 6 ila 10) her 1x antitoksin 20 ul ekleyin.
    4. 6 ve satır 7 - - satırlar 1 DP # 2 belirlenmiş kuyu içine DP # 1 kuyularda Transferi seyreltilmiş örnek 20 ul 12 (Vero hücre çalışma sayfası DP 2. düzeni bakınız). Yukarı ve aşağı pipetleme hafifçe çözüm karıştırın.
    5. berrak bir plastik yapıştırıcı conta DP 2. Kapak ve oda sıcaklığında inkübasyon 40 dakika izin verir. Bu inkübasyon antitoksini bağlanan ve bu şekilde etkisiz hale ve C. difficile toksinler için sağlamaktır.
    6. İnkübasyondan sonra, (uygun Vero hücre kuyulara DP 2. karışımın 10 ul V Vero hücre plaka taslağına bkzero Hücre Çalışma). Yavaşça kuyuların alt yüzeye yapışık Vero hücreleri bozmayacak özen aşağı yukarı pipetleme çözüm karıştırın.
    7. 37 ° C'de bir hücre kültür inkübatörü içinde bir gece boyunca Vero hücre plakası inkübe ve% 5 CO2.
  8. Işık Mikroskobu kullanılarak Yuvarlama için Vero Hücreleri değerlendirin (2 gün)
    NOT: Vero hücre plakasına örnek karışımlar eklerken 10 faktör ile sulandırma faktörü değişiklikleri (örneğin, 10 -3 şimdi 10 -4 olduğunu) olduğunu hatırlayın. Mevcut antitoksin olan kuyu hiçbir Vero hücre yuvarlama az dikkat olmalıdır. Vero hücre yuvarlama (sitotoksisite) C. difficile toksin içermeyen örneklerde dikkat edilecektir. Sitotoksik aktivitesi örnek ve antitoksin ihtiva eden bir seyreltme nötralize ise, Vero hücre sitotoksisite elde C. difficile toksin varlığı onaylandı.
    1. Bir ligh kullanılarak Vero hücre yuvarlama için incelenmesi200X büyütmede t mikroskop. (Pozitif kontrol dahil) numune kuyuları kaydetti% 80 Vero hücre yuvarlama için son bir kuyunun seyreltme kaydedin.
    2. numunenin gramı başına% 80 Vero hücre yuvarlama üretilen yüksek seyreltisinin karşılığı olarak tanımlanan sitotoksik titresi hesaplanır. Örneğin, en yüksek seyreltme sonra seyreltme faktörü bu örnek için 10 -6 olacaktır 10 -5 ise. Böylece, günlük [nihai seyreltme faktörü] / g örnek 6 karşılıklı titreye verir [10 6], log olacaktır.
      Not: - 4 geçit ve bu tahlilde 26 kullanımlarına en fazla 30 pasajlar önce Vero hücreleri gereken en az 3 uğramıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

temsili bir çalışma sırasında, 5 haftalık C57BL / 6 ağırlık fareleri 5 gün boyunca içme su (0.5 mg / ml) içinde Cefoperazone'un ile önceden işleme tabi tutulmuş ve 2 gün düzenli içme suyu ile yıkayın izin verildi. Farelere 0. günde (Şekil 1A) oral gavaj yoluyla C. difficile R20291 10 5 sporları ile tehdit edildi. Fareler 14 gün boyunca CDI kilo kaybı ve klinik bulgular (uyuşukluk, iştahsızlık, ishal ve kambur duruş) için izlenmiştir. C. difficile R20291 sporlarla C57BL / 6 WT farelerin meydan 24 saat ve 48 saat sonrası meydan (Şekil 1B) içinde önemli kilo kaybı içinde ishal sonuçlandı. Bu deneyde gözlenen olmasa da, C. difficile R20291 daha yüksek bir doz ile meydan fareler ağır hasta olabilir veya 48 ile% 20'den daha fazla kilo kaybı varsa - bu nedenle insani ötenazi gerektiren, 72 saat sonrası meydan. Bu nedenle, fare günde iki kez en az gerektirenC. difficile sporları ile mücadeleden sonra izlenmesi.

7 sonrası meydan (Şekil 1B) - Bu temsilci çalışmada, kilo kaybı ve farelerde hastalığın klinik belirtileri önemli bir miktarı da gün 2 gözlendi. 7 gün sonrası meydan at, fareler kilo başladı ve hastalığın klinik belirtileri yatışmış. Deneyin son haftasında, fareler ishal dahil olmak üzere CDI klinik belirtileri, hiçbir kanıt ile, klinik olarak normal göründü.

Fekal pelet önce C. difficile sporları ile meydan ve her 48 saat sonrası meydan (Şekil 1C) için toplandı. Antibiyotik tedavisinin öncesinde, fareler C. difficile ile kolonize değildi. C. difficile sporları ile 24 saat sonrası meydan içinde, fareler dışkı gramı C. difficile 10 7 CFU (Şekil 1C <ile kolonize edildi/ Strong> '). Fareler ısrarla denemenin son 7 gün kilo kaybı ya da CDI klinik belirtileri hiçbir kanıtlara rağmen, deney boyunca C. difficile ile kolonize kaldı.

Şekil 1
Şekil 1: C. difficile R20291 Sergi Kilo Kaybı ile Engelliler ve C. difficile ile kolonize olan Sefaperazon Tedavi fareler. A) 5-haftalık C57BL / 6 ağırlık JAX fare (n = 3 m / grup başına 3F) 5 gün boyunca içme su (0.5 mg / ml) içinde Cefoperazone'un ile önceden muamele edilmiş ve 2 günlük normal içme ile yıkayın İzin Su. Fareler 0. Fareler 14 gün boyunca CDI kilo kaybı ve klinik işaretler (uyuşukluk, iştahsızlık, ishal ve kambur duruş) takip edildi gün oral gavaj yoluyla C. difficile R20291 10 5 sporları ile tehdit edildi. Dışkı hemen afte, önceki sefoperazon başlamadan toplanır ve bakteri sayımı için kullanılanR antibiyotik bitirme ve 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 13, ve enfeksiyon süresince 14. Otopsi farenin C. difficile R20291 ile yüklemeden sonra, başlangıç ağırlığının önemli miktarda kayıp) 0, 2, 4, 7 üzerinde yapılan, ve 14 B idi. 0. günde, başlangıç ​​ağırlığına göre farelerin ortalama vücut ağırlığı ile 7 0. Önemli kilo kaybı günlerde 2 görüldü günden itibaren günlük olarak ölçüldü. Mücadeleden sonra dışkı C) C. difficile R20291 bakteriyel yük. C. difficile sporlarla mücadeleden sonra 24 saat içinde, bütün fareler dışkıların gramı başına 10 7 CFU (koloni oluşturucu birimler) ile kolonize edildi. bu parametrelerde anlamlı bir fark kadın ve erkeklerin arasında görüldü. Önemi Dunn sontest (izledi parametrik olmayan Kruskal-Wallis tek yönlü ANOVA testi ile belirlendi * p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.01; *** p ≤ 0.001; ****, p Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Dört fare (2 erkek, 2 kadın) dikkatli biçimde öldürüldü ve benzeri gibi enfekte olmamış kontrol olarak hizmet etmek için, enfeksiyon öncesi, 0. günde otopsi için hazırlandı. Buna ek olarak, her bir kafesten bir fare dikkatli biçimde öldürüldü ve gün 2, 4, 7 nekropsi için hazırlanan ve 14 Yükleme sonrası (Şekil 1A). Çekal içeriğinde C. difficile numaralandırma her nekropsi yapıldı. Fekal numaralandırma ile uyumlu, hiçbir C. difficile önce C. difficile ile meydan farelerin çekal içeriği tespit edildi. 48 saat sonrası meydan at, fareler çekal içeriği gramı C. difficile yaklaşık 10 8 CFU ile kolonize edildi (ŞekilŞekil 2A). Tüm fareler deney boyunca sürekli kolonize kalmıştır.

Çekal içeriği de Vero hücre sitotoksisite deneyi kullanılarak C. difficile toksin varlığı için enfeksiyon boyunca değerlendirildi. C. difficile toksin sitotoksisite hiçbir kanıt meydan (Şekil 2B) öncesinde cecal içerikleri tespit edildi. C. difficile sitotoksisite 2 gün C. difficile sporları ile mücadeleden sonra algılanır ve enfeksiyon boyunca devam edildi. C. difficile ile oldukça düzgün kolonizasyon rağmen, C. difficile sitotoksik aktivite seviyelerinin varyasyonu Farelerin bireysel (Şekil 2B) belirgindir.

Vero hücre sitotoksisite deneyi sırasında C. difficile antitoksin ile nötralize fare çekal içeriğinin çoğunluğu ve sitotoksisite hiçbir kanıt yoktu (Vero cegerçekleştirilen dilüsyonlar) yuvarlama ll. Diğer dilüsyonlarda yuvarlama Vero hücre hiçbir kanıt, 10 -1 seyreltme (örnek en yoğun olduğu seyreltme)% 100 sitotoksisite - Ancak, birkaç bireysel fareler, yeniden test rağmen, 50 kanıtlar vardı. Bu deneyde kullanılan antitoksin keçi 27 hazırlanan C. difficile toksin nötralize edici bir poliklonal antikordur. Bu nedenle, bu antitoksin suşu R20291 tarafından üretilen C. difficile ikili toksini nötralize olmayabilir. Ancak, C. difficile ikili toksin 10 sitotoksik olarak kabul edilmez. Antitoksin veya C. difficile toksin Bu bulguya katkıda olabilir başka bir sitotoksik maddenin varlığı ile nötralize edilmesi Aşırı C. difficile toksin yapamaz. % 80 Vero hücre yuvarlama her numunenin son seyreltme beri Bu gözlem, bu örnekler için sitotoksisite titre belirlenmesini etkilemedisitotoksisite hiçbir kanıt Belirtilen seyreltme de antitoksin ile birlikte.

şekil 2
Şekil 2: C Enfeksiyon sırasında çekum ve Sitotoksitenin Kolonizasyon. difficile R20291. A) Fare ceca ısrarla klinik belirtilerin çözünürlük ve gözlenen kilo artışı olmasına rağmen, deney boyunca C. difficile ile kolonize kaldı. 2 gün sonrası meydan değerlendirildi zaman tüm fareler cecal içeriğinin gramı başına daha fazla 10 8 CFU ile kolonize edildi. C enfeksiyonu boyunca çekal içerikten B) Vero hücre sitotoksisite deneyi. difficile R20291. Günde 2, 4 çekal içeriğin gramı başına toksin log10 karşılıklı seyreltme ölçülen ve 7 Yükleme sonrası 0. günle karşılaştırıldığında C. difficile sporlarla cebine takiben fareler ortanca represente (sitotoksisite önemli düzeyleri) Çizgi ile d. ** P ≤ 0.01;, *** p ≤ 0.001; ****, p ≤ 0.0001 Önemi Dunn sontest (* p ≤ 0.05 takiben non-parametrik Kruskal-Wallis tek yönlü ANOVA testi ile belirlendi ). Hata çubukları, ortalamanın standart sapmaları temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Histolojik değerlendirme kör bir şekilde bir kurul sertifikalı veteriner patolog tarafından yürütülen tavsiye edilir. Doku puanlama için, bir 0-4 sayısal skorlama sistemi ayrı bir önceden yayınlanmış puanlama şeması 17 dayalı ileum, çekum ve kolonda ödem, inflamatuar hücre infiltrasyonu ve epitel hücre hasarı değerlendirmek için istihdam edilmelidir.

kör histopatolojik sınav üzerineC. difficile R20291 ile fare ileum, çekum ve kolon aşağıdaki meydan biçimde uygulanması, en önemli patolojik değişiklikler çekum (Şekil 3) kaydedildi. toplam çekal histolojik skorlar gün 0 ve Gün 2 ve 4 sonrası meydan arasında anlamlı farklılık gösterdi. Anlamlı lezyonlar enfeksiyon boyunca ileum (Şekil 3) kaydedildi. Daha hafif lezyonlar kolonda kaydedildi. Toplam kolon histolojik skorları gün 0 ve gün 2 ve 7 hücumdan (Şekil 3) arasında anlamlı bir farklılık vardı.

Enfeksiyon boyunca ileum, çekum ve kolon Temsilcisi H & E bölümleri kör kurul sertifikalı veteriner patolog tarafından belirlenen Her görüntü, ilgili toplam histolojik skor ve epitel hasarı, inflamasyon ve ödem için bireysel puanlar vardır Şekil 4'te mevcuttur ( SAM).


C Enfeksiyon sırasında Fare ileum, çekum histolojik Puanlama ve Kolon: Şekil 3. difficile R20291. epitel hasarı, inflamasyon ve ödem: Toplam histolojik skorları değerlendirildi parametrelerden her üç puan eklenerek hesaplandı. Anlamlı histopatolojik değişiklikler enfeksiyon boyunca ileumda kaydedildi. Çekal doku CDI sırasında en önemli histolojik lezyonlar içeriyordu. toplam çekal histolojik skor gün 2 ve 4 post-meydan günden 0 anlamlı olarak farklı idi. Daha hafif lezyonlar kolonda kaydedildi. toplam kolon histolojik skor gün 2 ve 7 post-meydan günden 0 anlamlı olarak farklı idi. Önemi Dunn sontest (izledi parametrik olmayan Kruskal-Wallis tek yönlü ANOVA testi ile belirlendi * p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.01; *** p804; 0.001; **** P ≤ 0.0001). Hata çubukları, ortalamanın standart sapmaları temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4: C Enfeksiyon sırasında Histopatoloji. difficile R20291. Bu panel C. difficile R20291 ile enfeksiyon boyunca ileum, çekum ve kolon temsilcisi H & E bölümleri içerir. toplam histolojik skorları ilgili gün ve listelenen doku parantez () şunlardır: ileum gün 0 (0), günde 2 (1), gün 4 (0), gün 7 (0), ve gün 14 (0) ; çekum 0. günde (0), 2. gün (5), günde 4 (4), gün 7 (3) ve 14. günde (3); ve kolon 0. günde (0), gün 2 (4), günde 4 (1), gün 7 (4) ve 14. günde (2). Fotomikrografları hafif bir mikroskop elde edilmiştir5 megapiksel dijital kamera ve ona eşlik eden yazılımı ile e (ölçek çubuğu 200 mikron gösterir). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner  SSS Navigator 48027 This product will require dilution as recommended by the manufacturer
0.22 μm filter Fisherbrand 09-720-3 Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
0.4% Trypan Blue Gibco 15250-061
1% Peniciilin/Streptomycin Gibco 15070-063
10% heat inactivated FBS Gibco 16140-071 Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
1 ml plastic syringe  BD Medical Supplies 309628
1x PBS Gibco 10010-023
2 ml Micro Centrifuge Screw Cap Corning 430917
96 well cell culture flat bottom plate Costar Corning CL3595
96 well filter plate Millipore MSGVS2210
Adhesive Seal ThermoScientific AB-0558
Bacto Agar Becton Dickinson 214010 Part of TCCFA plates (see below)
Bacto Proteose Peptone Becton Dickinson 211684 Part of TCCFA plates (see below)
Cefoperazone MP Bioworks 199695
Cefoxitine Sigma C47856 Part of TCCFA plates (see below)
Clostridium difficile Antitoxin Kit Tech Labs T5000 Used as control for Vero Cell Assay
Clostridium difficile Toxin A List Biological Labs 152C Positive control for Vero Cell Assay
D-cycloserine Sigma C6880 Part of TCCFA plates (see below)
Distilled Water Gibco 15230
DMEM 1x Media Gibco 11965-092 Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
Fructose Fisher L95500 Part of TCCFA plates (see below)
Hemocytometer Bright-Line, Sigma Z359629
KH2PO4 Fisher P285-500 Part of TCCFA plates (see below)
MgSO4 (anhydrous) Sigma M2643 Part of TCCFA plates (see below)
Millex-GS 0.22 μm filter Millex-GS SLGS033SS Filter for TCCFA plates 
Na2HPO4 Sigma S-0876 Part of TCCFA plates (see below)
NaCl Fisher S640-3 Part of TCCFA plates (see below)
Number 10 disposable scalpel blade Miltex, Inc 4-410
PCR Plates Fisherbrand 14230244
Plastic petri dish Kord-Valmark Brand 2900
Sterile plastic L-shaped cell spreader Fisherbrand 14-665-230
Syringe Stepper Dymax Corporation T15469
Taurocholate Sigma T4009 Part of TCCFA plates (see below)
Ultrapure distilled water Invitrogen 10977-015
C57BL/6J Mice The Jackson Laboratory 664 Mice should be 5 - 8 weeks of age
Olympus BX43F light microscope Olympus Life Science
DP27 camera Olympus Life Science
cellSens Dimension software  Olympus Life Science

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Antibiotic Resistance Threats in the United States. U.S.D.o.H.a.H. Services. Available from: http://www.cdc.gov/drugresistance/pdf/ar-threats-2013-508.pdf (2013).
  2. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile Infection in the United States. New England Journal of Medicine. 372, 825-834 (2015).
  3. Gerding, D. N., Lessa, F. C. The epidemiology of Clostridium difficile infection inside and outside health care institutions. Infect Dis Clin North Am. 29, 37-50 (2015).
  4. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55, Suppl 2 88-92 (2012).
  5. Kociolek, L. K., Gerding, D. N. Breakthroughs in the treatment and prevention of Clostridium difficile infection. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. (2016).
  6. Kelly, C. P., LaMont, J. T. Clostridium difficile--more difficult than ever. N Engl J Med. 359, 1932-1940 (2008).
  7. Louie, T. J., et al. Fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection. N Engl J Med. 364, 422-431 (2011).
  8. Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L., Kasper, D. L. Clindamycin-associated colitis due to a toxin-producing species of Clostridium in hamsters. The Journal of infectious diseases. 136, 701-705 (1977).
  9. Kelly, M. L., et al. Improving the reproducibility of the NAP1/B1/027 epidemic strain R20291 in the hamster model of infection. Anaerobe. (2016).
  10. Kuehne, S. A., et al. Importance of toxin A, toxin B, and CDT in virulence of an epidemic Clostridium difficile strain. The Journal of infectious diseases. 209, 83-86 (2014).
  11. Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L. Clindamycin-associated colitis in hamsters: protection with vancomycin. Gastroenterology. 73, 772-776 (1977).
  12. Chen, X., et al. A mouse model of Clostridium difficile-associated disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
  13. Lawley, T. D., Young, V. B. Murine models to study Clostridium difficile infection and transmission. Anaerobe. 24, 94-97 (2013).
  14. Best, E. L., Freeman, J., Wilcox, M. H. Models for the study of Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 3, 145-167 (2012).
  15. Reeves, A. E., et al. The interplay between microbiome dynamics and pathogen dynamics in a murine model of Clostridium difficile Infection. Gut Microbes. 2, 145-158 (2014).
  16. Owens, R. C., Donskey, C. J., Gaynes, R. P., Loo, V. G., Muto, C. A. Antimicrobial-associated risk factors for Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 46, Suppl 1 19-31 (2008).
  17. Theriot, C. M., et al. Cefoperazone-treated mice as an experimental platform to assess differential virulence of Clostridium difficile strains. Gut Microbes. 2, 326-334 (2011).
  18. Martin, J. S., Monaghan, T. M., Wilcox, M. H. Clostridium difficile infection: epidemiology, diagnosis and understanding transmission. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. (2016).
  19. Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology. 136, 1913-1924 (2009).
  20. He, M., et al. Emergence and global spread of epidemic healthcare-associated Clostridium difficile. Nat Genet. 45, 109-113 (2013).
  21. Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. Journal of AOAC International. 94, 618-626 (2011).
  22. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. Chapter 9, Unit9A.1 (2009).
  23. Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. Journal of visualized experiments : JoVE. e50787 (2013).
  24. George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J Clin Microbiol. 9, 214-219 (1979).
  25. Knoblaugh, S., Randolph-Habecker, J., Rath, S. Comparative Anatomy and Histology. Dintzis, S. M. Academic Press. 15-40 (2012).
  26. Ammerman, N. C., Beier-Sexton, M., Azad, A. F. Growth and maintenance of Vero cell lines. Curr Protoc Microbiol. Appendix 4, Appendix 4E (2008).
  27. Clostridium difficile Toxin/Antitoxin Kit Cat No.T5000. TECHLAB. Available from: http://www.techlab.com/wp-content/uploads/2013/06/t5000isert_rev_0307.pdf (2007).
  28. Theriot, C. M., et al. Antibiotic-induced shifts in the mouse gut microbiome and metabolome increase susceptibility to Clostridium difficile infection. Nat Commun. 5, 3114 (2014).
  29. Koenigsknecht, M. J., et al. Dynamics and establishment of Clostridium difficile infection in the murine gastrointestinal tract. Infect Immun. 83, 934-941 (2015).
  30. Theriot, C., Bowman, A., Young, V. Antibiotic-Induced Alterations of the Gut Microbiota Alter Secondary Bile Acid Production and Allow for Clostridium difficile Spore Germination and Outgrowth in the Large Intestine. mSphere. 1, 00045 (2016).
  31. Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature biotechnology. 33, 1103-1108 (2015).
  32. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
  33. Stabler, R. A., et al. Comparative genome and phenotypic analysis of Clostridium difficile 027 strains provides insight into the evolution of a hypervirulent bacterium. Genome Biol. 10, 102 (2009).
  34. Valiente, E., Dawson, L. F., Cairns, M. D., Stabler, R. A., Wren, B. W. Emergence of new PCR ribotypes from the hypervirulent Clostridium difficile 027 lineage. J Med Microbiol. 61, 49-56 (2012).
ve Cefoperazone-tedavi edilmiş fare modeli klinik olarak ilgili<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Gerilme R20291
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Winston, J. A., Thanissery, R., Montgomery, S. A., Theriot, C. M. Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291. J. Vis. Exp. (118), e54850, doi:10.3791/54850 (2016).More

Winston, J. A., Thanissery, R., Montgomery, S. A., Theriot, C. M. Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291. J. Vis. Exp. (118), e54850, doi:10.3791/54850 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter