لقد قمنا بتصميم جهاز زراعة المستمر للاستخدام مع أنظمة علم البصريات الوراثي لتسليط الضوء على ثقافات الميكروبات والخلايا بانتظام صورة في النفايات السائلة مع مجهر مقلوب. ومؤتمتة للزراعة، وأخذ العينات، والتصوير، وتحليل الصور بشكل كامل بحيث يمكن قياس الاستجابات الحيوية إلى الإضاءة على مدى عدة أيام.
نظم علم البصريات الوراثي تستخدم البروتينات المشفرة وراثيا التي تغير التشكل ردا على موجات محددة من الضوء على تغيير العمليات الخلوية. هناك حاجة لزراعة وقياس الأنظمة التي تدمج برمجة الإضاءة والتحفيز من أنظمة علم البصريات الوراثي. نقدم بروتوكول لبناء واستخدام جهاز زراعة المستمر لتسليط الضوء على الخلايا الميكروبية بجرعات المبرمجة للضوء، وتلقائيا اكتساب وتحليل الصور من الخلايا في النفايات السائلة. تشغيل هذا الجهاز باعتباره ناظم كيميائي تسمح معدل النمو والبيئة الخلوية إلى أن رقابة مشددة. وأخذ عينات بانتظام النفايات السائلة للثقافة الخلية مستمرة ويتم تصوير الخلايا عن طريق قنوات متعددة المجهر. ومؤتمتة للزراعة، وأخذ العينات، والتصوير، وتحليل الصور بشكل كامل بحيث يتم قياس ردود ديناميكية في كثافة مضان والتشكل الخلوي للخلايا عينات من النفايات السائلة الثقافة على مدى عدة أيامدون تدخل من المستخدم. ونحن لشرح فائدة جهاز زراعة هذا عن طريق حفز إنتاج بروتين حيوي في سلالة من خميرة الخباز هندسيا مع نظام علم البصريات الوراثي الذي ينشط النسخ.
نظم علم البصريات الوراثي استخدام ضوء للتحكم في قائمة متزايدة من العمليات الخلوية بما في ذلك التعبير الجيني، 1، 2، 3، 4، 5 توطين البروتين، والنشاط 6 البروتين، 6، 7، 8 بروتين ملزمة و 8 و 9 و 10 و تدهور البروتين. 11 طريقة لزراعة الخلايا في بيئة تسيطر عليها مع التحفيز الضوئي المبرمج ولقياس رد فعلهم على امتداد فترات زمنية ذات الصلة بيولوجيا ضروري لاستغلال إمكانات هذه الأدوات للبحث في بيولوجيا الخلية والتكنولوجيا الحيوية. يأخذ طريقة لدينا ميزة chemostasis للحفاظ على معدل نمو الخلايا مستمر في إعادة خلط جيدا، عبد اللطيفمصنفة، والتحكم في درجة حرارته عاء زجاجي زراعة 12 و 13 التي تتعرض للإضاءة مبرمجة. نحن صورة الخلايا الفردية في النفايات السائلة الثقافة مع مجهر مقلوب لقياس استجابة للثقافة لإضاءة مبرمجة. هي الآلية للزراعة، وأخذ العينات، والتصوير، وتحليل الصور بشكل كامل بحيث يمكن قياس كثافة مضان والتشكل الخلوي للخلية ثقافة النفايات السائلة خلال عدة أيام دون تدخل من المستخدم.
هذا البروتوكول يمكن تنفيذها في معظم المختبرات مألوفة مع زراعة الخلايا النمو والفحص المجهري، وجهاز يستخدم غير مكلفة ومصنوعة من مكونات متوفرة بسهولة. يتم وضع السفينة زراعة شفافة فوق مصفوفة من الثنائيات الباعثة للضوء (المصابيح) قادرة على انبعاث 1 مللي واط / سم 2 -10 ميغاواط / سم 2 للضوء. تزرع الميكروبات في السفينة زراعة باستمرار؛ يستخدم مضخة تحوي واحدة لإضافة وسائل الإعلام فيمعدل التخفيف، يتم استخدام آخر لسحب الثقافة بمعدل أقل لالمجهر، والفرق يهرب من خلال منفذ تجاوز. تحتفظ وسادة التدفئة في درجات الحرارة. يتم ضخ الهواء باستمرار في الإناء زراعة للحفاظ على الضغط إيجابية، وكذلك لخلط وتهوية الثقافة. باستثناء مضخة الهواء، وينظم السلطة لهذه الأجهزة من قبل متحكم الذي يتلقى أيضا المدخلات من الحرارة وجهاز كمبيوتر سطح المكتب المتصل. يتم ضخ ثقافة الخلية النفايات السائلة إلى جهاز ميكروفلويديك على مرحلة مجهر مقلوب. واستحوذت غير الفلورسنت والصور الفلورسنت تلقائيا. وتتميز الخلايا في الصور عن طريق خوارزمية التي يقع كل خلية كمنطقة ذات الاهتمام (ROI) ويقيس خصائص كل العائد على الاستثمار.
لإثبات وجود تطبيق هذا البروتوكول، ونحن قياس استجابة لتفاوت شدة الضوء من خلايا خميرة الخباز هندسيا مع responsi زرقاء ضوءلقد نظام علم البصريات الوراثي التي تسيطر على نسخ من البروتين الفلوري. البيرة س، المعروف باسم خميرة الخباز تم اختيار، لأن النظم علم البصريات الوراثي متعددة للتحكم في التعبير الجيني في هذا النظام موجودة بالفعل 14، 15، 16. وعلاوة على ذلك، يتم استخدام هذا نموذج حي عادة للدراسات في نظم البيولوجيا 17 وكما هيكل لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية 18، 19، 20. تظهر لنا نتائج ممثل أن هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم للسيطرة النسخ ثقافة على مدى عدة أيام من خلال تغيير شدة الضوء المدخلات وقياس إنتاج مراسل الفلورسنت.
لقد قمنا بتصميم هذا الجهاز مع المرونة في الاعتبار. جميع الرموز المستخدمة مجاني ومفتوح المصدر. عملية تحليل الصورة الافتراضية إلى خلايا جزء بسيط ويعمل بسرعة. يمكن تنفيذ تحليل مخصصة عن طريق تسجيل مدخلات المستخدم أثناء تحليل صورة تمثيلية مع واجهة المستخدم الرسومية في ف?…
The authors have nothing to disclose.
ونود أن نعترف مولي لازار وفيرونيكا دلغادو للمساعدة في اختبار البروتوكول، كيران سويني لإجراء مناقشات مفيدة والتحرير، وتايلور سكوت يا أحد، adirekkun، وستيفاني جيلر لقراءة نقدية للمخطوطة. ميغان نيكول ماكلين، دكتوراه حاصل على جائزة شهادة في واجهة العلم من صندوق ويلكوم بوروز.
Extensive lab manual | GitHub | NA | An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results. |
Fritzing Design Viewer | Fritzing | NA | The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/" |
Arduino Uno R3 (Atmega328 – assembled) | Adafruit | 50 | Microcontroller. 1 required. |
Arduino Stackable Header Kit | SparkFun Electronics | 10007 | Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required. |
Adjustable 30W 110V soldering iron – XY-258 110V | Adafruit | 180 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
Soldering iron stand | Adafruit | 150 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
Mini Solder spool – 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter – 100g | Adafruit | 145 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
0.1 μF capacitor | SparkFun Electronics | COM-08375 | Stabilizes voltage in PCB. 1 required. |
10 μF capacitor | SparkFun Electronics | COM-00523 | Stabilizes voltage in PCB. 1 required. |
MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver – MAX7219 | Maxim | MAX7219CNG | LED driver. 1 required. |
8 pin IC Socket | Mouser Electronics | 575-144308 | 16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix. |
24 Pin IC socket | Mouser Electronics | 535-24-3518-10 | Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB. |
Digital multimeter | Adafruit | 2034 | For troubleshooting electronics. 1 required. |
Break Away Headers – 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1") | SparkFun Electronics | PRT-12693 | Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required. |
Flush diagonal wire cutters | Adafruit | 152 | For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required. |
Premium Female/Female Jumper Wires – 40 x 12" (300mm) | Adafruit | 793 | Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required. |
Half-size breadboard | Adafruit | 64 | The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it. |
Miniature 8×8 Blue LED Matrix | Adafruit | 956 | Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white. |
Stackable header-3 pin | SparkFun Electronics | 13875 | 8 required. |
Resistor Kit – 1/4W (500 total) | SparkFun Electronics | 10969 | For electronics. 1 required. |
IRL520N MOSFET | International Rectifier | IRL520N | Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required. |
Hook-Up Wire – Assortment (Solid Core, 22 AWG) | SparkFun Electronics | PRT 11367 | Wire for electronics. 1 required. |
5V 2A (2000mA) switching power supply – UL Listed | Adafruit | 276 | Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required. |
12 VDC 1000mA regulated switching power adapter – UL listed | Adafruit | 798 | For peristaltic pumps. 2 required. |
Electric Heating Pad – 10cm x 5cm | Adafruit | 1481 | For heating the bioreactor. 1 required. |
Low flow variable flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 13-876-1 | For pumping media. 1 required |
Medium flow variable flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | For pumping culture. 1 required. |
9 VDC 1000mA regulated switching power adapter – UL listed | Adafruit | 63 | For microcontroller power supply. Order 1. |
High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras | Adafruit | 642 | Thermometer for the bioreactor. 1 required. |
Micromanager | Micromanager | NA | The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release" |
FIJI | ImageJ | NA | The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/" |
Arduino Integrated Development Environment | Arduino | NA | The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software" |
Custom code | GitHub | NA | The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
USB Cable A to B – 6 Foot | SparkFun Electronics | CAB-00512 | Used to download data to microcontroller. 1 required. |
bioreactorTimecourse_example.csv | GitHub | NA | The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
Tota-frost gels (diffusion paper) | B&H | B&H # LOFSFTL MFR # T1-72 |
For LED matrix. 1 required. |
Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in | Grainger, inc | 20JL37 | Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required. |
Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 – 1100 nm, 50 mW | Thorlabs | S120VC | For measuring light intensity. 1 required. |
Labelling Tape | Fisher Scientific | 159015N | For labelling and securing loose components. 1 required. |
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | For measuring light intensity. 1 required. |
100mL GL45 hybridization glass bottle | Bellco Glass, Inc. | (7910-40150) | Bioreactor vessel. 1 required. |
Six port assembly | Bellco Glass, Inc. | Custom | For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125" OD x .055"ID. Port A: 1.0" long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0" long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0" long above cap slug, 65 mm long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel. |
Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3 | Amazon | B0009F3P3U | Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame. |
1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing | United States Plastic Corp. | 57288 | Tubing. ~25' required. |
Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10 | Cole-Parmer | EW-62992-32 | Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required. |
2L Laboratory Flask | Pyrex | 4980 | Media flask and effluent flask. 2 required. |
Day pinchcock | Fisher Scientific | 5867 | For pinching tubes shut. 3 required. |
Replacement tubing assembly 1/16" ID | Traceable Products | 3372 | The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use. |
Replacement tubing assembly 1/50" ID | Traceable Products | 3371 | The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use. |
Male luer with lock ring x 1/16" hose barb, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-00 | Connectors. ~10 luers are required. |
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-04 | Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing. |
Female luer x 1/16" hose barb adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-00 | Connectors. ~10 luers required. |
Female luer x 3/16" hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45502-08 | Connectors. ~10 luers required. |
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | SC-45502-28 | |
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-56 | |
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | Tubing. 1 roll required. |
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft | Cole-Parmer | EW-96410-13 | Tubing. ~25' required. |
3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing | United States Plastic Corp. | 57293 | Tubing. ~1' required. |
Vacuum filter | Fisher Scientific | 974107 | Nalgene vacuum filter for sterile filtering media. |
Aquel Oxy-Boost 200 | Rena Aquatic Supply | AP200 | Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required. |
0.2 μm pore syringe filter | Corning International | 431229 | This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required. |
Slygard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Slygard 184 | For microfluidic device. 1 required. |
American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 17989000 | For cutting tubes and PDMS. 1 blade required. |
Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID | Sigma-Aldrich | WHAWB100028 ALDRICH | For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required. |
Microscope cover glass 22×60-1.5 | Fisher Scientific | 12-544-G | For microfluidic device. 1 required. |
Rectangular aluminum frame with a square window | Custom | Custom | To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches. Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches Thickness: ~1/32 inches |