Biz bir inverted mikroskop ile atık mikropların kültürler ve düzenli görüntü hücrelere aydınlatmak için Optogenetic sistemleri ile kullanım için sürekli bir kültür cihazı tasarlanmıştır. aydınlatma dinamik tepkiler birkaç gün içinde ölçülebilir, böylece kültür, örnekleme, görüntüleme ve görüntü analizi tam otomatik vardır.
Optogenetic sistemleri hücresel prosesleri değiştirebilir ve ışık spesifik dalga boylarında yanıt olarak şekil değiştirirler genetik olarak kodlanmış proteinleri kullanılmaktadır. Optogenetic sistemlerin aydınlatma ve stimülasyon programlanan kullanan sistemler kültürlenmesi ve ölçülmesi için bir ihtiyaç vardır. Biz bina ve ışık programlanmış dozlarda mikrobiyal hücrelerin aydınlatmak ve otomatik olarak kazanmak ve atık hücrelerin görüntülerini analiz etmek için sürekli bir kültür cihazı kullanılarak bir protokol mevcut. Bir kemostat bu düzeneğin çalışması büyüme ve hücre ortamı sıkı bir şekilde kontrol edilmesini sağlar. sürekli hücre kültürü atık düzenli örneklenmiş ve hücreler çok kanallı mikroskobu ile görüntülenmiş. floresan yoğunluğu ve kültür mahsulünden örneklenen hücrelerin hücresel morfoloji dinamik tepkiler birden fazla gün boyunca ölçülen böylece kültür, örnekleme, görüntüleme ve görüntü analizi tam otomatik olankullanıcı girişi olmadan. Dinamik olarak transkripsiyonu aktive bir Optogenetic sistemi ile işlenmiş, Saccharomyces cerevisiae protein üretimini indükleyen bu kültürleme cihazının kullanımını göstermektedir.
Optogenetic sistemleri gen ekspresyonu, 1, 2, 3, 4, 5 protein lokalizasyonu, 6 protein aktivitesini, 6, 7, 8 protein bağlama, 8, 9, 10 ve protein degradasyonunu da dahil olmak üzere hücresel süreçleri artan listesini kontrol etmek için ışık kullanır. Programlı optik stimülasyon ile kontrollü bir ortamda hücrelerin kültüre ve biyolojik ilgili zaman ölçekleri üzerindeki tepkisini ölçmek için 11 bir yöntem hücre biyolojisi ve biyoteknoloji araştırma için bu araçların potansiyelini gereklidir. Önerilen yöntem, AE, iyi karışmış sürekli bir hücre büyüme hızını sabitlemek için chemostasis yararlanırpuan ve programlanan aydınlatma maruz sıcaklık kontrollü cam kültürleme kabı 12, 13. bir inverted mikroskop ile kültür atık suyunda görsele tek tek hücreler programlanmış aydınlatma kültür tepkisini ölçmek için. floresan yoğunluğu ve atık hücre kültürünün hücresel morfoloji kullanıcı girişi olmadan birden fazla gün içinde ölçülebilir, böylece kültür, örnekleme, görüntüleme ve görüntü analizi tam otomatik vardır.
Bu protokol, büyüyen hücre kültürü ve mikroskopi aşina en laboratuvarlarında uygulanabilir ve kullanılan cihaz ucuz ve kolaylıkla temin edilebilen bileşenler yapılmıştır. Şeffaf bir kültürleme kabı ışık 1 uW / cm2 -10 mW / cm2 yayabilen ışık yayan diyotlar (LED), bir matris üzerine yerleştirilir. Mikroplar sürekli kültür kabında yetiştirilir; bir peristaltik pompa de medya eklemek için kullanılırseyrelme oranı, bir mikroskop daha az bir oranda kültür çekmek için kullanılır ve fark, taşma çıkışı kaçar. Bir ısıtma yastığı sıcaklığını koruyor. Hava sürekli pozitif basıncı muhafaza etmek ve karıştırmak ve havalandırmak için kültür kültür kabına pompalanır. Hava pompası dışında, bu cihazlar için güç aynı zamanda bir termometre ve bağlı masaüstü bilgisayardan giriş alır bir mikro denetleyici tarafından düzenlenir. atık hücre kültürü ters bir mikroskop sahnede bir mikroakışkan cihaz pompalanır. Floresan olmayan ve floresan görüntüler otomatik olarak elde edilir. Görüntülerde hücreler ilgi (ROI) bir bölge olarak her bir hücreyi bulur ve her ROI özelliklerini ölçen bir algoritma ile karakterizedir.
Bu protokolün bir uygulama göstermek için, bir mavi ışık responsi ile mühendislik Saccharomyces cerevisiae hücreleri değişen ışık şiddetlerinde yanıt ölçülenfloresan protein transkripsiyonunu kontrol eden Optogenetic Sistemi. Bu sistemde gen ekspresyonunu kontrol etmek için çok sayıda Optogenetic sistemleri zaten 14, 15, 16 bulunduğu için yaygın olarak ekmek mayası olarak bilinen, S. cerevisiae, seçilmiştir. Bundan başka, bu model organizma yaygın sistem biyolojisi 17 ve biyo teknolojik uygulamalarda 18, 19, 20 için bir şasi gibi çalışmaları için kullanılır. Bizim Örnek Sonuçlar Bu protokol, giriş ışık değişen yoğunluklarda ve flüoresan raportör üretimini ölçerek çok gün boyunca kültürü transkripsiyonunu kontrol etmek için kullanılabileceğini gösterir.
Biz esneklik düşünülerek bu cihazı tasarladı. Kullanılan tüm kod ücretsiz ve açık kaynak. Segment hücrelere varsayılan görüntü analizi süreci basit ve hızlı bir şekilde çalışır. Özel analizi, FIJI grafik kullanıcı arayüzü ile temsili bir görüntüsünü analiz eden bir Beanshell komut girişini dönüştürme ve sonra komut dosyasını çağırmak için eklenti ayarlarken kullanıcı girişi kayıt ile uygulanabilir. o çağrıldığında, bu komut arka plan çıkarılır görüntülerin en…
The authors have nothing to disclose.
Biz yararlı tartışmalar ve düzenleme için protokol, Kieran Sweeney test yardım için Molly Lazar ve Verónica Delgado kabul etmek ister ve yazının eleştirel okuma Taylor Scott, My An-adirekkun ve Stephanie Geller olacaktır. Megan Nicole McClean, Ph.D. Burroughs Wellcome Fonu Bilimsel Arayüz bir Kariyer Ödülü sahibidir.
Extensive lab manual | GitHub | NA | An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results. |
Fritzing Design Viewer | Fritzing | NA | The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/" |
Arduino Uno R3 (Atmega328 – assembled) | Adafruit | 50 | Microcontroller. 1 required. |
Arduino Stackable Header Kit | SparkFun Electronics | 10007 | Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required. |
Adjustable 30W 110V soldering iron – XY-258 110V | Adafruit | 180 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
Soldering iron stand | Adafruit | 150 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
Mini Solder spool – 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter – 100g | Adafruit | 145 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
0.1 μF capacitor | SparkFun Electronics | COM-08375 | Stabilizes voltage in PCB. 1 required. |
10 μF capacitor | SparkFun Electronics | COM-00523 | Stabilizes voltage in PCB. 1 required. |
MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver – MAX7219 | Maxim | MAX7219CNG | LED driver. 1 required. |
8 pin IC Socket | Mouser Electronics | 575-144308 | 16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix. |
24 Pin IC socket | Mouser Electronics | 535-24-3518-10 | Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB. |
Digital multimeter | Adafruit | 2034 | For troubleshooting electronics. 1 required. |
Break Away Headers – 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1") | SparkFun Electronics | PRT-12693 | Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required. |
Flush diagonal wire cutters | Adafruit | 152 | For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required. |
Premium Female/Female Jumper Wires – 40 x 12" (300mm) | Adafruit | 793 | Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required. |
Half-size breadboard | Adafruit | 64 | The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it. |
Miniature 8×8 Blue LED Matrix | Adafruit | 956 | Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white. |
Stackable header-3 pin | SparkFun Electronics | 13875 | 8 required. |
Resistor Kit – 1/4W (500 total) | SparkFun Electronics | 10969 | For electronics. 1 required. |
IRL520N MOSFET | International Rectifier | IRL520N | Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required. |
Hook-Up Wire – Assortment (Solid Core, 22 AWG) | SparkFun Electronics | PRT 11367 | Wire for electronics. 1 required. |
5V 2A (2000mA) switching power supply – UL Listed | Adafruit | 276 | Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required. |
12 VDC 1000mA regulated switching power adapter – UL listed | Adafruit | 798 | For peristaltic pumps. 2 required. |
Electric Heating Pad – 10cm x 5cm | Adafruit | 1481 | For heating the bioreactor. 1 required. |
Low flow variable flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 13-876-1 | For pumping media. 1 required |
Medium flow variable flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | For pumping culture. 1 required. |
9 VDC 1000mA regulated switching power adapter – UL listed | Adafruit | 63 | For microcontroller power supply. Order 1. |
High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras | Adafruit | 642 | Thermometer for the bioreactor. 1 required. |
Micromanager | Micromanager | NA | The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release" |
FIJI | ImageJ | NA | The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/" |
Arduino Integrated Development Environment | Arduino | NA | The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software" |
Custom code | GitHub | NA | The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
USB Cable A to B – 6 Foot | SparkFun Electronics | CAB-00512 | Used to download data to microcontroller. 1 required. |
bioreactorTimecourse_example.csv | GitHub | NA | The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
Tota-frost gels (diffusion paper) | B&H | B&H # LOFSFTL MFR # T1-72 |
For LED matrix. 1 required. |
Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in | Grainger, inc | 20JL37 | Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required. |
Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 – 1100 nm, 50 mW | Thorlabs | S120VC | For measuring light intensity. 1 required. |
Labelling Tape | Fisher Scientific | 159015N | For labelling and securing loose components. 1 required. |
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | For measuring light intensity. 1 required. |
100mL GL45 hybridization glass bottle | Bellco Glass, Inc. | (7910-40150) | Bioreactor vessel. 1 required. |
Six port assembly | Bellco Glass, Inc. | Custom | For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125" OD x .055"ID. Port A: 1.0" long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0" long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0" long above cap slug, 65 mm long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel. |
Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3 | Amazon | B0009F3P3U | Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame. |
1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing | United States Plastic Corp. | 57288 | Tubing. ~25' required. |
Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10 | Cole-Parmer | EW-62992-32 | Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required. |
2L Laboratory Flask | Pyrex | 4980 | Media flask and effluent flask. 2 required. |
Day pinchcock | Fisher Scientific | 5867 | For pinching tubes shut. 3 required. |
Replacement tubing assembly 1/16" ID | Traceable Products | 3372 | The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use. |
Replacement tubing assembly 1/50" ID | Traceable Products | 3371 | The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use. |
Male luer with lock ring x 1/16" hose barb, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-00 | Connectors. ~10 luers are required. |
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-04 | Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing. |
Female luer x 1/16" hose barb adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-00 | Connectors. ~10 luers required. |
Female luer x 3/16" hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45502-08 | Connectors. ~10 luers required. |
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | SC-45502-28 | |
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-56 | |
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | Tubing. 1 roll required. |
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft | Cole-Parmer | EW-96410-13 | Tubing. ~25' required. |
3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing | United States Plastic Corp. | 57293 | Tubing. ~1' required. |
Vacuum filter | Fisher Scientific | 974107 | Nalgene vacuum filter for sterile filtering media. |
Aquel Oxy-Boost 200 | Rena Aquatic Supply | AP200 | Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required. |
0.2 μm pore syringe filter | Corning International | 431229 | This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required. |
Slygard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Slygard 184 | For microfluidic device. 1 required. |
American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 17989000 | For cutting tubes and PDMS. 1 blade required. |
Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID | Sigma-Aldrich | WHAWB100028 ALDRICH | For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required. |
Microscope cover glass 22×60-1.5 | Fisher Scientific | 12-544-G | For microfluidic device. 1 required. |
Rectangular aluminum frame with a square window | Custom | Custom | To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches. Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches Thickness: ~1/32 inches |