Abstract
techniques électroencéphalographiques avancées d'analyse nécessitant une haute résolution spatiale, y compris l'imagerie et les mesures de connectivité réseau source électrique, sont applicables à une diversité croissante de questions en neurosciences. L'exécution de ces types d'analyses dans un modèle de rongeur nécessite la densité de l'électrode supérieure à électrodes à vis traditionnelles peuvent accomplir. Bien qu'il existe plus forte densité montages électroencéphalographiques pour les rongeurs, ils sont d' une disponibilité limitée à la plupart des chercheurs, ne sont pas assez robustes pour des expériences répétées sur une longue période de temps, ou se limitent à utiliser chez les rongeurs anesthésiés. 1-3 Un faible coût proposé procédé de construction d'une structure durable et de haute comptage, transcrânienne réseau d'électrodes, constitué de pièces de tête bilatéralement implantable est étudiée en tant que moyen pour effectuer des analyses de pointe électroencéphalogramme chez les souris ou les rats.
Les procédures de fabrication et de têtière implantation chirurgicale nÉCESSAIRE pour produire un rapport signal à bruit, basse impédance électroencéphalographie et signaux électromyographiques sont présentés. Bien que la méthodologie est utile chez les rats et les souris, ce manuscrit se concentre sur la mise en œuvre plus difficile pour le crâne de la souris plus petite. Librement souris mobiles sont seulement attachés à des câbles via un adaptateur commun lors de l'enregistrement. Une version de ce système d'électrodes qui comprend 26 canaux électroencéphalographique et 4 canaux électromyographiques est décrit ci-dessous.
Introduction
L'activité neuronale peut être enregistrée extracellulaire avec différents niveaux de granularité de microscopiques (potentiels d'action individuels) à mésoscopiques (des potentiels de champ locaux) à macroscopique (électroencéphalogramme). Ces traces encéphalogramme sont analysés de façon classique dans le domaine fréquentiel pour caractériser le comportement, neurophysiologique, ou états électrophysiologiques. Cela peut être fait avec un seul biopotentielle, 4 mais les enregistrements EEG densité clairsemées ne peut pas résoudre la composante spatiale de l' activité neuronale. Analyse de l' électroencéphalogramme moderne repose sur plusieurs électrodes pour produire des cartes détaillées de la distribution spatio - temporelle de l' activité corticale afin de corréler cette activité avec des conditions psychologiques spécifiques et des processus physiologiques. 5-7 Deux des catégories les plus couramment utilisés d'analyse nécessitant des montages EEG à haute densité sont imagerie source électrique et des mesures de connectivité réseau de neurones. 8-11
12-15 Depuis EEG a haute résolution temporelle, les études EEG permettre une évaluation en temps réel des ERPs et EPs ainsi que l' analyse temporellement précise post hoc. 3,11 12
Associant états et des fonctions cognitives avec le jeu des oscillations observées sur l'électroencéphalogramme est le but ultime des diverses mesures de connectivité de réseau neuronal. De nombreuses études ont montré la synchronisation et le verrouillage de phase d'oscillations entre les différentes régions du cerveau sont associées à des états spécifiques de l' éveil, l' attention et l' action 6,13,14,16-19.
localisation Source et réseau analyse des signaux EEG origine avec des études chez l'homme, mais les enquêtes sur la base neuronale de ces signaux comportent nécessairement des modèles animaux, car ils nécessitent des techniques invasives qui sont autrement impossibles chez les humains. Afin de reproduire ces analyses dans des modèles de rongeurs, un procédé de capture des signaux EEG à haute densité dans le cerveau d'un rongeur est nécessaire. Alors que d'autres groupes ont construit des réseaux de microélectrodes à haute densité pour une utilisation chez les souris, ces approches sont de disponibilité limitée aux chercheurs, sans accès à des installations de nanofabrication, ne sont pas assez robustes pour des expériences répétées sur une longue période de temps, ou sont limités à utiliser dans anesthésié souris. 1-3,7 Un protocole faible alternative économique pour la construction de haute densité chronique, transcrânienne électrode array est démontré ici.
L'approche de l'acquisition du signal décrit ici ne se limite pas à l'EEG, mais comprend des signaux électromyographiques (EMG). Acquisition de signaux EMG peut être une approche complémentaire pour définir l'état de comportement et est particulièrement utile pour les études sur le sommeil. Cette approche fournit un intermédiaire entre coûteux, ultra-haute densité des grilles intracrâniennes, et les numéros de plomb limitées possibles avec des électrodes à vis traditionnelles qui sont insuffisants pour les approches d'analyse avancées. La conception de têtière est facilement construit et abordable pour les études à haut débit. L'utilisation de ce système d'acquisition conjointement avec des techniques de manipulation génétique ou pharmacologiques variées au sein des modèles de rongeurs peuvent aider à découvrir les mécanismes de génération corticale d'oscillation, des divergences de comportement de véritables différences génotypiques, localisation des sources d'ERPs et EPs, et de communication de réseau à grande échelle.
Protocol
Les études réalisées tout au long de cette enquête étaient en accord avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et approuvés par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux à l'Université de Pennsylvanie.
1. Diadème Conception et construction
- Retirer tous les huitième rangée de broches de la broche brique d'un connecteur femelle 100 de position avec une paire de pinces 2 x 50 en poussant la partie de réceptacle de la broche à travers la brique en plastique.
Remarque: Pins orientées vers le bas sera l'orientation qui sera référencé pour le reste du protocole. (Prendre note du présent spécifiquement 2.6). - Couvrir les broches avec une très légère couche de vernis à ongles pour isoler et laisser le vernis à ongles sécher complètement.
- Retirez le vernis à ongles à partir des extrémités des tiges avec de l'acétone et un petit chiffon.
- Coupez le plastique excédentaire de 2 x 7 de l'aide d'une lame de rasoir ou coupe-fil pliers. Cela se traduira par 2 x 7 briques qui sont isolées le long de la longueur des broches et exposées à la pointe de broche. Ceux-ci finiront par devenir les électrodes EEG transcrânienne. Deux 2 x 7 briques sont nécessaires pour un réseau d'électrodes chronique complète (figure 1A).
- Coupez deux 1 x 2 briques de broches pour EMG enregistrement de signal. Utilisez le même processus d'élimination des broches indésirables avec des pincettes et coupant l'excès de plastique pour créer les briques 1 x 2. Assurez - vous que ces 1 x 2 jeter un côté lisse à eux de l'original 100 Position Receptacle que cette distance deviendra la distance de broches standard pour chaque têtière de sorte qu'un seul adaptateur fonctionnera pour tous les frontispices (figure 1A).
- Utilisez 2-partie époxy pour fixer la broche pièce 1 x 2 à la broche pièce (figure 1D) 2 x 7.
- Comme les deux ensembles de tiges doit être dans la même orientation, les époxy 1 x 2 sur la face latérale des deux moitiés de la pièce de tête avec les parois lisses du 1 x 2 et 2 x7 en contact les unes aux autres. Alignez les piqûres et les broches 1 x 2 avec les plus postérieurs 2 rangées de broches sur la 2 x 7.
Nota: Les deux moitiés de l'élément de tête ne sont pas epoxied ensemble. Ceci permet une certaine souplesse dans les deux moitiés de l'adaptateur de casque pour faciliter la connexion au cours de l' habituation et pendant les jours expérimentaux (figure 1E). - Laissez les moitiés de headpiece guérir du jour au lendemain. Une fois terminé, le casque est bilatéralement symétrique. Chaque moitié se compose d'une broche brique 2 x 7 avec 2 x 1 broche brique attachée latéralement qui est en ligne avec la partie postérieure la plupart des 2 rangées de la broche brique 2 x 7.
- Comme les deux ensembles de tiges doit être dans la même orientation, les époxy 1 x 2 sur la face latérale des deux moitiés de la pièce de tête avec les parois lisses du 1 x 2 et 2 x7 en contact les unes aux autres. Alignez les piqûres et les broches 1 x 2 avec les plus postérieurs 2 rangées de broches sur la 2 x 7.
- Préparer les fils pour EMG enregistrement de signal. Simple brin, 31 G fil d'argent perfluoroalkoxy isolé est utilisé pour le signal EMG d' enregistrement (figure 1D). Cependant, multifilaire ou un autre câblage métallique peut être substitué si on le désire.
- Pour créer des fils EMG thoracique prennent 3,0 cm de long morceau de fil d'argent perfluoroalkoxy isolé et remove 1 cm de l'isolant en matière plastique à partir d'une extrémité d'une lame de rasoir. Enroulez deux fois le fil non isolé autour d'une paire de pinces. Retirez le fil de la pince à épiler et enlever 25 mm d'isolation à l'extrémité non-boucle avec une lame de rasoir.
- Pour construire des fils EMG cervicales, répétez le processus avec un segment de 1,5 cm de fil. Deux fils du col EMG et deux fils d'EMG thoraciques sont nécessaires pour une pièce de tête complète.
- Retirer la goupille latérale dans la plus rangée antérieure des deux frontispices, ce qui correspond à une coordonnées stéréotaxiques de 3,3 mm antérieure du bregma et 2,3 mm latéral du bregma, car il n'y a pas de cerveau sous cet endroit tel que déterminé par un atlas du cerveau de la souris 20 (figure 2A).
- Sur les deux moitiés de headpiece, couper les broches du 1 x 2 briques à la base plastique de la coiffe avec une paire de pinces coupantes (3,0 mm de la pointe de la broche) et souder le fil EMG cervical à la broche antérieure et thoracique EMG à la partie postérieure pdans.
- Vérifier que chaque broche est isolée électriquement. Effectuer un test de continuité avec un multimètre numérique en reliant les deux fils du voltmètre à différentes broches tandis que dans le mode de continuité. Broches isolées électriquement ne produira pas un bip sonore avec ce test de multimètre; cependant, les broches couplées électriquement sera. Couvrir les joints soudés avec vernis à ongles et une fois sec, pliez les fils EMG tels qu'ils sont en parallèle à l'axe antérieur / postérieur avec déplacement latéral minimal.
- goupilles de garniture à une longueur relative de telle sorte qu'ils correspondent au profil de la surface du cerveau.
- Avec l'aide d'une souris atlas du cerveau, fiche la distance ventrale à la surface du cerveau de Bregma pour chaque broche de coordonnées. 20 La broche dont la distance ventrale de Bregma est le plus grand servira de l'indicateur pour la broche parage. Cette broche ne sera pas coupé tandis que toutes les autres broches seront coupées par rapport à cette broche à distance ventrale maximale (tableau 1).
Remarque: Pins peut être broyé à la taille, mais il doit être fait avec soin que la friction entre la broche et la meule peut provoquer les broches de la têtière de se plier. Si une broche est pliée, utiliser des pinces pour le redresser. Une alternative à broyer les tiges vers le bas à la longueur est de les couper avec une paire de pinces de coupe de fil.
- Avec l'aide d'une souris atlas du cerveau, fiche la distance ventrale à la surface du cerveau de Bregma pour chaque broche de coordonnées. 20 La broche dont la distance ventrale de Bregma est le plus grand servira de l'indicateur pour la broche parage. Cette broche ne sera pas coupé tandis que toutes les autres broches seront coupées par rapport à cette broche à distance ventrale maximale (tableau 1).
- Couvrir toutes les extrémités de broches avec une solution d'argent à l'aide d'un stylo solution d'argent et laisser sécher. Cette étape réduit les impédances d'électrode à ≤30 kQ, ce qui augmente le rapport signal à bruit et permet d'éliminer les aspérités causées par la broche de coupe, ce qui diminue les risques de dommages tissulaires et d'accélérer la récupération de la chirurgie en même temps. A headpiece terminé poids demi environ 0,5 g.
2. Construction Adapter et Channel Mapping
- Couper les fils de connexion d'un connecteur 36 mâle double rangée de position Nano-miniature à une longueur uniforme de 2 ou 3 cm en utilisant une lame de rasoir. Pour chaque fil, strip off 2,5 mm d'isolation à partir de la fin et l'étain le métal exposé pour chaque fil. Assurez-vous quand étamage d'avoir un seul, mince brin de fil étamé pour chaque fil de l'adaptateur nano comme cela est crucial pour isoler les broches. Couper l'isolant dépouillé avec une pince coupe-fil (Figure 1C).
- Créez un connecteur mâle / mâle correspondant à la têtière en utilisant le Conn Strip Header 2 x 50. Couper deux 2 x 7 et deux de 2 x de 1 à partir d'une brique 2 x 50. Retirer les épingles indésirables de la 2 x 50 briques en cassant l' une des broches mâles, puis pousser la seconde moitié ininterrompue du même morceau du connecteur avec une paire de pinces (figure 1B).
Remarque: Un côté de ces broches servira broches d'adaptateur à brancher sur chaque casque, tandis que l'autre moitié sera soudé aux fils du connecteur nano étamé. Soyez sûr d'avoir les bords plats en plastique de la toucher 2 x 1 et 2 x 7 pour garantir le bon accouplement du connecteur mâle / mâle avec le casque créé à l'étape1. - Solder sur l'un des fils au sol / de référence du connecteur de nano à la broche sol / de référence souhaitée. Les fils de terre et de référence sont attachés ensemble sur la puce de l'amplificateur RHD2132. Utilisez la broche unique qui est de 0,60 mm antérieur à bregma et 1,00 mm latéral du bregma à la fois comme référence et la masse. (Têtière gauche, broche médiane de la troisième rangée la plus antérieure, mais toute autre broche pourrait être affectée si l'on préfère, la figure 2.) Notez qu'il est possible de séparer sol et de référence sur la puce de l' amplificateur en supprimant la résistance 0Ω qui lie sol et de référence ainsi que si l'isolement des deux est souhaitée.
- Souder les fils de connexion de nano conserve du même côté des connecteurs mâle / mâle comme la connexion des broches sol / référence. Chaque fil correspond à un canal spécifique, de sorte que la configuration de canal peut être complété à ce moment. carte Channel diagrammes pour les headstages amplificateurs sont disponibles sur le site Ouvrir Ephys Wiki (https://open-ephys.atlassian.net/wiki/display/OEW/Home). Soudez le fil correspondant dont le canal est connu à la broche respective pour obtenir la cartographie souhaitée.
- Coupez les fils inutilisés à la base du connecteur nano avec les pinces de coupe de fil.
- Utiliser un voltmètre pour s'assurer que chaque broche est électriquement isolée de toutes les autres broches. Une fois que l'isolement est confirmée, appliquer une mince couche de vernis à ongles autour de chaque joint de soudure pour isoler davantage chaque broche.
- Utilisation de 2-partie époxy, renforcer l'adaptateur correspondant de nano aux bilatérales 2 x 7 et 2 x 1 pins sur les briques mâle-mâle.
Note: Il y aura deux moitiés à ce seul adaptateur qui correspondent à la disposition des broches des moitiés de headpiece créés précédemment. Il est essentiel de faire en sorte que la partie médiane de chaque moitié de l'adaptateur n'a pas excès d'époxy débordant le bord en plastique du connecteur mâle / mâle, car cela empêche les deux moitiés de la têtière étant branché simultanément. Ne pas laisser l'époxyde de circuler vers le côté inférieur du por adaptateur de brochetion de l'adaptateur, car cela permettrait également d'éviter les connexions appropriées. Utilisez les 2 moitiés de headpiece comme un moule pour un alignement correct des broches du connecteur. - Époxy les deux moitiés de l'adaptateur et de résine époxy de la base du connecteur nano pour augmenter sa durabilité. Assurez-vous de couvrir tous les joints de soudure avec de l'époxy. Laissez l'adaptateur traitement durant la nuit.
- Confirmation de la bonne correspondance des canaux peut être effectuée en utilisant des mesures d'impédance dans l'interface utilisateur graphique ouvert Ephys (GUI). Un adaptateur terminé pèse environ 1,3 g (figure 1F).
3. Surgery
- Préparer un champ opératoire stérile.
- Porter des gants stériles et d'autres équipements de protection individuel requis. Stériliser les instruments dans un autoclave. Stériliser le cadre stéréotaxique avec une solution de dioxyde de chlore de 1,0 mM. Pulvériser la solution sur le cadre et attendre 5 min avant de rincer à l'eau stérile.
- Pour stériliser headp implantablepièces IECE, pulvériser les composants avec une solution de dioxyde de chlore de 1,0 mM, et attendre 5 min avant de rincer à l'eau stérile. Placez le matériel implantable maintenant stérile dans une boîte de Pétri stérile.
- Obtenir une masse pré-chirurgicale de la souris, puis anesthésier la souris dans une chambre d'induction de 200 ml en utilisant de 1,5 à 2,0% d'isoflurane dans 100% d'oxygène. Utiliser un débit dans la chambre d'environ 500 ml / min.
- Confirmer la perte du réflexe de redressement en faisant tourner la chambre d'induction. Retirez la souris de la chambre d'induction et la place dans le cône de nez sur le cadre stéréotaxique sans obtenir complètement la tête de la souris avec les barres d'oreilles. Continuer à surveiller pour une bonne profondeur de l'anesthésie par l'évaluation orteil pincée tout en évaluant les signes vitaux.
- Maintenir la température corporelle à 37 ° C avec un régulateur de température en boucle fermée, tel qu'un système de coussin de sonde et le chauffage par voie rectale. Couvrir les yeux de la souris avec la pommade oculaire ophtalmique avant de rogner la fourruresur le sommet du crâne avec des ciseaux ou un coupe incurvées. Désinfecter la tête avec de la bétadine et laisser la bétadine sécher complètement avant de continuer.
- Administrer des analgésiques et des antibiotiques ainsi que des fluides par voie intrapéritonéale. Pour 25 g de souris, 0,5 mg de céfazoline, 0,125 mg de méloxicam, 0,5 ml de solution saline, et 2,5 ug de buprénorphine q 4-6 heures prn.
- Injecter 250 ul bupivacaïne à 0,25% sous-cutanée sur la ligne médiane sur la tête, et injecter 100 ul bupivacaïne à 0,25% sous-cutanée sur les deux arcades zygomatiques de la souris.
- Fixer la souris dans le cadre stéréotaxique et exposer le crâne.
- Fixer la tête de la souris avec les barres d'oreilles stéréotaxiques au cadre stéréotaxique. Assurez-vous que la souris se trouve dans un plan chirurgical d'anesthésie en confirmant l'absence du réflexe pointe de pincement. Créer une incision de 1,5 à 2,0 cm de long avec un scalpel jetable n ° 11 le long de la ligne médiane du crâne. L'incision va commencer à partir entre les yeux et continuer à l'arrière occiput. </ Li>
- Exposer le crâne en répandant la peau latéralement par micro pinces. Réduire la concentration d'isoflurane de 2,0% à une concentration qui maintient un plan de l'anesthésie chirurgicale, mais ne réduisent pas à une valeur inférieure à 1,0% d'isoflurane dans 100% d'oxygène. analgésie pré-opératoire réduit la quantité d'anesthésique par inhalation nécessaire pour maintenir une profondeur de l'anesthésie chirurgicale, et peut conduire à une récupération plus rapide et les résultats de survie améliorés.
- Niveau du crâne et percer des trous de trépan.
- Identifier bregma et remettre à zéro les coordonnées stéréotaxiques au bregma, qui devient l'origine du système de coordonnées. Pour niveler le crâne dans l'axe médian / latéral, déplacer une sonde de mise à niveau fixé à un bras manipulateur stéréotaxique 1,50 mm latéralement dans les deux directions à partir de bregma et confirmer que la dorsale / profondeur ventrale est inférieure à 0,05 mm lorsque les contacts de la sonde gauche et à droite les côtés du crâne.
Note: La résolution 10 um de la dorsale / ventrale manipulateur arsuis en est utilisé conjointement avec un affichage numérique de coordonnées simplifie la mise à niveau. Niveau à l'axe antérieur / postérieur environ bregma suit la même technique. La différence dans la distance ventrale pour venir en contact bregma et Lamda doit également être inférieure à 0,05 mm.- Ajuster la boîte crânienne jusqu'à ce que le nivellement est complète dans les deux sens, de sorte que le plan transversal est parallèle au sol. Cela permet de vraies coordonnées stéréotaxiques comme on le voit dans l'atlas du cerveau de la souris 20.
- Avec un diamètre de micro bits de foret de 0,5 mm à l'intérieur d'un foret stéréotaxique, percer des trous de bavure de 3,30 mm à 4,50 mm antérieur à postérieur bregma en incréments de 1,30 mm à 1,00 mm latéralement à la ligne médiane des deux moitiés du crâne. 2,30 mm pour les colonnes d'électrodes latérales, des trous de forage bavure de 2,00 mm en avant de bregma à 4,50 mm en arrière du bregma en incréments de 1,30 mm sur les deux côtés de la ligne médiane (figure 2). La haute précision et de précision qui est nécessaire pour ce dropération Illing est simplifiée par la résolution 10 um d'un bras manipulateur stéréotaxique numérique.
Remarque: Pour que les broches de la têtière de bien être implanté, le crâne de la souris doit être bien en place dans le cadre stéréotaxique. Si le crâne se déplace pendant le forage, le désalignement des headpiece et Burr trous peut en résulter.
- Identifier bregma et remettre à zéro les coordonnées stéréotaxiques au bregma, qui devient l'origine du système de coordonnées. Pour niveler le crâne dans l'axe médian / latéral, déplacer une sonde de mise à niveau fixé à un bras manipulateur stéréotaxique 1,50 mm latéralement dans les deux directions à partir de bregma et confirmer que la dorsale / profondeur ventrale est inférieure à 0,05 mm lorsque les contacts de la sonde gauche et à droite les côtés du crâne.
- Implanter les coiffes.
- Avec des pinces droites, préparer les tunnels de fil EMG pour les fils EMG thoraciques. Burrow 2,5 cm entre la peau et le muscle dans le dos pour les deux fils EMG gauche et droit. Insérer thoracique et cervicale EMGs dans la cavité créée par la pince droite, et ensuite manoeuvrer la brique EEG avec des forceps incurvés de telle sorte que les broches soient alignées avec les trépanations précédemment forés.
- Appliquer une légère pression sur le casque et se tortiller les broches dans le crâne. diamètre de broche est de 0.46 mm. Avec vernis isolant, les broches seront bien ajustées dans le trépan de forage holes. La têtière sera stable une fois qu'il est correctement inséré. Régler les fils EMG à des positions finales. Répétez le même processus pour la têtière de l'autre côté.
- Fixer le bandeau en place à l' aide de ciment dentaire.
- Lorsque les deux casques sont mis en place, mélanger 1: 1 de méthacrylate de méthyle avec son composé de réticulation. Appliquer le mélange de telle sorte qu'il couvre le crâne exposé, les parties à ongles poli des électrodes à broche, et la partie proximale des fils EMG, mais ne couvre pas les réceptacles femelles de la têtière.
- Assurez-vous de ne pas obtenir de ciment sur la fourrure. Ne pas permettre des crêtes de ciment pour former que la souris sera en mesure de saisir sur. Prévoir suffisamment de temps pour le ciment à sécher, puis retirez la souris du cadre stéréotaxique. Le poids total que la souris devra porter est parmi les 2 moitiés de la têtière et le ciment de fixation est d'environ 1,2 g.
- Placez l'animal dans un endroit proprezone de récupération.
- Maintenir la température du corps avec un coussin chauffant. Surveiller la souris jusqu'à ce qu'il retrouve tous les réflexes de posture, ce qui signifie l'émergence de l'anesthésie. Le logement individuel est recommandé pour la récupération à long terme.
- Le suivi quotidien pour un minimum de 3 jours après la chirurgie est recommandée avec l'analgésie interventionnelle. Laisser 10-14 jours de récupération post-opératoire avant de commencer une période d'habituation tethered.
4. habituation Animaux à Tethering
- Branchez l'adaptateur à la souris à l' aide d' un appuie-tête de la souris (Figure 1G-H). Tenez les coins opposés des coiffes qui sont cimentées en place avec des pinces hémostatiques courbées une fois que la souris est retenue et insérez lentement les broches d'adaptateur dans la têtière implanté des deux côtés.
- Raccordez l'amplificateur 32 canaux à l'adaptateur (Figure 1 H). Assurez-vous d'aligner les logos sur l'adaptateur et l'amplificateur dans une coorientation nsistent pour l'adaptateur et l'amplificateur pour éviter les erreurs de canal de cartographie. Raccordez l'amplificateur à un câble RHD2000 norme interface périphérique série (SPI). Ce câble se connecte au système d'acquisition pour l'enregistrement de signaux.
- Placez la souris dans une chambre qui a un bras en porte-installé sur le mur de la chambre. Branchez le câble d'interface SPI au bras en porte à faux et régler la tension dans le bras en porte à faux pour contrebalancer le poids du câble attaché. La souris est capable de se déplacer librement et est habitué pendant une heure par jour de la semaine avant l'enregistrement.
- Pour déconnecter la souris, il suffit de débrancher le câble et l'adaptateur de la souris tout en utilisant un acier inoxydable micro spatule plate pour aide à débrancher l'adaptateur de la souris.
Configuration 5. Signal Extraction System / Enregistrement Signal
- Branchez l'adaptateur construit dans la têtière d'une souris implanté. Connecter un amplificateur de headstage à l'adaptateur etattacher un câble standard d'interface SPI à l'amplificateur et à la carte d'acquisition. Avoir le câble SPI attacher à une console bien tendue de sorte que le poids supplémentaire sur la tête de la souris est réduite au minimum.
- Placez une cage de Faraday local, créé en utilisant la conduite maille ou une feuille d'aluminium, autour de la headstage et au sol de la cage de Faraday locale.
- Obtenir électrode impédances avant le début de chaque enregistrement en sélectionnant un 30 kS / s Taux d'échantillonnage et de mesure des impédances via le module de l'interface graphique. Une valeur inférieure ou égale à 10 kQ à une broche individuelle impédance est nécessaire pour la confirmation de contact d'électrode appropriée. Des valeurs plus élevées d'impédance conduisent à des données rejetées à partir de cette électrode.
- Pour l'enregistrement, créer une chaîne de Rhythm FPGA, filtre passe-bande, et le PDD spectateur dans l'interface graphique de signal. Il est recommandé de choisir un taux de 1,00 kéch / s, de bande passante de 0.1-7,500 Hz échantillonnage et désélectionner DSP. Réglez le filtre passe-bande à 0,1-250 Hz et afficher les canaux par opforcement le spectateur LFP. 250 et 400 amplitudes des canaux uV avec la méthode de tirage sélectionnés mieux visualise les données.
- Commencez l'enregistrement en utilisant l'interface graphique. Créer un nouveau dossier pour chaque enregistrement et définir le chemin pour enregistrer des fichiers dans ce dossier. Pour commencer un enregistrement simplement sur dossier. Tous les 32 canaux du connecteur sont enregistrées par défaut, mais les chaînes non désirées peuvent être désélectionné en cliquant sur le côté droit du module Rhythm FPGA avant le début de l'enregistrement.
- données dans Matlab d'importation pour l'analyse. Il y a une multitude de boîtes à outils open-source qui peuvent être utilisés pour aider à l'analyse.
Representative Results
Exemples de données enregistrées dans une souris se déplaçant librement implanté avec un EEG têtière haute densité est représentée sur la figure 3. Formes d' onde EEG individuels correspondent au schéma de canal cartographie montre la figure 2. Des exemples de cervicales et thoraciques EMG sont également affichés dans la figure 3. a noter que l'enregistrement EMG thoracique contient également une activité électrique provenant incorporé dans le coeur de la souris qui devient évident quand un signal différentiel entre les deux fils d'EMG du thorax (T) est calculée. Avec cet enregistrement , il est également possible de calculer la fréquence cardiaque de la souris en mesurant le temps entre les pointes de QRS électrocardiographiques. 23-24 De même, il est possible de mesurer la fréquence respiratoire de la souris en calculant la variabilité phasique de la pointe de QRS que la cavité thoracique se dilate et contrats avec chaque souffle. 25 par conséquent, permis cette installation pour l' acquisition opolysomnographie murin f. De plus, la configuration permet la cartographie corticale des potentiels évoqués visuels (figure 4). Lorsqu'une impulsion 10 msec de lumière est livré seulement à l'œil gauche de la souris, les réponses classiques sont enregistrées dans le controlatérale (mais pas ipsilatéral) cortex visuel primaire qui sont suivies par une réponse retardée dans controlatéral cortex visuel secondaire. Le film incorporé dans la figure 4 montre le potentiel électrique variant dans le temps à travers la totalité de la surface corticale ainsi que des graphiques de l' activité dans controlatérale V1 et V2.
| AP | ||||||
| 3.3 | 0 | 0 | ||||
| 2 | 0,4 | 0,6 | 0,6 | 0,4 | ||
| 0,7 | 0,6 | 0,9 | 0,9 | 0,6 | ||
| -0.6 | 0,9 | 1 | 1 | 0,9 | ||
| -1.9 | 1 | 1.1 | 1.1 | 1 | ||
| -3.2 | 3 | 1 | 1 | 1 | 1 | 3 |
| -4.5 | 3 | 0,7 | 0,7 | 0,7 | 0,7 | 3 |
| ML | -2.3 | -1 | 1 | 2.3 |
Tableau 1:. Pin Parage Longueurs Cette figure montre les longueurs de rognage nécessaires, en mm, par broche pour la têtière. Longueurs pour broches rognage ont été acquises à partir d'un atlas du cerveau de la souris. Un Fter broches rognage, le casque correspond au profil de la surface du cerveau. 20 broches EMG sont complètement coupés comme les fils utilisés pour enregistrer le signal EMG sont soudés sur le talon de la broche.
Figure 1:. Headpiece Composants, intermédiaires étapes de construction et de connexion pour l' enregistrement Ce chiffre indique la matière première utilisée pour créer des coiffes. A partir d'une prise connecteur 100 broches, petits 2 x 7 et 2 x 1 composants sont créés. A noter que dans le composant 2 x 1, le bord initial de la 2 x 50 est intact, ce qui permet la construction headpiece uniforme et permet une adaptation pour se connecter à de nombreuses souris implantées. La Figure 1B et 1C présentent les matières premières nécessaires à la création de l'adaptateur de l'élément de tête à l'amplificateur. 1B présente l'extrémité de la pièce de têtel'adaptateur similaire est coupé vers le bas pour se connecter à la têtière. On notera que cette 2 x 1 comporte encore une arête d' origine de la pièce brute, assurant la connexion entre l'adaptateur et l'embout supérieur. La figure 1C montre l'extrémité de l'adaptateur qui se connecte à l'amplificateur. La figure 1D illustre l'enduit d' époxyde de 2 x 7 et 2 x 1 composants ainsi que des fils préparés EMG pour l' enregistrement du signal. Figure 1E montre un casque terminée. Figure 1F affiche un adaptateur terminée. Figure 1G montre une bonne connexion entre les frontispices et l'adaptateur. Enfin, la figure 1H montre une souris implanté avec adaptateur connecté et amplificateur. La puce de l' amplificateur est connecté à un câble d'interface qui fonctionne à la carte d'acquisition (non représenté). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Electrode Montage et Diadème Entièrement construite Cette figure montre le placement des électrodes par rapport au cerveau de souris. emplacements des électrodes sont basées sur les coordonnées stéréotaxiques de bregma. Coordonnées pour chaque électrode peut être trouvé à l'étape 4.8 du protocole. la couleur de l'électrode correspond aux régions du cerveau sous-jacentes à chaque électrode. Blanc = frontal cortex associatif (FrA), Orange = moteur primaire cortex (M1), Rose = secondaire cortex moteur (M2), vert foncé = primaire cortex somatosensoriel, région forelimb (S1FL), vert = primaire cortex somatosensoriel, zone dysgranular (S1DZ ), Green Light = cortex somatosensoriel primaire, champ de canon (S1BF), Jaune = pariétal médial cortex associatif (MPTA), bleu foncé = primaire cortex visuel (V1), bleu clair = cortex visuel secondaire, zone mediomedial (V2MM), Noir = dy rétrosplénialcortex sgranular (RSD). 20 Common Reference / RDC est représenté aussi bien. Ce système de référence minimise l'artefact respiratoire dans le signal brut. Les numéros associés à chaque électrode individuelle fournissent une carte de canal pour l'ensemble du réseau. Image modifiée de Allen Atlas de cerveau de souris. 21,22 Figure 2B montre un casque entièrement construit à l' échelle par rapport à un sou. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: EEG de l' échantillon et EMG Traces de l'électrode Montage des formes d' onde d'électrodes correspondent à la cartographie du canal représenté sur la figure 1A.. EMG cervicale (C) permet de déterminer le tonus musculaire nucale (+). signaux EMG contiennent également des impulsions électriques cardiaques QRS(*). Les barres d'échelle de 200 mV pour trace amplitude et 1 sec pour une durée de trace sont affichés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Répartition spatiale des potentiels évoqués visuels Répartition spatiale de l'application suivante potentiel évoqué d'un flash de lumière unilatérale administré seulement à l'oeil gauche.. diagramme supérieur représente la haute densité EEG montage avec chaque cercle représentant une électrode. Changement de couleur au fil du temps correspond aux variations de tension au fil du temps pour chaque électrode respective. Au temps = 0 msec, une impulsion 10 lumineuse msec est livré et représenté dans la figure du milieu. graphique bas illustre signifie traces potentiels évoqués pour controlatérale V1 et V2 EEG électrodes (essais n = 108 EP). pul Lumièrese produit à 0 msec. Notez que la réponse potentielle évoquée correspondante est observée dans V1 controlatéral (trace noire), suivi d'un temps de latence plus réponse évoquée potentiel V2 controlatéral (trace rouge). (Clic droit pour télécharger).
Discussion
La construction à faible coût et des mesures chirurgicales nécessaires pour atteindre correctement un 26 canal, à haute densité EEG montage dans une souris est décrite. épidurale contact d'électrode est critique pour l'acquisition de signaux d'EEG de qualité dans ce système. Deux étapes dans l'adresse de protocole cette question: pin rognage pour correspondre le contour du cerveau, et têtière implantation avant le renforcement acrylique. Il est important de ne pas couper une broche trop courte au cours de la phase de construction. Lors de l'implantation des frontispices, il est impératif de vérifier le placement de la broche avant le renforcement acrylique final. Une façon de confirmer le contact de l'électrode appropriée est au moyen de tests d'impédance. Ostensiblement, impédances de 5-10 kQ suggèrent le placement épidural approprié. 26 Les mesures d'impédance démontrent la durabilité des frontispices, en tant que valeurs d'impédance d'électrodes sont stables dans ce 5-10 gamme kQ pendant au moins 4 mois après l'implantation. L'autreétape essentielle consiste à aligner les broches EMG avec les deux plus postérieur rangées de l'EEG brique 2 x 7. Cela est essentiel pour la connexion de l'adaptateur, comme EMG désaligné et les broches EEG se traduira par une incapacité à se connecter l'adaptateur ou broches d'adaptateur courbées.
Un avantage majeur de ce système d'acquisition est la facilité de modification de la forme du réseau d'électrodes afin d'optimiser les besoins expérimentaux variés. agencements d'électrodes sur mesure qui sont parfaitement adaptés pour des expériences spécifiques peuvent être facilement créés. Personnalisation pour des expériences spécifiques pourrait combiner EEG avec une canule pour l' administration de médicaments dirigée pour pharmacologique combinée, électroencéphalographie, et des études comportementales. 27 Coiffes, adaptateurs, et les interventions chirurgicales sont facilement adaptés à un grand nombre d'études en suivant les méthodes décrites dans le protocole ci - dessus . Un deuxième avantage majeur de ce système d'acquisition est son faible coût. À l'heure actuelle, ce système d'acquisition peutfiche 128 canaux d'entrée sur jusqu'à 4 câbles séparés, permettant des enregistrements simultanés de 4 souris ou si on le souhaite, les rats ayant une plus forte grilles de densité. Une telle expansion ne nécessiterait des câbles et des adaptateurs supplémentaires.
Cette approche à l'acquisition EEG haute densité aborde les inconvénients des autres à haute densité méthodes d'acquisition EEG chez la souris. Le système décrit dans ce travail est haut la main construit avec des matériaux simples et utilise ouvert le matériel source et un logiciel qui est peu coûteux et stable, permet des mesures répétées dans le même animal au fil des mois, permet la libre circulation au cours d'une expérience, et ne nécessite pas de souris pour être anesthésié pour l'enregistrement. Limitations de ce système est qu'il n'a été validé à ce jour chez les souris qui pèsent 20 g ou plus, et sont âgés de plus de 12 semaines. souris plus petites ou plus jeunes peuvent avoir des difficultés avec l'implantation de têtière. Une limitation secondaire de cette méthode est l'incapacité de contrôler précisément la profondeur de l'électrode après headpfabrication IECE. Toutefois, cette même limitation concerne des électrodes vis EEG traditionnelles car il n'y a aucun moyen de savoir précisément la pré-mortem profondeur par rapport à la surface corticale de vis. Dépannage pour cette méthode implique généralement bien blindage signal d'interférence de la souris lorsque attaché afin d'obtenir le signal sans bruit.
tableaux EEG haute densité sont essentielles pour les analyses spatiotemporelles complexes de données EEG qui sont la nouvelle norme dans l'interprétation moderne de l'EEG. Bien que la distribution spatiale d'un potentiel évoqué visuel est illustré, les données acquises à l'aide de ce système peuvent être analysées en utilisant des techniques d'imagerie de source électrique et des mesures de connectivité neuronales. Une réduction de 60% à 70% de la surface de contact entre ces broches d'électrodes par rapport aux contacts à vis classiques permet plus précisément le signal de localisation, comme le montre la figure 4. En utilisant des techniques analytiques à haute densité dans des souris génétiquement modifiées, suivant Pharmacolintervention ogi, ou chez les animaux présentant une pathologie intrinsèque tels que les troubles épileptiques peuvent aider à discerner les mécanismes générant des oscillations corticales spécifiques, localiser les sources d'ERPs et EPs, et de révéler les propriétés du réseau à grande échelle. Par de meilleurs systèmes humains paralléliseur, cette approche permettra d'améliorer les modèles de petits animaux de la neurophysiologie humaine et neuropathologie, fournissant une traduction plus facile des découvertes faites dans des modèles de rongeurs à la pertinence scientifique et clinique chez l'homme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32 Channel RHD2132 amplifier headstage | Intan Technologies | C3314 | |
| Aquistion Board | Open Ephys | v2.2 | |
| 100 Position Receptable Connector | Digi-Key | ED85100-ND | Headpiece |
| Acetone (1 L) | Sigma Aldrich | 179973-1L | |
| Razor Blade (100 pack) | McMaster Carr | 3962A4 | |
| Wire-Cutting Pliers | MSC Industrial | 321786 | |
| 2-Part Epoxy | McMaster Carr | 7605A18 | |
| PFA Coated Silver Wire (25 ft) | A-M Systems | 787000 | EMG Wire |
| CircuitWriter Pen | MCM Electronics | 200-175 | Silver Applicator for Electrode Tips |
| 36 Position Dual Row Male Nano-Miniature Connector | Omnetics Connector Corporation | A79028-001 | Headpiece to Amplifier Adapter |
| Conn Strip Header 2 x 50 | Digi-Key | ED83100-ND | Headpiece to Amplifier Adapter |
| Clidox Base and Acitvator | Pharmacal | 95120F & 96120F | Sterilant |
| Isoflurane | Priamal Enterprises Ltd | 66794-019-10 | |
| Oxygen | Airgas | OX USP300 | |
| Closed Loop Temperature Controller | CWE Inc. | 08-130000 | |
| Curved Scissors | FST | 14085-09 | |
| 0.25% Bupivicaine Hydrochloride | Hospira | 0409-1159-02 | Local Anesthetic |
| Meloxicam 5mg/ml | Henry Schein | 6451602845 | Pain/Inflammation Relief |
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | 0409-4888-20 | Fluids |
| Cefazolin | Hospira | 0409-0806-01 | Antibacterial |
| No.11 Disposable Scapel (20 pk) | Feather | 2975#11 | |
| Micro Serrefines | FST | 18052-3 | |
| Cotton Swabs (1,000 pk) | MSC Industrial | 8749574 | |
| 0.5 mm Micro Drill Bit | FST | 19007-05 | |
| Stereotaxic Drill | Kopf | Model 1471 | |
| Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | |
| Methyl Methacrylate | A-M Systems | 525000 | Cement for headpiece |
| Methyl Methacrylate Crosslinking Compound | A-M Systems | 526000 | |
| Curved Hemostats | FST | 13003-10 | Aide in Adapter Connection |
| RHD2000 standard SPI interface cable (3ft) | Intan Technologies | C3203 | |
| Cantilever Arm | Instech | MCLA | |
| Micro Spatula (12 pk) | Fischer Scientific | S50822 | |
| Digital Soldering Station | MCM Electronics | 21-10115 | |
| Rosin Core Solder 60/40 Tin/Lead | MCM Electronics | 21-1045 | |
| Color Craze Nail Polish with Hardeners (Nitrocellulose based) | L.A. Colors | CNP508 | |
| Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console | Kopf | Model 940 |
References
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