Abstract
Avanserte elek analyseteknikker som krever høy romlig oppløsning, inkludert elektrisk kilde bildebehandling og tiltak av nettverkstilkobling, gjelder for et voksende utvalg av spørsmålene i nevrovitenskap. Utføre slike analyser i en gnager modell krever høyere elektrode tetthet enn tradisjonelle skrue elektroder kan utrette. Mens høyere tetthet, elek- montasjer for gnagere eksisterer, de er av begrenset tilgjengelighet til de fleste forskere, er ikke robust nok for gjentatte forsøk over en lengre tidsperiode, eller er begrenset til bruk i bedøvede rotter. 1-3 En foreslått lave kostnader metode for å bygge en varig høy teller, transkranial elektrodegruppen, som består av bilateralt implanterbare headpieces er undersøkt som et middel til å utføre avansert elektroencefalogram analyser hos mus eller rotter.
Prosedyrer for headpiece fabrikasjon og kirurgisk implantasjon necessary å produsere høy signal til støy, er lav-impedans elektroencefalografiske og elektromyografisk signaler presenteres. Selv om metoden er nyttig i både rotter og mus, fokuserer dette manuskriptet på mer utfordrende gjennomføringen for den mindre mus skallen. Fritt bevegelige mus bare bundet til kabler via en vanlig adapter under opptak. En versjon av denne elektrodesystem som inneholder 26 elek-kanaler og 4 elektromyografiske kanaler er beskrevet nedenfor.
Introduction
Neuronal aktivitet kan registreres ekstracellulært med ulike nivåer av detaljnivå fra mikroskopiske (enkelte aksjonspotensialer) til mesoskopisk (lokale feltpotensialer) til makroskopiske (elektroencefalogram). Disse brainwave spor er klassisk analysert i frekvensdomenet for å karakterisere atferdsmessige, nevrofysiologiske, eller elektrostater. Dette kan gjøres med et enkelt biopotential, 4 men sparsom tetthet EEG opptak kan ikke løse den romlige komponenten i neuronal aktivitet. Moderne elektroencefalogram analyse er avhengig av flere elektroder til å produsere detaljerte kart over tid og rom fordeling av kortikal aktivitet for å korrelere at aktivitet med bestemte psykologiske forhold og fysiologiske prosesser. 5-7 To av de mest brukte kategoriene av analyse som krever høy tetthet EEG montasjer er elektrisk kilde bildebehandling og nevrale nettverkstilkoblings tiltak. 8-11
12-15 Siden EEG har høy tidsoppløsning, EEG studier tillate sanntid vurdering av ERP og EPer, så vel som timelig presis post hoc-analyse. 3,11 , 12
Knytte kognitive tilstander og funksjoner med samspillet av svingninger sett på elektroencefalogram er det endelige målet for de ulike tiltakene i nevrale nettverkstilkobling. Tallrike studier har vist synkronisering og fase låsing av svingninger mellom ulike områder av hjernen er knyttet til bestemte tilstander av opphisselse, oppmerksomhet og handling. 6,13,14,16-19
Kildelokalisering og nettverksanalyse av EEG-signaler stammer fra studier på mennesker, men undersøkelser i den neuronale basis for disse signalene nødvendigvis involvere dyremodeller, som de krever invasive teknikker som er ellers umulig i mennesker. For å gjenskape disse analysene i gnagermodeller, som er nødvendig en metode for å fange høy tetthet EEG-signaler i en gnagerhjerne. Mens andre grupper har konstruert med høy tetthet microelectrode matriser for anvendelse i mus, er slike metoder er av begrenset tilgjengelighet til forskere uten adgang til Nanofabrication anlegg, ikke er robust nok for gjentatte forsøk over en lengre tidsperiode, eller er begrenset til bruk i bedøvede mus. 1-3,7 Et rimelig alternativ protokoll for bygging av kronisk høy tetthet, transkranial elektrode array er demonstrert her.
Den signal tilnærmingen som er beskrevet her er ikke begrenset til EEG, men omfatter elektromyografiske signaler (EMG). Kjøpet av EMG-signaler kan være en komplementær måte for å definere oppførsel tilstand og er spesielt nyttig for søvn studier. Denne tilnærmingen gir en mellomting mellom dyre, ultra-high-density intrakranielle nett, og de begrensede bly tallene er mulig med tradisjonelle skrue elektroder som er utilstrekkelig for avanserte analyse tilnærminger. Den headpiece design er enkelt konstruert og rimelig for high-throughput studier. Bruk av dette oppkjøpet system i forbindelse med diverse genetiske eller farmakologiske manipulerende teknikker innenfor gnagermodeller kan bidra til å avdekke mekanismene for kortikal pendling generasjon, atferdsmessige avvik fra sann genotypiske forskjeller, kilde lokalisering av ERP og EPer, og store nettverk kommunikasjon.
Protocol
De som utføres i løpet av denne undersøkelsen studier var i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Pennsylvania.
1. headpiece design og konstruksjon
- Fjern hver åttende rad av pinner fra 2 x 50 pin murstein av en 100 stilling holderkontakten med en pinsett ved å skyve kontaktdelen av stiften gjennom plasten murstein.
Merk: Pins vendt nedover vil bli den orientering som vil bli referert til resten av protokollen. (Legg merke til dette spesielt i 2.6). - Dekk pinnene med et svært tynt lag med neglelakk for å isolere og la neglelakk tørke helt.
- Fjern neglelakk fra tuppen av pinnene med aceton og en liten klut.
- Trim overflødig plast av 2 x 7 er å bruke et barberblad eller wire-cutting pliers. Dette vil resultere i 2 x 7 klosser som er isolert langs lengden av tappene og eksponert på tappen tips. Disse vil etter hvert bli den transcranial EEG elektroder. To 2 x 7 klosser er nødvendig for en fullstendig kronisk elektrodesystem (figur 1A).
- Cut to 1 x 2 pinne klosser for EMG-signalet opptak. Bruk den samme prosessen med å fjerne uønskede pins med pinsett og kutte overflødig plast bort for å skape de 1 x 2 murstein. Sørg for at disse 1 x 2-er har en glatt side til dem fra den opprinnelige 100 Plassering Beholder som denne avstanden vil bli standard pin avstand for hver hovedstillingen slik at en enkelt adapter vil fungere for alle headpieces (Figur 1a).
- Bruk to-komponent epoxy til å feste 1 x 2 pin stykke til 2 x 7-pin stykke (figur 1D).
- Som begge settene av stifter må være i samme retning, epoxy 1 x 2 på den laterale side av begge halvdeler av hodestykket med de glatte sidene av 1 x 2 og 2 x7 i kontakt med hverandre. Juster 1 x 2 nålehull og pins med de bakre-mest 2 rader med pinner på 2 x 7.
Merk: De to halvdelene av hovedstillingen ikke epoksylimt sammen. Dette gir rom for fleksibilitet innenfor de to halvdelene av headpiece adapter for enklere tilkobling under tilvenning og under eksperimentelle dager (figur 1E). - La headpiece halvdeler kurere over natten. Ved ferdigstillelse, er headpiece bilateralt symmetriske. Hver halvdel består av en 2 x 7 tapp murstein med en sideveis forbundet med 2 x en tapp murstein som er i linje med den bakre fleste 2 p 2 x 7 tapp murstein.
- Som begge settene av stifter må være i samme retning, epoxy 1 x 2 på den laterale side av begge halvdeler av hodestykket med de glatte sidene av 1 x 2 og 2 x7 i kontakt med hverandre. Juster 1 x 2 nålehull og pins med de bakre-mest 2 rader med pinner på 2 x 7.
- Forbered ledninger for EMG-signalet opptak. Enkelt strandet, er 31 G perfluoralkoksy isolert sølv wire brukes til EMG-signalet opptak (figur 1D). Imidlertid flerkjedet eller annet metall ledninger kan erstattes hvis ønskelig.
- For å lage thorax EMG ledninger ta en 3,0 cm langt stykke perfluoralkoksy isolert sølv wire og remove 1 cm av plastbiten fra den ene enden med et barberblad. Pakk uisolert ledning rundt en pinsett to ganger. Fjern ledningen fra pinsett og fjerne 25 mm isolasjon på ikke-løkker ende med et barberblad.
- Å konstruere cervical EMG ledninger, gjenta prosessen med et 1,5 cm segment av wire. To livmorhals EMG ledninger og to thorax EMG ledninger er nødvendig for en komplett hovedstillingen.
- Fjerne den laterale tapp i den ytte fremre raden av begge Hode, noe som tilsvarer en stereotaksiske koordinater for 3,3 mm anterior av Bregma og 2,3 mm lateralt i Bregma, så er det ingen hjerne under denne posisjonen som bestemt ved en musehjerne atlas 20 (figur 2A).
- På begge headpiece halvdeler, kutt pinnene på 1 x 2 murstein til plast base av hodestykket med en avbiter (3,0 mm fra spissen av pinnen) og lodde cervical EMG ledningen til fremre pinnen og thorax EMG til bakre pi.
- Kontroller at hver pinne er elektrisk isolert. Utfør en kontinuitetstest med et digitalt multimeter ved å koble de to ledningene til voltmeter for forskjellige pins mens i kontinuitet modus. Elektrisk isolerte pins vil ikke produsere en hørbar pip med denne multimeter test; imidlertid, vil elektrisk koblet nålene. Dekk loddepunkter med neglelakk og en gang tørt, bøye EMG ledninger slik at de er parallelt med anterior / posterior aksen med minimal sideforskyvning.
- Trim pinner til en relativ lengde slik at de samsvarer med overflateprofilen av hjernen.
- Med aide av en mus hjernen atlas, rekord ventral avstand til hjernen overflaten fra Bregma for hver pin koordinere. 20 Pinnen som ventral avstand fra Bregma er den største vil tjene som indikator for pin trimming. Denne pin vil ikke bli trimmet mens alle andre pinner vil bli kuttet med hensyn til dette maksimal ventral avstand pin (tabell 1).
Merk: Pins kan slipes ned til størrelse, men det må gjøres nøye som friksjon mellom pinne og sliping hjul kan føre til at pinnene på headpiece å bøye. Hvis en pinne er bøyd, kan du bruke pinsett for å rette det ut. Et alternativ til sliping av pinnene ned til lengde, er å trimme dem med et par av ledning avbitertang.
- Med aide av en mus hjernen atlas, rekord ventral avstand til hjernen overflaten fra Bregma for hver pin koordinere. 20 Pinnen som ventral avstand fra Bregma er den største vil tjene som indikator for pin trimming. Denne pin vil ikke bli trimmet mens alle andre pinner vil bli kuttet med hensyn til dette maksimal ventral avstand pin (tabell 1).
- Dekke alle pinne tips med en sølv løsning ved hjelp av en sølv løsning penn og la tørke. Dette trinnet senker elektrode impedanser til ≤30 kÊ, noe som øker signal til støyforhold og samtidig eliminerer de skarpe kantene forårsaket fra pin trimming, derfor redusere sjansene for vevsskade og akselererende utvinning fra kirurgi. En ferdig headpiece halv vekter ca 0,5 g.
2. Adapter Bygg og Channel Mapping
- Kutt kontakten ledninger på 36 Posisjon Dual Row Mann Nano-Miniature Connector til en jevn lengde på 2 eller 3 cm med et barberblad. For hver ledning, strive av 2,5 mm isolasjon fra enden og tinn den eksponerte metall for hver ledning. Pass på når tinning å ha et enkelt, tynn tråd av fortinnet wire for hver nano-adapter ledning som dette er avgjørende å isolere nålene. Klipp av den strippede isolasjon med tråd-avbitertang (figur 1C).
- Lag et matchende male / male kontakten til headpiece med Conn Strip Header 2 x 50. Cut to 2 x 7 og to 2 x 1 er fra en 2 x 50 murstein. Fjern uønskede pins fra 2 x 50 murstein ved å bryte av en av de mannlige pins, og skyv den ubrutte andre halvdel av samme stykke av kontakten med en pinsett (figur 1B).
Merk: Den ene siden av disse pinnene vil tjene som adapter pins til å plugge inn hver stillingen, mens den andre halvparten vil bli loddet til de hermetiserte nano-kontakt ledninger. Sørg for å ha de flate plast kantene på 2 x 1 og 2 x 7 rørende å garantere riktig parring av male / male kontakt med headpiece opprettet i trinn1. - Lodd inn en av de første / referanse ledningene fra nano-kontakten til ønsket bakken / referanse pin. Ground og referanse ledninger er bundet sammen på RHD2132 forsterker chip. Bruk enkelt pin som er 0,60 mm anterior til Bregma og 1,00 mm sideveis av Bregma som både referanse og bakken. (Venstre hovedstillingen, medial tapp av det tredje mest fremre rad, men en hvilken som helst annen tapp kan bli tildelt hvis ønskelig, Figur 2.) Legg merke til at det er mulig å separere første og referanse på forsterkeren brikke ved å fjerne 0Ω motstand som binder jord og referanse sammen hvis isolere de to er ønsket.
- Lodde fortinnet nano kontaktledningene til samme side av den mannlige / hannkoblinger som bakken / referanse pin-tilkobling. Hver ledning kart til en bestemt kanal, så kanaloppsettet kan fullføres på dette tidspunktet. Kanal kart diagrammer for forsterkeren headstages er funnet på Åpne Ephys Wiki-område (https://open-ephys.atlassian.net/wiki/display/OEW/Home). Lodd den tilsvarende ledning hvis kanal er kjent for den respektive tapp for å oppnå den ønskede kartlegging.
- Klipp av ubrukte ledninger ved foten av nano-kontakt med ledning avbitertang.
- Bruk et voltmeter for å sikre at hver pinne er elektrisk isolert fra alle andre nålene. Når isolasjon er bekreftet, påfør et tynt lag med neglelakk rundt hver loddepunkt for ytterligere å isolere hver pin.
- Ved hjelp av to-komponent epoxy, forsterke matchende nano-adapter til de bilaterale 2 x 7 og 2 x 1 pins på de manns male murstein.
Merk: Det vil være to halvdelene til denne ene adapter som passer pinnen arrangement av hodestykket halvdeler opprettet tidligere. Det er viktig å sørge for at den mediale delen av hver halvdel av adapteren ikke har overskytende epoxy fylte plast kanten av male / male-kontakt, da dette vil hindre begge halvdelene av hovedstillingen blir plugget i samtidig. Ikke la noen epoxy å strømme til undersiden av pin adapter porsjon av adapteren, da dette ville også hindre riktige tilkoblingene. Bruk 2 headpiece halvdeler som en form for riktig kontaktpinnen justering. - Epoxy begge halvdeler av adapteren og epoxy bunnen av nano-kontakten for å øke holdbarheten. Sørg for å dekke alle loddeskjøter med epoxy. La adapteren kur over natten.
- Bekreftelse på riktig kanal kartlegging kan utføres ved hjelp impedansemålinger i Åpne-Ephys grafisk brukergrensesnitt (GUI). En ferdig adapter veier omtrent 1,3 g (figur 1F).
3. Surgery
- Forbered en steril kirurgisk felt.
- Bruk sterile hansker og annet personlig verneutstyr. Steriliser verktøy i en autoklav. Sterilisere stereotaktisk ramme med en 1,0 mm klordioksid løsning. Spray løsningen på rammen og vent 5 minutter før skylling med sterilt vann.
- Å sterilisere implanterbare headpiece deler, spray komponentene med en 1,0 mm klordioksid løsning, og vent 5 min før du skyller med sterilt vann. Plasser nå sterile implanterbare maskinvare i en steril petriskål.
- Få tak i en pre-kirurgisk vekt for musen, deretter anesthetize musen i en 200 ml induksjonskammeret ved hjelp av 1,5-2,0% isofluran i 100% oksygen. Bruke en strømningshastighet inn i kammeret på ca. 500 ml / min.
- Bekrefte tap av stabiliseringsrefleks ved å rotere induksjonskammeret. Fjern musen fra induksjonskammeret og sted inn i nesepartiet på den stereotaktisk ramme uten helt å sikre mus hode med øret stolpene. Fortsett å overvåke for riktig dybde av anestesi ved tå klype vurdering og samtidig vurdere vitale tegn.
- Opprettholde kroppstemperatur ved 37 ° C med en lukket sløyfe temperaturregulator, så som en rektal probe og varmepute-systemet. Dekk øynene av mus med oftalmisk øye salve før trimming av pelsenpå toppen av skallen bruker buede saks eller clippers. Desinfiser hodet med Betadine og la betadine tørke helt før du fortsetter.
- Administrere smertestillende og antibiotika sammen med væsker intraperitonealt. For en 25 g mus, 0,5 mg cefazolin, 0,125 mg meloksikam, 0,5 ml saltvann, og 2,5 mikrogram buprenorfin q 4-6 timer PRN.
- Injiser 250 mL 0,25% bupivakain subkutant langs midtlinjen på hodet, og injisere 100 mL 0,25% bupivakain subkutant på begge kinnbensbuer av musen.
- Fest mus i stereotaxic ramme og avsløre skallen.
- Fest hodet av musen med stereotaxic øret barer til stereotaxic rammen. Kontroller at musen er på en kirurgisk plan for anestesi ved å bekrefte fravær av tå klype refleks. Lag en 1,5-2,0 cm snitt sammen med en nr 11 disponibel skalpell langs midtlinjen av skallen. Snittet vil starte fra mellom øynene og fortsette baktil til bakhodet. </ Li>
- Expose skallen ved å spre huden lateralt med mikro klemmer. Redusere isofluran konsentrasjon fra 2,0% til en konsentrasjon som opprettholder en kirurgisk plan av anestesi, men ikke redusere til mindre enn 1,0% isofluran i 100% oksygen. Pre-operativ analgesi reduserer mengden av inhalert bedøvelse er nødvendig for å opprettholde en kirurgisk anestesidybden, og kan føre til hurtigere gjenvinning og forbedret overlevelse resultater.
- Nivå skallen og bore grad hull.
- Identifisere Bregma og nullstille stereotaktiske koordinater på Bregma, som blir opprinnelsen til koordinatsystem. For å utjevne hodeskalle i medial / lateral akse, flytte en utjevning sonde festet til en stereotaxic manipulator arm 1,50 mm lateralt i begge retninger fra Bregma og bekrefter at dorsal / ventrale dybden er mindre enn 0,05 mm når sonde kontakter venstre og høyre sider av skallen.
Merk: 10 mikrometer oppløsning på dorsal / ventral manipulator arm brukes i forbindelse med et digitalt koordinat skjerm forenkler utjevning. Planering anterior / posterior aksen Bregma følger samme teknikk. Forskjellen i den ventrale avstand for å kontakte Bregma og Lamda bør også være mindre enn 0,05 mm.- Juster skallen til nivellering er fullført i begge retninger, slik at det tverrgående planet er parallelt med bakken. Dette gjør det mulig for ekte stereotaktiske koordinater som sett i mus hjernen atlas. 20
- Med en 0,5 mm diameter mikroborekronen i en stereotaxic drill, drill Burr hull fra 3,30 mm anterior til 4,50 mm posteriort for Bregma i trinn på 1,30 mm på 1,00 mm lateralt til midtlinjen på begge halvdelene av skallen. For 2,30 mm laterale kolonner med elektroder, for å bore grad hull fra 2,00 mm anterior Bregma til 4,50 mm posteriort for Bregma i trinn på 1,30 mm på begge sider av midtlinjen (figur 2). Den høye nøyaktighet og presisjon som er nødvendig for denne drIlling operasjon forenkles ved 10 um oppløsning av et digitalt stereotaksisk manipulatorarm.
Merk: For at pinnene på hovedstillingen til riktig implanteres, må skallen på musen være på plass innen stereotaxic rammen. Hvis skallen beveger seg under boring, kan forskyvning av hodestykket og grad hull følge.
- Identifisere Bregma og nullstille stereotaktiske koordinater på Bregma, som blir opprinnelsen til koordinatsystem. For å utjevne hodeskalle i medial / lateral akse, flytte en utjevning sonde festet til en stereotaxic manipulator arm 1,50 mm lateralt i begge retninger fra Bregma og bekrefter at dorsal / ventrale dybden er mindre enn 0,05 mm når sonde kontakter venstre og høyre sider av skallen.
- Implantere headpieces.
- Med rette tang, forberede EMG tråd tunneler for thorax EMG ledninger. Hule 2,5 cm mellom hud og muskel i ryggen for både venstre og høyre EMG ledninger. Sett thorax og livmorhals EMGS inn i hulrommet laget med de rette tang første, og deretter manøvrere EEG murstein med buede tang slik at pinnene er i tråd med de tidligere borede grad hull.
- Legge litt press på hovedstillingen og vrikke pinnene inn i skallen. Pin diameter er 0,46 mm. Med isolerende neglelakk, vil pinnene passe tett i boret Burr holes. Hodestykket vil være stabil når den er riktig satt inn. Juster EMG ledninger til endelige posisjoner. Gjenta den samme prosessen for hodestykket på den andre siden.
- Fest headpiece på plass ved hjelp av dental sement.
- Når begge Hode er satt på plass, bland 1: 1 forhold av metylmetakrylat med sin tverrbindingsforbindelse. Påfør blandingen slik at det dekker den eksponerte skallen, spiker-polert deler av pinneelektroder og proksimale delen av EMG ledninger, men dekker ikke de kvinnelige beholdere av hovedstillingen.
- Pass på å ikke få sement på pels. Ikke la for rygger av sement for å danne at musen skal være i stand til å gripe inn. Sørg for tilstrekkelig tid til sement for å tørke, og deretter fjerne musen fra stereotaktisk ramme. Den totale vekt som musen vil måtte bære er fra 2 halvdeler av hodestykket og den sikre sement er ca. 1,2 g.
- Plasserer dyret i en renutvinning området.
- Oppretthold kjernen kroppstemperatur med en varmepute. Overvåk musen til det gjenvinner alle posturale reflekser, som betegner veksten fra anestesi. Individuell boliger anbefales for langsiktig utvinning.
- Daglig overvåking i minst 3 dager etter operasjonen anbefales med intervensjons analgesi. Tillat 10-14 dagers restitusjon etter operasjonen før du starter en tethered tilvenning periode.
4. tilvenne Dyr til deling
- Koble adapteren til musen bruker mus hodestøtte (figur 1G-H). Hold på motsatte hjørner av headpieces som er sementert på plass med buede hemostats når musen er behersket og sakte sett adapteren pinnene i implanterte stillingen på begge sider.
- Koble den 32 kanals forsterker til adapteren (figur 1 H). Sørg for å justere logoene på både adapteren og forsterker i en consistent orientering for både adapter og forsterkeren for å forhindre kanal-kartlegging feil. Koble forsterkeren til en standard serie perifer grensesnitt (SPI) kabel RHD2000. Denne kabelen vil koble til oppkjøpet system for signal opptak.
- Plasser musen inne i et kammer som har en utkraget arm montert på kammerveggen. Fest SPI-kabelen til brakettarmen og justere spenningen i brakettarmen for å motvirke vekten av den forankrede kabel. Musen er i stand til å bevege seg fritt og er tilvendt for en time om dagen i uken før opptak.
- For å koble fra musen, bare koble kabelen og adapteren fra mus mens du bruker en flat rustfritt stål mikro slikkepott til aide i å koble adapteren fra musen.
5. Signal Extraction System Setup / Signal Recording
- Plugg den konstruerte adapteren i headpiece av en implantert mus. Koble en heads forsterker til adapteren ogfeste en standard SPI-kabelen til forsterkeren og til oppkjøpet styret. Har SPI kabel feste til en skikkelig strammet cantilever slik at den ekstra vekten på musen hode er minimert.
- Plasser en lokal Faraday bur, laget ved hjelp av å gjennomføre netting eller aluminiumsfolie, rundt heads og jorde lokale Faraday bur.
- Skaff elektrode impedanser før begynnelsen av hvert opptak ved å velge en 30 KS / s samplingsfrekvens og måle impedanser via modulen i GUI. En impedans-verdi mindre enn eller lik 10 kohm for en enkelt tapp er nødvendig for bekreftelse av riktig elektrodekontakt. Høyere impedansverdier som resulterer i avvist data fra den elektrode.
- For opptak, skape et signal kjede av Rhythm FPGA, båndpassfilter, og LFP seer i GUI. Det anbefales å velge en samplingsfrekvens på 1,00 KS / s, båndbredde på 0.1-7,500 Hz og fjerner markeringen DSP. Sett båndpassfilter til 0,1 til 250 Hz og vise kanalene etter opfors- LFP betrakteren. 250 og 400 uV kanal amplituder med uavgjort metode valgt beste visualiserer dataene.
- Begynne innspillingen bruke GUI. Opprett en ny mappe for hvert opptak og sette banen for lagring av filer til denne mappen. For å starte et opptak bare trykke posten. Alle 32 kanaler fra kontakten blir registrert som standard, men uønskede kanaler kan opphevet valget ved å klikke på høyre side av Rhythm FPGA-modulen før begynnelsen av opptaket.
- Importere data til Matlab for analyse. Det finnes et mangfold av åpen kildekode-verktøykasser som kan brukes til å hjelpe i analysen.
Representative Results
Sample data registrert i et fritt bevegelige mus implantert med en høy tetthet EEG hodestykket er vist i figur 3. Individuelle EEG-bølgeformer som tilsvarer den kanalkartlegging skjemaet vist i figur 2. Eksempler på cervical og torakal EMG er også vist i figur 3. Legg merke til at bryst EMG registrering inneholder også innebygd elektrisk aktivitet som oppstår i mus hjerte som blir innlysende når en differensialsignal mellom de to thorax EMG ledninger (t) blir beregnet. Med dette opptak er det også mulig å beregne musens hjertefrekvensen ved å måle tiden mellom elektrokardiografiske QRS-toppene. 23-24 På samme måte er det mulig å måle musens respirasjonsfrekvens ved å beregne fasisk variasjon av QRS pigg som brysthulen ekspanderer og kontrakter med hvert åndedrag. 25 Derfor dette oppsettet tillatelser for erverv of murine polysomnografi. Videre gjør oppsettet cortical kartlegging av visuelle fremkalt respons (figur 4). Når en 10 ms puls av lys blir levert bare til musens venstre øye blir klassiske reaksjoner registrert i den kontralaterale (men ikke ipsilaterale) primære visuelle cortex som er etterfulgt av en forsinket reaksjon i kontralateral sekundære visuelle cortex. Filmen innebygd i Figur 4 viser den tidsvarierende elektriske potensialer på tvers av hele kortikale overflaten sammen med kurvene på aktivitet i kontralateral V1 og V2.
| AP | ||||||
| 3.3 | 0 | 0 | ||||
| 2 | 0.4 | 0.6 | 0.6 | 0.4 | ||
| 0.7 | 0.6 | 0.9 | 0.9 | 0.6 | ||
| -0,6 | 0.9 | 1 | 1 | 0.9 | ||
| -1,9 | 1 | 1.1 | 1.1 | 1 | ||
| -3,2 | 3 | 1 | 1 | 1 | 1 | 3 |
| -4,5 | 3 | 0.7 | 0.7 | 0.7 | 0.7 | 3 |
| ML | -2,3 | -1 | 1 | 2.3 |
Tabell 1:. Pin Trimming Lengder Denne figuren viser de nødvendige trimming lengder i mm, per pin for hovedstillingen. Lengder for pin trimming ble kjøpt fra en mus hjernen atlas. After trimming pins, den headpiece matcher overflateprofil på hjernen. 20 EMG pinnene er helt avskåret så ledningene brukes til å registrere EMG-signalet er loddet på pinnen spire.
Figur 1:. Headpiece Components, Intermediate Byggtrappen og Riktig tilkobling for opptak Denne figuren viser råstoffet som brukes til å lage headpieces. Starter med en 100 pin beholder connecter, er mindre 2 x 7 og 2 x 1 komponenter opprettet. Merk at i 2 x en komponent, er den opprinnelige kant av 2 x 50 intakt, noe som tillater konsistent stillingen konstruksjon og gjør det mulig for en adapter for tilkobling til mange implanterte mus. Figur 1B og 1C presentere de råstoffer som er nødvendige for å skape adapteren fra hodestykket til forsterkeren. 1B viser hodestykket enden avadapteren som på samme måte er kuttet ned til å koble til headpiece. Legg merke til at det 2 x 1 har igjen en original kant fra den rå komponenten, noe som sikrer riktig forbindelse mellom adapteren og hodestykket. Figur 1C viser enden av adapteren som kobles til forsterkeren. Figur 1D illustrerer epoksylimt 2 x 7 og 2 x 1 komponenter sammen med preparerte EMG ledninger for signal innspilling. Figur 1E viser en fullført hovedstillingen. Figur 1F viser en ferdig adapter. Figur 1G viser en skikkelig forbindelse mellom headpieces og adapteren. Til slutt viser figur 1H implantert mus med tilkoblet adapter og forsterker. Forsterkeren chip er koblet til en grensesnittkabel som går til anskaffelse brett (ikke vist). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Elektrode Montage og fullt Konstruert headpiece Denne figuren viser elektrodeplassering i forhold til mus hjernen. Elektrode steder er basert på stereotaxic koordinater fra Bregma. Koordinater for hver elektrode kan bli funnet i trinn 4.8 i protokollen. Elektrode farge svarer til de underliggende områder av hjernen for hver elektrode. Hvit = frontal foreningen cortex (FRA), Orange = primære motor cortex (M1), Rosa = sekundær motor cortex (M2), Mørkegrønn = primære somatosensoriske cortex, forbena region (S1FL), Grønn = primære somatosensoriske cortex, dysgranular sone (S1DZ ), Lysegrønn = primære somatosensoriske cortex, fat feltet (S1BF), Gul = mediale parietal foreningen cortex (MPTA), Dark Blue = primære visuelle cortex (V1) Lyseblå = sekundær visuell cortex, mediomedial område (V2MM), Black = retrosplenial dysgranular cortex (RSD). 20 Common Reference / Ground vises også. Denne referansen ordningen reduserer luft artefakt innenfor rå signal. Tall knyttet til hver enkelt elektrode gi en kanal kart for hele array. Bilde forandret fra Allen Mouse Brain Atlas. 21,22 Figur 2B viser en fullt konstruert headpiece å skalere i forhold til en krone. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Eksempel på EEG og EMG Traces fra elektroden Montage elektrode kurver tilsvarer kanalen kartlegging vist i figur 1A.. Cervical EMG (C) gjør det mulig å bestemme nuchal muskeltonus (+). EMG-signaler inneholder også hjerte QRS elektriske impulser(*). Skala barer av 200 uV for spor amplitude og 1 sek for spor varighet vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Romlig fordeling av Visual evoked potensial Romlig fordeling av fremkalt potensial følgende anvendelse av en ensidig lys flash kun administreres til venstre øyet.. Øvre diagram som viser høy tetthet EEG montasje hver ring representerer en elektrode. Endringen i farge over tid svarer til spenning endringer over tid for hver respektive elektrode. Ved tid = 0 msek, er en 10 msek lyspuls levert og representert i midten figuren. Bottom grafisk illustrerer bety fremkalt potensielle spor for kontralaterale V1 og V2 EEG elektroder (n = 108 EP studier). lys pulSE skjer på 0 ms. Legg merke til at den tilsvarende evoked potensial respons er observert i kontralaterale V1 (svart kurve), etterfulgt av en lengre ventetid evoked potensial respons i kontralaterale V2 (rød kurve). (Høyreklikk for å laste ned).
Discussion
Den lave kostnader konstruksjon og kirurgiske nødvendige skritt for å riktig oppnå en 26 kanal, høy tetthet EEG montage i en mus er beskrevet. Riktig epidural elektrodekontakt er kritisk i å skaffe kvalitet EEG-signaler i dette systemet. To skritt innenfor protokollen løse dette problemet: pin trimming å matche hjernen kontur, og headpiece implantasjon før akryl forsterkning. Det er viktig ikke å kutte en pin for kort i byggefasen. Når implantere headpieces, er det viktig å sjekke pin plassering før den endelige akryl forsterkning. En måte for å bekrefte riktig elektrodekontakt er gjennom impedans testing. Tilsynelatende, impedanser av 5-10 kÊ foreslå riktig epidural plassering. 26 Impedansmålinger demonstrere Hode 'holdbarhet, som elektrode impedansverdier er stabile innenfor dette 5-10 kohm område i minst 4 måneder etter implantasjon. Den andreviktig skritt innebærer samkjøre EMG pins med de to bakre-fleste rader med 2 x 7 EEG murstein. Dette er avgjørende for adapter tilkobling, som feiljustert EMG og EEG pins vil resultere i en manglende evne til å koble adapteren eller bøyde adapter nålene.
En stor fordel med denne innhentingssystemet som er enkel å modifisere formen av elektrodegruppen for å optimalisere ulike eksperimentelle behov. Tilpassede elektrode ordninger som er optimalt tilpasset spesifikke eksperimenter lett kan opprettes. Tilpasning for spesifikke eksperimenter kan potensielt kombinere EEG med kanyle for levering av legemidler for kombinert farmakologiske, elektroencefalografiske, og atferdsstudier. 27 Hodepynt, adaptere, og kirurgiske prosedyrer er lett tilpasses til en lang rekke studier ved følgende metodene beskrevet i protokollen ovenfor . En annen stor fordel med dette oppkjøpet system er dens lave kostnader. I dag kan dette oppkjøpet systemrekord 128 inngangskanaler på opp til 4 separate kabler, tillater samtidige opptak fra 4 mus eller hvis det er ønskelig, rotter med rutenett høyere tetthet. En slik utvidelse vil bare kreve ekstra kabler og adaptere.
Denne tilnærmingen til høy tetthet EEG anskaffelse adresserer ulempene ved andre høy tetthet EEG innhentingsmetoder på mus. Systemet som er beskrevet i dette arbeidet er enkelt og greit konstruert med enkle materialer og bruker fri maskinvare og programvare som er billig og stabil, gir mulighet for gjentatte målinger på det samme dyret over måneder, tillater fri bevegelse under et eksperiment, og krever ikke mus å være bedøvet for innspilling. Begrensninger av dette systemet er at det bare har blitt validert hittil i mus som veier 20 g eller mer, og er eldre enn 12 uker. Mindre eller yngre mus kan ha problemer med headpiece implantasjon. En sekundær begrensning av denne metodikken er manglende evne til nøyaktig kontroll elektrode dybde etter headpiece fabrikasjon. Dette gjelder imidlertid samme begrensningene til tradisjonelle skru EEG elektroder siden det er ingen måte å nøyaktig vite pre-mortem innskruingsdybden forhold til kortikale overflaten. Feilsøker for denne fremgangsmåte vanligvis innebærer ordentlig skjerming interfererende signal fra musen når bundet for å oppnå støyfri signal.
Høy tetthet EEG arrays er avgjørende for de komplekse tid og rom analyser av EEG data som er den nye normalen i moderne EEG tolkning. Mens romlige fordelingen av en visuell fremkalt potensial er illustrert, kan data ervervet ved hjelp av dette systemet bli analysert ved hjelp av elektrisk kildebildeteknikker og nevrale tilkoblings tiltak. En 60% til 70% reduksjon i kontaktområdet mellom disse elektrodenåler i forhold til tradisjonelle skrue kontakter gir en mer presis lokalisering signal, som vist i figur 4. Ansette høy tetthet analytiske teknikker innen genetisk modifiserte mus, etter Pharmacological intervensjon, eller dyr med iboende patologi som anfall kan hjelpe skjelne de mekanismene som genererer spesifikke cortical svingninger, lokalisere kildene til ERP og EPer, og avslører store nettverksegenskaper. Ved å bedre parallelt menneskelige systemer, vil denne tilnærmingen forbedre små dyremodeller for menneskelig nevrofysiologi og nevropatologi, som gir enklere oversettelse av funn gjort i gnagermodeller til vitenskapelig og klinisk relevans hos mennesker.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32 Channel RHD2132 amplifier headstage | Intan Technologies | C3314 | |
| Aquistion Board | Open Ephys | v2.2 | |
| 100 Position Receptable Connector | Digi-Key | ED85100-ND | Headpiece |
| Acetone (1 L) | Sigma Aldrich | 179973-1L | |
| Razor Blade (100 pack) | McMaster Carr | 3962A4 | |
| Wire-Cutting Pliers | MSC Industrial | 321786 | |
| 2-Part Epoxy | McMaster Carr | 7605A18 | |
| PFA Coated Silver Wire (25 ft) | A-M Systems | 787000 | EMG Wire |
| CircuitWriter Pen | MCM Electronics | 200-175 | Silver Applicator for Electrode Tips |
| 36 Position Dual Row Male Nano-Miniature Connector | Omnetics Connector Corporation | A79028-001 | Headpiece to Amplifier Adapter |
| Conn Strip Header 2 x 50 | Digi-Key | ED83100-ND | Headpiece to Amplifier Adapter |
| Clidox Base and Acitvator | Pharmacal | 95120F & 96120F | Sterilant |
| Isoflurane | Priamal Enterprises Ltd | 66794-019-10 | |
| Oxygen | Airgas | OX USP300 | |
| Closed Loop Temperature Controller | CWE Inc. | 08-130000 | |
| Curved Scissors | FST | 14085-09 | |
| 0.25% Bupivicaine Hydrochloride | Hospira | 0409-1159-02 | Local Anesthetic |
| Meloxicam 5mg/ml | Henry Schein | 6451602845 | Pain/Inflammation Relief |
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | 0409-4888-20 | Fluids |
| Cefazolin | Hospira | 0409-0806-01 | Antibacterial |
| No.11 Disposable Scapel (20 pk) | Feather | 2975#11 | |
| Micro Serrefines | FST | 18052-3 | |
| Cotton Swabs (1,000 pk) | MSC Industrial | 8749574 | |
| 0.5 mm Micro Drill Bit | FST | 19007-05 | |
| Stereotaxic Drill | Kopf | Model 1471 | |
| Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | |
| Methyl Methacrylate | A-M Systems | 525000 | Cement for headpiece |
| Methyl Methacrylate Crosslinking Compound | A-M Systems | 526000 | |
| Curved Hemostats | FST | 13003-10 | Aide in Adapter Connection |
| RHD2000 standard SPI interface cable (3ft) | Intan Technologies | C3203 | |
| Cantilever Arm | Instech | MCLA | |
| Micro Spatula (12 pk) | Fischer Scientific | S50822 | |
| Digital Soldering Station | MCM Electronics | 21-10115 | |
| Rosin Core Solder 60/40 Tin/Lead | MCM Electronics | 21-1045 | |
| Color Craze Nail Polish with Hardeners (Nitrocellulose based) | L.A. Colors | CNP508 | |
| Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console | Kopf | Model 940 |
References
- Choi, J. H., Koch, K. P., Poppendieck, W., Lee, M., Shin, H. -S. High resolution electroencephalography in freely moving mic. J. Neurophysiol. 104 (3), 1825-1834 (2010).
- Lee, M., Kim, D., Shin, H., Sung, H., Choi, J. H. High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode. J Vis Exp. (47), e2-e5 (2011).
- Megevand, P., Quairiaux, C., Lascano, A. M., Kiss, J. Z., Michel, C. M. A mouse model for studying large-scale neuronal networks using EEG mapping techniques. Neuroimage. 42 (2), 591-602 (2008).
- Sabourin, M. E., Cutcomb, S. D., Crawford, H. J., Pribram, K. EEG correlates of hypnotic susceptibility and hypnotic trance: spectral analysis and coherence. Int J Psychophysiol. 10 (2), 125-142 (1990).
- Miller, E. K., Wilson, M. A. All My Circuits: Using Multiple Electrodes to Understand Functioning Neural Networks. Neuron. 60 (3), 483-488 (2008).
- Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
- Kipke, D. R., et al. Advanced Neurotechnologies for Chronic Neural Interfaces: New Horizons and Clinical Opportunities. J Neurosci. 28 (46), 11830-11838 (2008).
- Logothetis, N. K., Kayser, C., Oeltermann, A. In Vivo Measurement of Cortical Impedance Spectrum in Monkeys: Implications for Signal Propagation. Neuron. 55 (5), 809-823 (2007).
- Michel, C. M., et al. Electric source imaging of human brain functions. Brain Res Rev. 36 (2-3), 108-118 (2001).
- Mitzdorf, U. Current source-density method and application in cat cerebral cortex: investigation of evoked potentials and EEG phenomena. Physiol Rev. 65 (1), 37-100 (1985).
- Cook, I. A., O'Hara, R., Uijtdehaage, S. H. J., Mandelkern, M., Leuchter, A. F. Assessing the accuracy of topographic EEG mapping for determining local brain function. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 107 (6), 408-414 (1998).
- Teplan, M. Fundamentals of EEG measurement. Meas Sci Rev. 2, 1-11 (2002).
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. a, Koch, C. The origin of extracellular fields and currents- EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Kahana, M. J. The Cognitive Correlates of Human Brain Oscillations. J Neurosci. 26 (6), 1669-1672 (2006).
- Olejniczak, P. Neurophysiologic basis of the EEG. J Clin Neurophysiol. 23 (3), 186-189 (2006).
- Thut, G. Modulating Brain Oscillations to Drive Brain Function. PLoS Biol. 12 (12), 1-4 (2014).
- Buzsáki, G., Draguhn, A. Neuronal Oscillations in Cortical Networks. Science. 304, 1926-1929 (2004).
- Crick, F., Koch, C. Towards a neurobiological theory of consciousness. Semin Neurosci. 2, 263-275 (1990).
- Murakami, S., Okada, Y. Contributions of principal neocortical neurons to magnetoencephalography and electroencephalography signals. J Physiol. 575 (3), 925-936 (2006).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 3rd ed. , Elsevier. New York. (2007).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Allen Mouse Brain Atlas. , Allen Institute for Brain Science. Available from: http://mouse.brain-map.org (2015).
- Berger, R. D., Akselrodv, S., Gordon, D., Cohen, R. J. An Efficient Algorithm for Spectral Analysis of Heart Rate Variability. IEEE Trans Biomed Eng. 33 (9), 900-904 (1986).
- Pan, J., Tompkins, W. J. A Real-Time QRS Detection Algorithm. IEEE Trans Biomed Eng. 32 (3), 230-236 (1985).
- Moody, G. B., Mark, R. G., Zoccola, A., Mantero, S. Derivation of Respiratory Signals from Multi-lead ECGs. Comput Cardiol. 12, 113-116 (1985).
- Thongpang, S., Richner, T. J., Brodnick, S. K., et al. A Micro-Electrocorticography Platform and Deployment Strategies for Chronic BCI Applications. Clin EEG Neurosci. 42 (4), 259-265 (2011).
- Laird, H. E. I., Hermansen, J. E., Huxtable, R. J. An electrode-cannula unit for intracerebral electrical stimulation, EEG recording and drug administration in small animals. Pharmacolgy Biochem Behav. 10 (2), 429-431 (1979).
