Abstract
Avanzate tecniche di analisi elettroencefalografici che richiedono alta risoluzione spaziale, tra cui l'imaging fonte elettrica e misure di connettività di rete, sono applicabili a una varietà crescente di domande nel campo delle neuroscienze. L'esecuzione di questo tipo di analisi in un modello di roditore richiede una maggiore densità di elettrodi di elettrodi a vite tradizionali possono realizzare. Mentre esistono alta densità montaggi elettroencefalografici per i roditori, sono di limitata disponibilità di molti ricercatori, non sono abbastanza robusto per esperimenti ripetuti per un periodo prolungato di tempo, o sono limitate da utilizzare per roditori anestetizzati. 1-3 Una proposta di basso costo metodo per la costruzione di un bene durevole, alto-count, transcranica matrice di elettrodi, composto da testate bilateralmente impiantabili è indagato come un mezzo per eseguire avanzate elettroencefalogramma analisi nei topi o ratti.
Procedure per la testata fabbricazione e chirurgica l'impianto necessary per la produzione di elevato rapporto segnale a rumore, elettroencefalografico bassa impedenza e segnali elettromiografici sono presentati. Mentre la metodologia è utile in entrambi i ratti e topi, questo manoscritto si concentra sulla realizzazione più impegnativo per il cranio del mouse più piccolo. Liberamente topi in movimento sono legati solamente ai cavi tramite un adattatore comune durante la registrazione. Una versione di questo sistema di elettrodi che comprende 26 canali elettroencefalografici e 4 canali elettromiografici è descritto di seguito.
Introduction
attività neuronale può essere registrato extracellulare con diversi livelli di granularità da microscopiche (singoli potenziali d'azione) per mesoscopiche (potenziali di campo locale) a macroscopica (elettroencefalogramma). Queste tracce di onde cerebrali sono classicamente analizzati nel dominio della frequenza per caratterizzare comportamentali, neurofisiologici, o stati elettrofisiologiche. Questo può essere fatto con un unico biopotenziale, 4 ma le registrazioni densità EEG sparse non può risolvere la componente spaziale di attività neuronale. Moderna analisi elettroencefalogramma si basa su più di elettrodi per la produzione di mappe dettagliate della distribuzione spazio-temporale delle attività corticale al fine di correlare l'attività con le condizioni psicologiche specifiche e processi fisiologici. 5-7 due delle categorie più comunemente usati di analisi impongano montaggi EEG ad alta densità sono Imaging Source elettrica e misure di connettività di rete neurale. 8-11
12-15 Dal EEG è ad alta risoluzione temporale, studi EEG consentire la valutazione in tempo reale di ERP e EP così come temporalmente precisa analisi post hoc. 3,11 , 12
L'associazione di stati e funzioni cognitive con l'interazione di oscillazioni visto sul elettroencefalogramma è l'obiettivo finale delle varie misure di connettività di rete neurale. Numerosi studi hanno dimostrato la sincronizzazione e il blocco fase di oscillazioni tra le diverse regioni del cervello sono associati a specifici stati di eccitazione, l'attenzione e l'azione. 6,13,14,16-19
localizzazione delle sorgenti e la rete analisi dei segnali EEG origine con studi negli esseri umani, ma le indagini la base neuronale per questi segnali necessariamente coinvolgono modelli animali, in quanto richiedono tecniche invasive che sono altrimenti impossibili negli esseri umani. Al fine di replicare tali analisi nei modelli di roditori, è necessario un metodo per l'acquisizione di segnali EEG ad alta densità nel cervello di un roditore. Mentre altri gruppi hanno costruito array di microelettrodi ad alta densità per l'uso nei topi, questi approcci sono di limitata disponibilità di ricercatori senza accesso alle strutture di nanofabbricazione, non sono abbastanza robusto per esperimenti ripetuti per un periodo prolungato di tempo, o sono limitate da utilizzare anestetizzato topi. 1-3,7 Un basso costo protocollo alternativo per la costruzione cronica ad alta densità, transcranica elettrodo ARRAy è dimostrata qui.
L'approccio acquisizione del segnale qui descritto non è limitato a EEG, ma include segnali elettromiografici (EMG). Acquisizione di segnali EMG può essere un approccio complementare per la definizione dello stato comportamento ed è particolarmente utile per gli studi di sonno. Questo approccio fornisce un intermedio tra costoso, ultra-alta densità griglie intracranici, e il numero di piombo limitati possibili con elettrodi a vite tradizionali che sono insufficienti per gli approcci di analisi avanzate. Il design casco è facilmente costruito e alla portata di studi ad alto rendimento. L'utilizzo di questo sistema di acquisizione in collaborazione con assortiti tecniche di manipolazione genetica o farmacologici entro modelli di roditori possono aiutare a scoprire i meccanismi di generazione corticale oscillazione, divergenze di comportamento da vere differenze genotipiche, localizzazione fonte di ERP e EP, e la comunicazione di rete su larga scala.
Protocol
Gli studi condotti in tutta questa indagine erano d'accordo con il National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio e approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali presso l'Università della Pennsylvania.
1. copricapo Progettazione e Costruzione
- Rimuovere ogni otto fila di pin del pin mattoni 2 x 50 di un connettore ricettacolo 100 posizione con un paio di pinzette spingendo la parte femmina del perno attraverso il mattone plastica.
Nota: Perni rivolte verso il basso sarà l'orientamento che farà riferimento per il resto del protocollo. (Prendete nota di questo in particolare in 2.6). - Coprire i perni con un leggero strato di smalto per isolare e lasciare che lo smalto asciughi completamente.
- Rimuovere lo smalto dalle punte dei perni con acetone e un piccolo panno.
- Tagliare l'eccesso di plastica del 2 x 7 di utilizzare una lama di rasoio o filo-taglio pliers. Questo si tradurrà in 2 x 7 mattoni che sono isolati lungo la lunghezza dei perni e esposti alla punta del perno. Questi diventeranno gli elettrodi EEG transcranica. Due 2 x 7 mattoni sono necessari per un completo allineamento elettrodo cronica (Figura 1A).
- Tagliate due 1 x 2 mattoni pin per la registrazione del segnale EMG. Utilizzare lo stesso processo di rimozione perni indesiderati con le pinzette e tagliare l'eccesso di plastica via per creare i mattoni 1 x 2. Assicurarsi che questi 1 x 2 sono un lato liscio per loro dall'originale 100 Posizione Presa come questa distanza sarà la distanza di pin standard per ogni testata per cui un singolo adattatore funzionerà per tutte le testate (Figura 1A).
- Utilizzare 2-parte epossidica per fissare il pezzo pin 1 x 2 al pin pezzo 2 x 7 (Figura 1D).
- Poiché entrambi i gruppi di perni devono essere nello stesso orientamento, epossidico 1 x 2 sulla parte laterale di due metà del casco con i lati lisci dei 1 x 2 e 2 x7 contatto tra loro. Allineare le 1 x 2 fori e perni con la parte posteriore-la maggior parte delle 2 file di perni sul 2 x 7.
Nota: Le due metà del casco non sono Epossidico insieme. Ciò consente flessibilità entro i due metà dell'adattatore casco collegamento facile durante assuefazione e durante i giorni sperimentali (Figura 1E). - Lasciate che le due metà copricapo cura durante la notte. Al termine, la testata è a simmetria bilaterale. Ogni mezzo è costituito da un perno mattoni 2 x 7 con un lateralmente divisoria 2 x 1 pin mattoni che è in linea con la maggior parte posteriore 2 righe del perno mattoni 2 x 7.
- Poiché entrambi i gruppi di perni devono essere nello stesso orientamento, epossidico 1 x 2 sulla parte laterale di due metà del casco con i lati lisci dei 1 x 2 e 2 x7 contatto tra loro. Allineare le 1 x 2 fori e perni con la parte posteriore-la maggior parte delle 2 file di perni sul 2 x 7.
- Preparare i fili per la registrazione del segnale EMG. Singolo filamento, 31 G filo d'argento perfluoroalkoxy isolamento viene utilizzato per la registrazione di EMG del segnale (Figura 1D). Tuttavia, multi-incagliato o altri cavi di metallo può essere sostituito se lo si desidera.
- Per creare fili EMG toraciche hanno una lunga 3.0 cm pezzo di filo d'argento perfluoroalkoxy isolamento e REMove 1 cm dell'isolamento di plastica da una estremità con una lama di rasoio. Avvolgere il filo non isolato attorno ad una coppia di pinzette due volte. Rimuovere il filo dalla pinza e rimuovere 25 mm di isolamento sull'estremità non-loop con una lama di rasoio.
- Per costruire fili EMG cervicale, ripetere il processo con un segmento di 1,5 centimetri di filo. Due fili EMG cervicali e due fili EMG toracici sono necessari per un copricapo completo.
- Rimuovere il perno laterale nel lontano fila anteriore di entrambe le testate, che corrisponde ad una stereotassica coordinate di 3,3 millimetri anteriore Bregma e 2,3 mm lateralmente di Bregma, in quanto non vi è alcuna cervello sotto di questa posizione come determinato da un atlante cervello di topo 20 (Figura 2A).
- Su entrambe le metà copricapo, tagliare i perni del mattoncino 1 x 2 alla base plastica della testata con un paio di tronchesi (3,0 mm dalla punta del perno) e saldare il filo EMG cervicale al perno anteriore e toracica EMG al posteriore pin.
- Verificare che ogni pin è isolato elettricamente. Eseguire un test di continuità con un multimetro digitale collegando i due conduttori del voltmetro a diversi perni in modalità di continuità. Elettricamente perni isolati non produrranno un segnale acustico con questo test multimetro; tuttavia, i perni accoppiati elettricamente farà. Coprire i giunti saldati con smalto per unghie e una volta asciutto, piegare i fili EMG tale che essi sono in parallelo all'asse anteriore / posteriore con spostamento laterale minima.
- perni Trim per una lunghezza relativa tale che corrispondano al profilo superficie del cervello.
- Con l'aiutante di un mouse atlante del cervello, record di distanza ventrale di superficie del cervello da Bregma per ogni pin di coordinate. 20 Il perno la cui distanza dal ventrale Bregma è il più grande servirà come indicatore per il pin taglio. Questo pin non sarà tagliata, mentre tutti gli altri perni saranno tagliati rispetto a questo pin distanza massima ventrale (Tabella 1).
Nota: Perni può essere macinato fino a dimensioni ma deve essere fatto con attenzione come l'attrito tra perno e mola può causare i piedini del casco per piegare. Se un pin è piegato, utilizzare una pinzetta per raddrizzare fuori. Un'alternativa alla macinazione dei perni giù lunghezza è tagliare loro con un paio di pinze taglio filo.
- Con l'aiutante di un mouse atlante del cervello, record di distanza ventrale di superficie del cervello da Bregma per ogni pin di coordinate. 20 Il perno la cui distanza dal ventrale Bregma è il più grande servirà come indicatore per il pin taglio. Questo pin non sarà tagliata, mentre tutti gli altri perni saranno tagliati rispetto a questo pin distanza massima ventrale (Tabella 1).
- Coprire tutti i suggerimenti pin con una soluzione d'argento con una penna d'argento soluzione e lasciare asciugare. Questo passaggio abbassa impedenze dell'elettrodo a ≤30 kΩ, che aumenta il rapporto segnale rumore e contemporaneamente elimina gli spigoli causati dal pin rifilatura, quindi facendo diminuire le probabilità di danno tissutale e accelerare il recupero da un intervento chirurgico. Un copricapo completati mezzo pesi circa 0,5 g.
2. Adattatore Edilizia e Assegnazione dei canali
- Tagliare i fili del connettore di un connettore a 36 posizioni doppia fila Maschio Nano-Miniature ad una lunghezza uniforme di 2 o 3 cm usando una lama di rasoio. Per ogni filo, strip off di 2,5 mm di isolamento dalla fine e lo stagno del metallo esposto per ogni filo. Assicurarsi che quando stagnatura di avere un unico filo sottile di filo in scatola per ogni filo adattatore nano come questo è fondamentale per isolare i pin. Tagliare la coibentazione spogliato con pinze a filo-taglio (Figura 1C).
- Creare un corrispondente connettore maschio / maschio alla testata utilizzando il Conn Striscia intestazione 2 x 50. Tagliate due 2 x 7 e di due 2 x 1 di da un 2 x 50 mattoni. Rimuovere perni indesiderati dal 2 x 50 mattone rompendo uno dei perni maschi, e poi spingere la ininterrotta seconda metà dello stesso pezzo fuori il connettore con un paio di pinzette (Figura 1B).
Nota: Un lato di questi perni servirà come perni adattatori per collegare in ciascuna testata, mentre l'altra metà sarà saldato ai fili del connettore nano scatola. Assicuratevi di avere i bordi di plastica piane del toccante 2 x 1 e 2 x 7 per garantire il corretto accoppiamento del connettore maschio / maschio con la testata creata nel passaggio1. - Saldare su uno dei cavi di terra / di riferimento dal connettore nano al pin terra / di riferimento desiderato. cavi di terra e di riferimento sono legati insieme sul chip dell'amplificatore RHD2132. Utilizzare l'unico perno che è 0,60 millimetri anteriore a Bregma e 1,00 mm lateralmente di Bregma sia come riferimento e la terra. (Casco sinistra, pin mediale della terza fila più anteriore, tuttavia, qualsiasi altro perno potrebbe essere assegnato se si preferisce, figura 2) Si noti che è possibile separare terra e riferimento sul chip dell'amplificatore rimuovendo il resistore 0Ω che lega terra e riferimento insieme se isolando i due è desiderato.
- Saldare i fili di collegamento nano in scatola sullo stesso lato dei connettori maschio / maschio, come la connessione pin di terra / di riferimento. Ogni filo associata a un canale specifico, in modo impostazione dei canali può essere completata in questo momento. diagrammi mappa canale per il headstages dell'amplificatore sono disponibili sul sito aperto Ephys Wiki (https://open-ephys.atlassian.net/wiki/display/OEW/Home). Saldare il filo corrispondente cui canale è noto al rispettivo perno per ottenere la mappatura desiderata.
- Tagliare i fili inutilizzati alla base del connettore nano con le pinze di taglio del filo.
- Utilizzare un voltmetro per garantire che ogni pin è isolato elettricamente da tutti gli altri pin. Una volta che l'isolamento è confermato, applicare un sottile strato di smalto in giro ogni giunto di saldatura per isolare ulteriormente ogni pin.
- Utilizzando 2-parte epossidica, rafforzare l'adattatore corrispondente nano per i bilaterali 2 x 7 e 2 x 1 perni sui mattoni maschio-maschio.
Nota: Ci saranno due metà di questo singolo adattatore che corrisponde alla disposizione dei pin delle metà copricapo creati in precedenza. È importante assicurarsi che la porzione mediale di ogni mezzo dell'adattatore non ha resina in eccesso traboccante il bordo di plastica del connettore maschio / maschio, in modo da evitare le due metà della testata essendo collegato simultaneamente. Non consentire epossidica di fluire al lato inferiore della por adattatore pinzione della scheda, come questo sarebbe anche impedire connessioni appropriate. Utilizzare le 2 metà copricapo come uno stampo per un corretto allineamento pin del connettore. - Epossidico due metà dell'adattatore e resina epossidica della base del connettore nano per aumentarne la durata. Assicurarsi di coprire tutti i giunti di saldatura con resina epossidica. Lasciate che la notte adattatore cura.
- La conferma di una corretta assegnazione dei canali può essere effettuata utilizzando misure di impedenza nell'interfaccia utente grafica Open-Ephys (GUI). Un adattatore completato pesa circa 1,3 g (Figura 1F).
3. Chirurgia
- Preparare un campo chirurgico sterile.
- Indossare guanti sterili e altri dispositivi di protezione individuale richiesto. Sterilizzare strumenti in autoclave. Sterilizzare il telaio stereotassico con una soluzione di biossido di cloro 1.0 mM. Spruzzare la soluzione sul telaio ed attendere 5 minuti prima di risciacquo con acqua sterile.
- Per sterilizzare headp impiantabileparti IECE, spruzzare i componenti con una soluzione di biossido di cloro 1,0 mm, e attendere 5 minuti prima di risciacquare con acqua sterile. Posizionare l'hardware impiantabile ormai sterile in una piastra di Petri sterile.
- Ottenere un peso pre-chirurgica per il mouse, quindi anestetizzare il mouse in una camera di induzione 200 ml usando 1,5-2,0% isoflurano in ossigeno al 100%. Utilizzare una portata nella camera di circa 500 ml / min.
- Conferma perdita del riflesso di raddrizzamento ruotando camera di induzione. Rimuovere il mouse dalla camera di induzione e posto nel cono del naso sul telaio stereotassico senza garantire completamente la testa del mouse con le barre orecchio. Continuare a monitorare la corretta profondità dell'anestesia dalla valutazione punta pizzico ma anche di valutare i segni vitali.
- Mantenere la temperatura corporea a 37 ° C con un regolatore di temperatura a circuito chiuso, come un sistema pad sonda e riscaldamento rettale. Coprire gli occhi del mouse con unguento oftalmico occhio prima di tagliare fuori la pellicciasulla parte superiore del cranio con forbici curve o tagliaunghie. Disinfettare la testa con betadine e consentire il betadine si asciughi completamente prima di procedere.
- Somministrare analgesici e antibiotici insieme con fluidi intraperitoneale. Per un 25 g del mouse, 0,5 mg cefazolina, 0,125 mg di meloxicam, 0,5 ml di soluzione salina, e 2,5 mg di buprenorfina q 4-6 ore prn.
- Iniettare 250 microlitri 0,25% sottocutanea bupivacaina lungo la linea mediana sulla testa, e iniettare 100 microlitri 0,25% bupivacaina sottocutanea su entrambi zigomatica del mouse.
- Fissare il mouse nel telaio stereotassico ed esporre il cranio.
- Fissare la testa del mouse con le barre orecchio stereotassica al telaio stereotassico. Assicurarsi che il mouse è un aereo chirurgico di anestesia confermando l'assenza del riflesso punta pinch. Creare un'incisione 1.5-2.0 cm oltre ad No. 11 bisturi monouso lungo la linea mediana del cranio. L'incisione partirà tra gli occhi e continuare posteriormente all'occipite. </ Li>
- Esporre il cranio diffondendo la pelle lateralmente con morsetti micro. Ridurre concentrazione isoflurano dal 2,0% ad una concentrazione che mantiene un piano chirurgica di anestesia, ma non ridurre a inferiore 1,0% isoflurano in ossigeno al 100%. analgesia pre-operatoria riduce la quantità di anestetico inalato necessario per mantenere una profondità chirurgica di anestesia, e può portare a un più rapido recupero e miglioramento dei risultati di sopravvivenza.
- Livellare i fori bava cranio e trapano.
- Identificare Bregma e azzerare le coordinate stereotassica in Bregma, che diventa l'origine del sistema di coordinate. Per livellare il cranio nell'asse mediale / laterale, spostare una sonda livellamento collegato a un braccio manipolatore stereotassico 1,50 millimetri lateralmente in entrambe le direzioni da Bregma e confermare che la dorsale / profondità ventrale è minore di 0,05 mm quando i contatti sonda sinistra e destra lati del cranio.
Nota: La risoluzione 10 micron di dorsale / ventrale ar manipolatoresto utilizzato in combinazione con un digitale visualizzazione delle coordinate semplifica livellamento. Livellamento l'asse anteriore / posteriore sulla Bregma segue la stessa tecnica. La differenza nella distanza ventrale per contattare Bregma e Lamda dovrebbe essere inferiore a 0,05 mm.- Regolare il cranio fino livellamento è completa in entrambe le direzioni in modo che il piano trasversale è parallelo al terreno. Questo permette di vere coordinate stereotassica come si vede nelle atlante cervello di topo. 20
- Con un diametro di punta micro punta 0,5 millimetri all'interno di un trapano stereotassico, praticare dei fori radica da 3,30 millimetri anteriore a 4.50 mm posteriormente al Bregma con incrementi di 1,30 mm a 1.00 mm in direzione laterale alla linea mediana su entrambe le metà del cranio. Per le colonne laterali di elettrodi 2,30 mm, fori trapano bave dal 2,00 mm anteriormente bregma a 4.50 mm posteriormente al Bregma in incrementi di 1,30 mm su entrambi i lati della linea mediana (Figura 2). L'elevata accuratezza e precisione che è richiesta per questo droperazione Illing è semplificata dalla risoluzione 10 micron di un braccio manipolatore stereotassico digitale.
Nota: Affinché i pin del casco correttamente essere impiantati, il cranio del mouse deve essere saldamente in posizione all'interno del telaio stereotassico. Se il cranio si muove durante la perforazione, il disallineamento dei fori copricapo e radica può derivarne.
- Identificare Bregma e azzerare le coordinate stereotassica in Bregma, che diventa l'origine del sistema di coordinate. Per livellare il cranio nell'asse mediale / laterale, spostare una sonda livellamento collegato a un braccio manipolatore stereotassico 1,50 millimetri lateralmente in entrambe le direzioni da Bregma e confermare che la dorsale / profondità ventrale è minore di 0,05 mm quando i contatti sonda sinistra e destra lati del cranio.
- Impiantare le testate.
- Con pinze diritte, preparare i tunnel filo EMG per i fili EMG toraciche. Scavare 2,5 cm tra la pelle ei muscoli nella parte posteriore per entrambi i fili di EMG sinistro e destro. Inserire il toraciche e cervicali EMG nella cavità creata con le pinze diritte prima, e poi manovrare il mattone EEG con pinze curve in modo tale che i perni si allineano con i fori di bava precedentemente perforati.
- Applicare una leggera pressione sulla testata e muovere i perni nel cranio. diametro del perno è 0,46 mm. Con isolante smalto, i perni si inserisce perfettamente nella bava forato holes. Il casco sarà stabile una volta che è opportunamente inserito. Regolare i fili EMG a posizioni finali. Ripetere la stessa procedura per la testata sul lato opposto.
- Fissare la testata in posizione con cemento dentale.
- Quando entrambe le testate sono fissati in luogo, mescolare rapporto 1: 1 di metacrilato di metile con la sua mescola reticolazione. Applicare la miscela tale da coprire il cranio esposto, parti di unghie lucidato degli elettrodi pin, e la porzione prossimale di fili EMG, ma non copre gli innesti della testata.
- Essere sicuri di non ottenere il cemento sulla pelliccia. Non consentire creste di cemento per formare che il mouse possa afferrare. Garantire un tempo sufficiente per il cemento ad asciugare, e quindi rimuovere il mouse dal telaio stereotassico. Il peso totale che il mouse dovrà trasportare è da 2 metà del casco e il cemento di fissaggio è di circa 1,2 g.
- Posto l'animale in un ambiente pulitozona di recupero.
- Mantenere la temperatura corporea con una piastra elettrica. Monitorare il mouse fino a quando non recupera tutti i riflessi posturali, a significare emersione dall'anestesia. alloggiamento individuale è raccomandato per il recupero a lungo termine.
- Il monitoraggio quotidiano per un minimo di 3 giorni dopo l'intervento è consigliato con l'analgesia interventistica. Lasciare 10-14 giorni di recupero post-operatorio prima di iniziare un periodo di assuefazione tethered.
4. abituare gli animali per Tethering
- Collegare l'adattatore per il mouse usando un poggiatesta del mouse (Figura 1G-H). Tenere su angoli opposti del copricapo che sono cementati in posizione con hemostats curve una volta che il mouse viene trattenuto e inserire lentamente i perni adattatore nella testata impiantato su entrambi i lati.
- Collegare l'amplificatore a 32 canali per l'adattatore (Figura 1 H). Assicurarsi di allineare i loghi sia sul adattatore e amplificatore in un coorientamento nsistent sia per l'adattatore e l'amplificatore per evitare errori di canale di mappatura. Collegare l'amplificatore di un cavo di interfaccia periferica seriale (SPI) di serie RHD2000. Questo cavo si connetterà al sistema di acquisizione per la registrazione del segnale.
- Posizionare il mouse all'interno di una camera in cui è installato sulla parete della camera di un braccio a sbalzo. Collegare il cavo di interfaccia SPI al braccio a sbalzo e regolare la tensione nel braccio a sbalzo per contrastare il peso del cavo legato. Il mouse è in grado di muoversi liberamente ed è abituata per un'ora al giorno della settimana prima della registrazione.
- Per scollegare il mouse, è sufficiente scollegare il cavo e l'adattatore dal mouse mentre si utilizza un piatto in acciaio inox micro spatola per aiutante nella scollegare l'adattatore dal mouse.
Configurazione 5. Sistema estrazione del segnale di registrazione / Segnale
- Inserire l'adattatore costruito nella testata di un mouse impiantato. Collegare un amplificatore headstage all'adattatore ecollegare un cavo di interfaccia standard SPI all'amplificatore ed alla scheda di acquisizione. Avere il cavo SPI subordinare una cantilever correttamente tesa in modo che il peso supplementare sulla testa del mouse viene minimizzata.
- Posizionare una gabbia di Faraday locale, creato con lo svolgimento di maglia o un foglio di alluminio, attorno al headstage e mettere a terra la gabbia di Faraday locale.
- Ottenere impedenze degli elettrodi prima dell'inizio di ogni registrazione selezionando a 30 kS / s frequenza di campionamento e misura impedenze attraverso il modulo nella GUI. Un valore di impedenza inferiore o uguale a 10 kW per una spina individuo è richiesto per la conferma della corretta contatto dell'elettrodo. valori di impedenza più alti producono i dati respinti da quella degli elettrodi.
- Per la registrazione, creare una catena di ritmo FPGA, Bandpass Filter, e visualizzatore LFP nella GUI del segnale. Si consiglia di selezionare una frequenza di campionamento di 1,00 kS / s, larghezza di banda di 0.1-7,500 Hz e deselezionare DSP. Impostare il filtro passa-banda di 0,1-250 Hz e visualizzare i canali per opzare lo spettatore LFP. 250 e 400 ampiezze di canale mV con metodo draw selezionati migliore visualizza i dati.
- Iniziare la registrazione utilizzando l'interfaccia grafica. Creare una nuova cartella per ogni registrazione e impostare il percorso per il salvataggio dei file in quella cartella. Per iniziare una registrazione è sufficiente premere record. Tutti i 32 canali del connettore vengono registrati di default, ma canali indesiderati possono essere deselezionati cliccando sul lato destro del modulo FPGA ritmo prima dell'inizio della registrazione.
- Importazione di dati in MATLAB per l'analisi. Ci sono una moltitudine di cassette open-source che possono essere utilizzati per aiutare in analisi.
Representative Results
Dati campione registrati in un mouse muoversi liberamente impiantato con un EEG casco ad alta densità è mostrato in figura 3. Singole forme d'onda EEG corrispondono al regime canale di mappatura mostrato in Figura 2. Esempi di cervicale e toracica EMG vengono inoltre visualizzati in figura 3. si noti che la registrazione toracica EMG contiene anche attività elettrica incorporato originari cuore del topo che diventa evidente quando un segnale differenziale tra i due fili EMG toracici (T) è calcolata. Con questa registrazione è anche possibile calcolare la frequenza cardiaca del topo misurando il tempo tra picchi QRS elettrocardiografici. 23-24 Analogamente, è possibile misurare la frequenza respiratoria del topo calcolando variabilità fasica del picco QRS come la cavità toracica si espande e contratti con ogni respiro. 25 Quindi, questa impostazione dei permessi per l'acquisizione of polisonnografia murino. Inoltre, la configurazione consente mappatura corticale dei potenziali evocati visivi (Figura 4). Quando un impulso di 10 msec di luce viene consegnato solo per l'occhio sinistro del mouse, le risposte classiche sono registrati nel controlaterale (ma non omolaterale) corteccia visiva primaria che sono seguiti da una risposta ritardata in controlaterale corteccia visiva secondaria. Il video integrato nella Figura 4 mostra il tempo variabile potenziali elettrici su tutta la superficie corticale insieme con grafici di attività nel V1 e V2 controlaterale.
| AP | ||||||
| 3.3 | 0 | 0 | ||||
| 2 | 0.4 | 0.6 | 0.6 | 0.4 | ||
| 0.7 | 0.6 | 0.9 | 0.9 | 0.6 | ||
| -0.6 | 0.9 | 1 | 1 | 0.9 | ||
| -1.9 | 1 | 1.1 | 1.1 | 1 | ||
| -3.2 | 3 | 1 | 1 | 1 | 1 | 3 |
| -4.5 | 3 | 0.7 | 0.7 | 0.7 | 0.7 | 3 |
| ML | -2.3 | -1 | 1 | 2.3 |
Tabella 1:. Pin Taglio Lunghezze Questa figura mostra le lunghezze taglio richiesti, in mm, per pin per il casco. Le lunghezze di pin rifilatura sono stati acquisiti da un atlante cervello di topo. After perni taglio, la testata corrisponde al profilo superficie del cervello. 20 pin EMG sono completamente tagliati fuori come i fili utilizzati per registrare il segnale EMG sono saldati sul stub perno.
Figura 1:. Copricapo Componenti, intermedi passi della costruzione e corretto collegamento per la registrazione Questa figura mostra la materia prima utilizzata per creare copricapi. Partendo con un recipiente connettore 100 pin, vengono creati piccoli componenti 2 x 7 e 2 x 1. Si noti che nel componente 2 x 1, il bordo iniziale del 2 x 50 è intatto, che permette la costruzione casco coerente e consente a un adattatore per collegare a molti topi impiantati. Figura 1B e 1C presenta le materie prime necessarie per creare l'adattatore dalla testata all'amplificatore. 1B presenta l'estremità testata dil'adattatore che allo stesso modo viene tagliato per connettersi alla testata. Si noti che tale 2 x 1 ha di nuovo un bordo originale dal componente grezzo, garantendo la corretta connessione tra l'adattatore e la testata. Figura 1C mostra l'estremità dell'adattatore che collega all'amplificatore. Figura 1D mostra la incollato con resina epossidica 2 x 7 e 2 x 1 componenti lungo con fili EMG preparati per la registrazione del segnale. Figura 1E dimostra un copricapo completato. Figura 1F mostra un adattatore completato. la figura 1G mostra un corretto collegamento tra le testate e l'adattatore. Infine, la Figura 1H mostra un mouse impiantato con adattatore collegato e l'amplificatore. Il chip amplificatore è collegato ad un cavo di interfaccia che corre verso la scheda di acquisizione (non mostrato). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Elettrodi Montaggio e copricapo completamente Costruito Questa figura mostra il posizionamento degli elettrodi rispetto al cervello di topo. posizioni elettrodi sono basate sulle coordinate stereotassica da Bregma. Coordinate per ogni elettrodo può essere trovato nel passo 4.8 del protocollo. colore elettrodi corrisponde alle regioni cerebrali sottostanti per ogni elettrodo. Bianco = frontale corteccia associativa (Fra), arancione = motoria primaria corteccia (M1), Rosa = corteccia motoria secondario (M2), verde scuro = primaria corteccia somatosensoriale, regione zampa anteriore (S1FL), Verde = primaria corteccia somatosensoriale, zona disgranulare (S1DZ ), Luce verde = corteccia somatosensoriale primaria, campo barile (S1BF), Giallo = mediale parietale corteccia associativa (MPTA), blu scuro = primaria corteccia visiva (V1), Light Blue = corteccia visiva secondaria, zona mediomedial (V2MM), nero = dy retrosplenialcorteccia sgranular (RSD). 20 comuni di riferimento / terra è mostrata come bene. Questo schema di riferimento minimizza artefatto respiratorio all'interno del segnale grezzo. Numeri associati con ciascuno elettrodo forniscono una mappa canale per l'intero array. Immagine modificata da Allen cervello di topo Atlas. 21,22 figura 2B mostra un copricapo completamente costruito in scala rispetto ad un centesimo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: EEG campione e EMG Tracce dall'elettrodo Montage forme d'onda elettrodi corrispondono alla mappatura dei canali mostrato nella Figura 1A.. Cervicale EMG (C) offre la possibilità di determinare il tono muscolare nucale (+). segnali EMG contengono anche cardiaci impulsi elettrici QRS(*). Barre di scala di 200 mV per ampiezza di traccia e 1 secondo per la durata di traccia vengono visualizzati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: distribuzione spaziale dei Evocati Visivi potenziale Distribuzione spaziale delle domande, previo potenziali evocati di un lampo di luce unilaterale somministrato solo per l'occhio sinistro.. diagramma superiore rappresenta l'EEG montaggio ad alta densità con ogni cerchio rappresenta un elettrodo. Variazione del colore nel tempo corrisponde alle variazioni di tensione nel corso del tempo per ogni rispettivo elettrodo. Al tempo = 0 msec, un impulso di luce 10 msec viene consegnato e rappresentato in figura centrale. grafica in basso illustra significa potenziali evocati tracce per controlaterale V1 e V2 EEG elettrodi (prove n = 108 EP). pul Lucese si verifica a 0 msec. Si noti che la corrispondente risposta potenziale evocato si osserva in V1 controlaterale (traccia nera), seguita da una latenza più evocato risposta potenziale nel V2 controlaterale (traccia rossa). (Clic destro per il download).
Discussion
La costruzione a basso costo e gradini chirurgiche necessarie per raggiungere correttamente un canale 26, ad alta densità EEG montaggio in un mouse è descritto. La corretta contatto elettrodo epidurale è fondamentale per l'acquisizione di segnali EEG di qualità in questo sistema. Due passaggi all'interno l'indirizzo del protocollo questo problema: pin taglio per abbinare contorno del cervello, e copricapo l'impianto prima del rinforzo acrilico. È importante non tagliare un perno troppo breve durante la fase di costruzione. Quando impiantare le testate, è indispensabile per controllare la posizione del perno prima del rinforzo acrilico finale. Un modo per confermare il corretto contatto elettrodo è attraverso test di impedenza. Apparentemente, impedenze di 5-10 kΩ suggeriscono il corretto posizionamento epidurale. 26 misure di impedenza dimostrano la durata delle testate ", come valori di impedenza degli elettrodi sono stabili all'interno di questo intervallo 5-10 kΩ per almeno 4 mesi dopo l'impianto. L'altropasso essenziale consiste allineando i perni EMG con le due posteriori-la maggior parte delle righe del 2 x 7 EEG mattoni. Questo è fondamentale per il collegamento adattatore, come EMG disallineato e perni EEG si tradurrà in una incapacità di collegare l'adattatore o pin adattatore piegati.
Un importante vantaggio di questo sistema di acquisizione è la facilità di modificare la forma della matrice di elettrodi per ottimizzare svariate esigenze sperimentali. accordi di elettrodi su misura che rispondano perfettamente per esperimenti specifici possono essere facilmente creati. Personalizzazione per esperimenti specifici potrebbe potenzialmente combinare EEG con cannula per la consegna della droga diretto per farmacologico combinato, elettroencefalografico e studi comportamentali. 27 Divise adattatori, e le procedure chirurgiche sono facilmente su misura per un ampio numero di studi, quando seguendo i metodi descritti nel protocollo di cui sopra . Un secondo importante vantaggio di questo sistema di acquisizione è il suo basso costo. Attualmente, questo sistema di acquisizione puòrecord di 128 canali di ingresso su un massimo di 4 cavi separati, permettendo registrazioni simultanee da 4 topi o se lo si desidera, i ratti con griglie maggiore densità. Tale espansione richiederebbe solo cavi aggiuntivi e adattatori.
Questo approccio alla acquisizione EEG ad alta densità Indirizzi inconvenienti di altri metodi di acquisizione EEG ad alta densità nei topi. Il sistema descritto in questo lavoro è comodamente costruito con materiali semplici e utilizza hardware open source e software che è poco costoso e stabile, permette misurazioni ripetute nello stesso animale per mesi, senza impedire il movimento durante un esperimento, e non richiede topi essere anestetizzati per la registrazione. Le limitazioni di questo sistema è che esso è stato convalidato solo fino ad oggi nei topi che pesano 20 grammi o più, e sono più vecchi di 12 settimane. topi più piccole o più giovani possono avere difficoltà con l'impianto testata. Una limitazione secondario di questo metodo è l'incapacità di controllare con precisione la profondità dell'elettrodo dopo headpIECE fabbricazione. Tuttavia, questa stessa limitazione si applica agli elettrodi vite EEG tradizionali poiché non vi è alcun modo di conoscere esattamente la profondità di avvitamento pre-mortem rispetto alla superficie corticale. Risoluzione dei problemi per questo metodo in genere comporta correttamente la schermatura segnale interferente dal mouse quando legato al fine di ottenere il segnale privo di rumore.
array EEG ad alta densità sono essenziali per le complesse analisi spazio-temporali di dati EEG che sono la nuova normalità nella moderna interpretazione EEG. Mentre la distribuzione spaziale di un potenziale evocato visivo è illustrato, i dati acquisiti con questo sistema possono essere analizzati utilizzando tecniche di imaging fonte elettrica e le misure di connettività neuronali. Una riduzione del 60% al 70% della superficie di contatto tra questi gli elettrodi rispetto ai contatti a vite tradizionali consente più precisa localizzazione del segnale, come mostrato in Figura 4. Impiegando alta densità tecniche analitiche in topi geneticamente modificati, seguendo Pharmacolintervento ogical, o in animali con patologia intrinseca, quali disturbi convulsivi possono aiutare a discernere i meccanismi che generano specifici oscillazioni corticali, localizzare le sorgenti di ERP e EP, e rivelare proprietà di rete su larga scala. Con migliori sistemi umani di parallelismo, questo approccio migliorerà piccoli modelli animali di neurofisiologia umana e neuropatologia, fornendo più facile trasformazione di scoperte fatte in modelli di roditori di rilevanza scientifica e clinica nell'uomo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32 Channel RHD2132 amplifier headstage | Intan Technologies | C3314 | |
| Aquistion Board | Open Ephys | v2.2 | |
| 100 Position Receptable Connector | Digi-Key | ED85100-ND | Headpiece |
| Acetone (1 L) | Sigma Aldrich | 179973-1L | |
| Razor Blade (100 pack) | McMaster Carr | 3962A4 | |
| Wire-Cutting Pliers | MSC Industrial | 321786 | |
| 2-Part Epoxy | McMaster Carr | 7605A18 | |
| PFA Coated Silver Wire (25 ft) | A-M Systems | 787000 | EMG Wire |
| CircuitWriter Pen | MCM Electronics | 200-175 | Silver Applicator for Electrode Tips |
| 36 Position Dual Row Male Nano-Miniature Connector | Omnetics Connector Corporation | A79028-001 | Headpiece to Amplifier Adapter |
| Conn Strip Header 2 x 50 | Digi-Key | ED83100-ND | Headpiece to Amplifier Adapter |
| Clidox Base and Acitvator | Pharmacal | 95120F & 96120F | Sterilant |
| Isoflurane | Priamal Enterprises Ltd | 66794-019-10 | |
| Oxygen | Airgas | OX USP300 | |
| Closed Loop Temperature Controller | CWE Inc. | 08-130000 | |
| Curved Scissors | FST | 14085-09 | |
| 0.25% Bupivicaine Hydrochloride | Hospira | 0409-1159-02 | Local Anesthetic |
| Meloxicam 5mg/ml | Henry Schein | 6451602845 | Pain/Inflammation Relief |
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | 0409-4888-20 | Fluids |
| Cefazolin | Hospira | 0409-0806-01 | Antibacterial |
| No.11 Disposable Scapel (20 pk) | Feather | 2975#11 | |
| Micro Serrefines | FST | 18052-3 | |
| Cotton Swabs (1,000 pk) | MSC Industrial | 8749574 | |
| 0.5 mm Micro Drill Bit | FST | 19007-05 | |
| Stereotaxic Drill | Kopf | Model 1471 | |
| Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | |
| Methyl Methacrylate | A-M Systems | 525000 | Cement for headpiece |
| Methyl Methacrylate Crosslinking Compound | A-M Systems | 526000 | |
| Curved Hemostats | FST | 13003-10 | Aide in Adapter Connection |
| RHD2000 standard SPI interface cable (3ft) | Intan Technologies | C3203 | |
| Cantilever Arm | Instech | MCLA | |
| Micro Spatula (12 pk) | Fischer Scientific | S50822 | |
| Digital Soldering Station | MCM Electronics | 21-10115 | |
| Rosin Core Solder 60/40 Tin/Lead | MCM Electronics | 21-1045 | |
| Color Craze Nail Polish with Hardeners (Nitrocellulose based) | L.A. Colors | CNP508 | |
| Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console | Kopf | Model 940 |
References
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