Abstract
Avancerade elektroencefalografiska analystekniker som kräver hög rumslig upplösning, inklusive elektrisk källa bildbehandling och åtgärder för nätverksanslutning, är tillämpliga på en växande mängd frågor i neurovetenskap. Att utföra dessa typer av analyser i en gnagare modell kräver högre elektrod densitet än traditionella skruvelektroder kan åstadkomma. Medan högre densitet elektroencefalografiska montage för gnagare förekommer, de är av begränsad tillgång till de flesta forskare, är inte tillräckligt robusta för upprepade experiment under en längre tid, eller är begränsade till användning i bedövade gnagare. 1-3 Ett förslag till låg kostnad metod för att konstruera en hållbar, hög-count, transkraniell elektrod array, bestående av bilateralt implanterbara stycken undersöks som ett sätt att utföra avancerad elektroencefalogram analyser i möss eller råttor.
Rutiner för huvudbonaden tillverkning och kirurgisk implantation necessary att producera hög signal-brus, är låg impedans elektroencefalografiska och elektromyografi signaler presenteras. Medan metoden är användbar i både råttor och möss, fokuserar detta manuskript på mer utmanande om genomförandet av det mindre mus skallen. Fritt rörliga möss endast bundna till kablar via en gemensam adapter under inspelning. En version av denna elektrodsystem som inkluderar 26 elektroencefalografiska kanaler och 4 elektromyografiska kanalerna beskrivs nedan.
Introduction
Nervaktivitet kan registreras extracellulärt med olika nivåer av kornighet från mikroskopiska (individuella aktionspotentialer) att mesoskopisk (lokala fält potentialer) till makroskopisk (elektroencefalogram). Dessa hjärnvågorna spår är klassiskt analyseras i frekvensdomänen för att karakterisera beteende, neurofysiologiska, eller elektrofysiologiska tillstånd. Detta kan göras med en enda biopotential, 4 men gles densitet EEG inspelningar kan inte lösa den rumsliga komponenten i neuronal aktivitet. Modern elektroencefalogram analys bygger på flera elektroder för att producera detaljerade kartor över Spatiotemporal fördelning av kortikal aktivitet för att korrelera denna verksamhet med specifika psykologiska förhållanden och fysiologiska processer. 5-7 Två av de vanligare typer av analys som kräver hög densitet EEG montage är elektrisk källa bildbehandling och neurala nätverksanslutning åtgärder. 8-11
12-15 Eftersom EEG har hög tidsupplösning, EEG-studier medger realtidsutvärdering av ERP-system och EPs samt tidsmässigt exakt post hoc-analys. 3,11 , 12
Associera kognitiva tillstånd och funktioner med samspelet svängningar sett på elektroencefalogram är det yttersta målet för de olika mått på neurala nätverksanslutning. Ett flertal studier har visat synkronisering och faslåsning av svängningar mellan olika områden i hjärnan är förknippade med särskilda tillstånd av upphetsning, uppmärksamhet, och handling. 6,13,14,16-19
Källa lokalisering och nätverk analyser av EEG-signaler har sitt ursprung i studier på människa, men undersökningar av neuronala grunden för dessa signaler nödvändigtvis att djurmodeller, eftersom de kräver invasiva tekniker som annars omöjligt i människor. I syfte att replikera samma analyser i gnagarmodeller, behövs en metod för att fånga hög densitet EEG-signaler i en gnagare hjärna. Medan andra grupper har konstruerat hög densitet mikroelektrod arrayer för användning i möss, sådana metoder är av begränsad tillgänglighet för forskare utan tillgång till anläggningar för nanotillverkning, är inte tillräckligt robusta för upprepade experiment under en längre tid, eller är begränsade till användning i sövda möss. 1-3,7 En låg kostnad alternativt protokoll för att konstruera kronisk hög densitet, transkraniell elektroden ARRAy demonstreras här.
Signalförvärvs tillvägagångssätt som beskrivs här är inte begränsat till EEG, men inkluderar elektromyografiska (EMG) signaler. Förvärv av EMG signaler kan vara en kompletterande metod för att definiera beteende tillstånd och är speciellt användbar för sömnstudier. Denna metod ger ett mellanting mellan dyrare, ultra-high-density intrakraniella nät, och de begränsade bly nummer möjligt med traditionella skruvelektroder som är otillräckliga för avancerade analys metoder. Huvudbonaden designen är lätt konstrueras och prisvärt för hög genomströmning studier. Användning av detta förvärv systemet i samband med diverse genetiska eller farmakologiska manipulativa tekniker inom gnagarmodeller kan hjälpa avslöja mekanismerna för kortikal svängning generation, beteende avvikelser från verkliga genotypiska skillnader källa lokalisering av ERP-system och EPs, och storskalig nätverkskommunikation.
Protocol
De studier som utförts under denna undersökning överensstämde med National Institutes of Health Guide för vård och användning av försöksdjur och godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Pennsylvania.
1. Headpiece Design and Construction
- Avlägsna varje åttonde raden av tappar från 2 x 50 stift tegel av en 100 ställning honkontaktdonet med en pincett genom att trycka behållaren partiet av stiftet genom plast tegel.
Obs: Pins vända nedåt blir orienteringen som kommer att refereras till resten av protokollet. (Notera detta specifikt i 2,6). - Täck stift med en mycket tunt lager nagellack att isolera och låta nagellacket torka helt.
- Avlägsna nagellack från spetsarna av stiften med aceton och en liten trasa.
- Klipp bort överflödigt plasten i 2 x 7 s med ett rakblad eller trådskär pliers. Detta kommer att resultera i 2 x 7 tegelstenar som är isolerade längs längden av stiften och exponerade vid stiftet spetsen. Dessa kommer så småningom bli transkraniell EEG elektroderna. Två 2 x 7 tegel är nödvändiga för en fullständig kronisk elektrodgrupp (Figur 1A).
- Klipp två 1 x 2 pin tegel för EMG signalinspelnings. Använda samma process för att ta bort oönskade stift med pincett och skära den överskjutande plast bort för att skapa de 1 x 2 tegelstenar. Se till att dessa 1 x 2: s har en slät sida till dem från den ursprungliga 100 Position Kärl som detta avstånd kommer att bli standard stift avståndet för varje huvudstycke så en enda adapter kommer att fungera för alla stycken (Figur 1A).
- Använd två delar epoxi för att fästa 1 x 2 pin bit till 2 x 7 pin stycket (figur 1D).
- Som båda uppsättningarna av tapparna måste vara i samma orientering, Epoxi 1 x 2 på den laterala sidan av båda halvorna av huvudstycket med de släta sidorna av de 1 x 2 och 2 x7 i kontakt med varandra. Rikta in 1 x 2 hål och stift med bakersta 2 rader stift på 2 x 7.
Notera: De två halvorna av huvudstycket är inte epoxied tillsammans. Detta möjliggör flexibilitet inom de två halvorna av huvudbonaden adapter för enklare anslutning under tillvänjning och under experimentella dagarna (figur 1E). - Låt huvudstycket halvorna bota natten. Efter avslutad, är huvudbonaden bilateralt symmetriska. Varje halv består av en 2 x 7 pin tegel med en lateralt fäst 2 x 1 stift tegel som är i linje med den bakre mest 2 rader av 2 x 7 pin tegel.
- Som båda uppsättningarna av tapparna måste vara i samma orientering, Epoxi 1 x 2 på den laterala sidan av båda halvorna av huvudstycket med de släta sidorna av de 1 x 2 och 2 x7 i kontakt med varandra. Rikta in 1 x 2 hål och stift med bakersta 2 rader stift på 2 x 7.
- Förbered kablarna för EMG signalinspelnings. Enkelsträngat är 31 G perfluoroalkoxi isolerad silvertråd som används för EMG signal inspelning (figur 1D). Emellertid multi trängade eller annan metall ledningar kan vara substituerade om så önskas.
- Att skapa bröstkorg EMG kablar ta en 3,0 cm lång bit av perfluoroalkoxi isolerad silvertråd och remove 1 cm av plastisoleringen från en ände med ett rakblad. Linda oisolerad tråd runt en pincett två gånger. Ta bort kabeln från pincetten och ta bort 25 mm isolering på icke-loopade ände med ett rakblad.
- För att konstruera livmoderhalscancer EMG ledningar, upprepa processen med en 1,5 cm långt segment av tråd. Två livmoderhalscancer EMG kablar och två bröstkorg EMG kablar behövs för en fullständig huvudbonad.
- Ta bort den laterala stift i längst främre raden av båda stycken, vilket motsvarar en stereotaktiska koordinaterna för 3,3 mm främre av bregma och 2,3 mm lateralt om bregma, eftersom det inte finns någon hjärna under denna plats som bestäms av en mushjärna atlas 20 (Figur 2A).
- På båda huvudbonad halvor, skär stiften i 1 x 2 tegelsten till plast basen av huvudstycket med ett par avbitare (3,0 mm från spetsen av stiftet) och löda livmoderhalscancer EMG kabeln till den främre stiftet och bröstkorg EMG till den bakre pi.
- Kontrollera att varje stift är elektriskt isolerad. Utför en kontinuitetstest med en digital multimeter genom att ansluta de två ledningarna i voltmeter till olika stift medan i kontinuitetsläget. Elektriskt isolerade stift inte kommer att producera en hörbar signal med denna multimeter test; Men, elektriskt kopplade stift kommer. Täck lödfogar med nagellack och en gång torr, böja EMG ledningarna så att de är parallellt med den främre / bakre axeln med minimal sidoförskjutning.
- Trimstiften till en relativ längd så att de matchar ytprofilen av hjärnan.
- Med medhjälpare av en mus hjärna atlas, spela ventrala avståndet till hjärnans yta från bregma för varje stift koordinat. 20 stift vars ventrala avstånd från bregma är den största kommer att fungera som indikator för stift trimning. Detta stift kommer inte trimmas medan alla andra stift kommer att skäras i förhållande till detta maximala ventrala avstånd stiftet (Tabell 1).
Notera: Stiften kan slipas ner till storlek men det måste göras noggrant som friktionen mellan stiftet och slipskiva kan orsaka stiften i headpiece att böja. Om ett stift är böjt, använder pincett för att räta ut det. Ett alternativ till målning av stiften ner till längd är att trimma dem med ett par trådskärtång.
- Med medhjälpare av en mus hjärna atlas, spela ventrala avståndet till hjärnans yta från bregma för varje stift koordinat. 20 stift vars ventrala avstånd från bregma är den största kommer att fungera som indikator för stift trimning. Detta stift kommer inte trimmas medan alla andra stift kommer att skäras i förhållande till detta maximala ventrala avstånd stiftet (Tabell 1).
- Täck alla stift tips med en silver lösningen med en silverlösning penna och låt torka. Detta steg sänker elektrod impedanser till ≤30 kQ, vilket ökar signal-brusförhållandet och samtidigt eliminerar ojämna kanter orsakas från stift putsning, därför minskar chanserna för vävnadsskada och påskynda återhämtning från kirurgi. Ett ifyllt huvudbonaden halv vikter cirka 0,5 g.
2. Adapter Konstruktion och Channel Mapping
- Skär anslutningstrådar i en 36 Position Dual Row Man Nano-miniatyrkontakt till en enhetlig längd av 2 eller 3 cm med hjälp av ett rakblad. För varje tråd, strip off 2,5 mm isolering från slutet och tenn den exponerade metallen för varje tråd. Kontrollera när tinning att ha en enda, tunn sträng av konserverad tråd för varje nano-adapter tråd eftersom detta är avgörande för att isolera stiften. Klipp bort den avskalade isoleringen med tråd avbitartänger (Figur 1C).
- Skapa en matchande hane / hane kontakten till huvudstycket med hjälp av Conn Strip Header 2 x 50. Skär två 2 x 7-talet och två 2 x 1: or från en 2 x 50 tegel. Ta bort oönskade stift från 2 x 50 tegel genom att bryta bort en av de manliga stift, och tryck sedan den obrutna andra halvan av samma stycke av kontakten med en pincett (Figur 1B).
Obs: Ena sidan av dessa stift kommer att fungera som adapter stift att ansluta till varje huvudstycke, medan den andra hälften kommer att lödas till konserverad nanoanslutningstrådar. Var noga med att ha de plana plast kanterna på 2 x 1 och 2 x 7 rörande att garantera en god parning av den manliga / hankontakten med huvudstycke skapade i steg1. - Löda på en av botten / referens kablarna från nano-kontakten till den önskade marken / referensstift. Mark- och referens trådar knyts samman på RHD2132 förstärkare chip. Använd enda stift som är 0,60 mm främre till bregma och 1,00 mm i sidled av bregma som både referens och jord. (Vänster headpiece, mediala stiftet hos den tredje mest främre raden, men varje annan stift kan tilldelas om så önskas, figur 2.) Notera att det är möjligt att separera jord och referens på förstärkaren chip genom att ta bort 0Ω resistor som binder marken och referens tillsammans om att isolera de två önskas.
- Löd konserverad nano anslutningstrådar till samma sida av de manliga / hankontakterna som marken / referens polig anslutning. Varje tråd kartor till en särskild kanal, så kanalinställning kan slutföras vid denna tidpunkt. Kanal karta diagram för förstärkaren headstages finns på Open Ephys Wiki plats (https://open-ephys.atlassian.net/wiki/display/OEW/Home). Löda den motsvarande tråd vars kanal är känd till respektive stift att uppnå den önskade kartläggning.
- Kapa oanvända ledningar vid basen av nano kontakt med tråd avbitartång.
- Använd en voltmeter för att säkerställa att varje stift är elektriskt isolerad från alla andra stift. När isolering är bekräftad, applicera ett tunt lager av nagellack runt varje lödstället att ytterligare isolera varje stift.
- Med hjälp av två delar epoxi, förstärka matchnings nano-adapter till de bilaterala 2 x 7 och 2 x 1 stift på mans man tegel.
Obs: Det kommer att finnas två halvor till denna enda adapter som matchar stiftet arrangemanget av huvudstycket halvorna skapade tidigare. Det är viktigt att se till att den mediala delen av varje halv av adaptern inte har överflödig epoxi överfyllda plastkanten på hane / hane-kontakt, eftersom detta kommer att förhindra de båda halvorna av huvudstycke som inkopplad samtidigt. Låt inte någon epoxi att strömma till undersidan av stiftsadapter porning av adaptern, eftersom detta skulle också förhindra korrekta anslutningar. Använd 2 huvudbonaden halvor som en form för korrekt kontaktstift inriktning. - Epoxi båda halvorna av adaptern och epoxy basen av nano-kontakten för att öka dess hållbarhet. Var noga med att täcka alla lödning leder med epoxi. Låt adaptern bota över natten.
- Bekräftelse av rätt kanal kartläggning kan utföras med impedansmätningar i Open-Ephys grafiskt användargränssnitt (GUI). En färdig adapter väger ungefär 1,3 g (figur 1F).
3. kirurgi
- Förbered en steril operationsområdet.
- Bär sterila handskar och annan personlig skyddsutrustning. Sterilisera verktyg i en autoklav. Sterilisera stereotaktisk ram med en 1,0 mM klordioxidlösning. Spraya lösningen på ramen och vänta 5 minuter före sköljning med sterilt vatten.
- Att sterilisera implanterbar headpIECE delar, spraya komponenterna med en 1,0 mM klordioxidlösning, och vänta fem minuter innan sköljning med sterilt vatten. Placera nu sterila implanterbara hårdvara i en steril petriskål.
- Erhålla en pre-kirurgisk vikt för musen, sedan söva mus i en 200 ml induktionskammare med användning av 1,5 till 2,0% isofluran i 100% syre. Använda en flödeshastighet in i kammaren på ca 500 ml / min.
- Bekräfta förlust av rätande reflex genom att vrida induktionskammaren. Ta bort musen från induktionskammare och placera in i noskonen på den stereotaktiska ramen utan att helt säkra musens huvud med öron barer. Fortsätta att övervaka för korrekt djup anestesi genom tå nypa bedömning samtidigt utvärdera vitala.
- Bibehålla kroppstemperaturen vid 37 ° C med en sluten slinga temperaturregulator, såsom en rektal sond och värmedyna systemet. Täck ögonen på musen med oftalmologiska ögonsalva innan trimning av pälsenpå toppen av skallen med böjd sax eller Clippers. Desinficera huvudet med Betadine och låt Betadine torka helt innan du fortsätter.
- Administrera analgetika och antibiotika tillsammans med vätskor intraperitonealt. För en 25 g mus, 0,5 mg cefazolin, 0,125 mg meloxikam, 0,5 ml saltlösning och 2,5 mikrogram buprenorfin q 4-6 tim prn.
- Injicera 250 pl 0,25% bupivakain subkutant längs mittlinjen på huvudet, och injicera 100 pl 0,25% bupivakain subkutant på båda okbågarna på musen.
- Fäst musen i stereotaktisk ram och exponera skallen.
- Fäst huvudet av musen med stereotaktiska örat barer i stereotaktisk ram. Se till att musen är i en kirurgisk plan av anestesi genom att bekräfta frånvaron av den tå nypa reflex. Skapa en 1,5-2,0 cm snitt längs med en nr 11 av engångstyp skalpell längs mittlinjen av skallen. Snittet kommer att starta från mellan ögonen och fortsätter posteriort till nackknöl. </ Li>
- Exponera skallen genom att sprida huden sidled med mikro klämmor. Minska Isoflurankoncentration från 2,0% till en koncentration som upprätthåller en kirurgisk plan av anestesi, men inte minskar till lägre än 1,0% isofluran i 100% syre. Pre operativ smärtlindring minskar mängden inhalerad bedövningsmedel som behövs för att upprätthålla en kirurgisk anestesidjup, och kan leda till snabbare återhämtning och förbättrade överlevnadsresultat.
- Nivå skallen och borra Burr hål.
- Identifiera bregma och nollställa stereotaktiska koordinater vid bregma, som blir ursprunget till koordinatsystem. Till nivå skallen i den mediala / laterala axeln, flytta en utjämning sond ansluten till en stereotaktisk manipulatorarm 1,50 mm i sidled i båda riktningarna från bregma och bekräfta att ryggens / ventrala djupet är mindre än 0,05 mm när sonden kommer i kontakt med vänster och höger sidor av skallen.
Obs: Upplösningen 10 mikrometer i rygg / ventrala manipulator arm används i samband med en digital koordinat display förenklar utjämning. Utjämning den anteriora / posteriora axel kring Bregma följer samma teknik. Skillnaden i den ventrala avståndet för kontakt Bregma och Lamda bör också vara mindre än 0,05 mm.- Justera skallen tills utjämning är komplett i båda riktningarna så att det tvärgående planet är parallellt med marken. Detta gör det möjligt för riktiga stereotaktiska koordinater som ses i mushjärna atlas. 20
- Med en 0,5 mm diameter mikro borr i en stereotaktisk borr, borra Burr hål från 3,30 mm främre till 4,50 mm posteriort bregma i steg 1,30 mm vid 1,00 mm i sidled med mittlinjen på båda halvorna av skallen. För 2,30 mm sido kolumner av elektroder för att borra Burr hål från 2,00 mm främre bregma till 4,50 mm posteriort bregma i steg 1,30 mm på båda sidor om mittlinjen (Figur 2). Den höga noggrannhet och precision som krävs för denna drIlling drift förenklas genom upplösning 10 pm av en digital stereotaktisk manipulatorarm.
Obs: För stiften huvudbonaden att korrekt implanteras måste skallen av mus vara säkert på plats inom stereotaktisk ram. Om skallen rör sig under borrning, kan förskjutning av huvudstycket och Burr hål uppstå.
- Identifiera bregma och nollställa stereotaktiska koordinater vid bregma, som blir ursprunget till koordinatsystem. Till nivå skallen i den mediala / laterala axeln, flytta en utjämning sond ansluten till en stereotaktisk manipulatorarm 1,50 mm i sidled i båda riktningarna från bregma och bekräfta att ryggens / ventrala djupet är mindre än 0,05 mm när sonden kommer i kontakt med vänster och höger sidor av skallen.
- Implantera de överstycken.
- Med raka pincett, förbereda EMG tråd tunnlar för bröstkorg EMG kablar. Gräva 2,5 cm mellan huden och musklerna i ryggen för både vänster och höger EMG ledningar. Sätt i bröstkorg och livmoderhalscancer EMGs i kaviteten som skapas med raka pincett första, och sedan manövrera EEG tegel med böjda pincett så att stiften anpassa de tidigare borrade Burr hål.
- Applicera ett lätt tryck på headpiece och vicka stiften i skallen. Bultdiameter är 0,46 mm. Med isolerande nagellack, kommer stift passar tätt i det borrade Burr holes. Huvudstycket kommer att vara stabil när den är lämpligt insatt. Justera EMG kablar till slutliga positioner. Upprepa samma process för huvudstycket på den andra sidan.
- Fäst huvudstycket på plats med hjälp av tandcement.
- När båda överstycken sätts på plats, blanda 1: 1 förhållande av metylmetakrylat med dess tvärbindande förening. Applicera blandningen så att den täcker den exponerade skallen, spik-polerade delar av pinnelektroderna, och proximala delen av EMG ledningar, men täcker inte de kvinnliga kärl av huvudstycket.
- Var noga med att inte få cement på päls. Låt inte för åsar av cement för att bilda att musen kommer att kunna ta på. Säkerställa tillräcklig tid för cement att torka, och sedan ta bort musen från den stereotaktiska ramen. Den totala vikten att musen måste bära är från 2 halvorna av huvudstycket och fäst cement är cirka 1,2 g.
- Placera djuret i en renåterhämtning område.
- Upprätthålla kroppstemperaturen med en värmedyna. Övervaka musen tills det återfår alla postural reflexer, vilket innebär uppkomst från anestesi. Enskilda bostäder rekommenderas för långsiktig återhämtning.
- Daglig övervakning i minst 3 dagar efter operation rekommenderas med interventionell smärtlindring. Låt 10-14 dagars återhämtning efter operation innan en tjudrad tillvänjning period.
4. habituate Djur till Delning
- Anslut adaptern till musen med hjälp av en mus nackstöd (Figur 1G-H). Hålla fast motsatta hörn av överstycken som är cementerade på plats med böjda peanger när musen hålls tillbaka och långsamt in adapterstiften i den implanterade huvudbonad på båda sidor.
- Anslut 32 kanals förstärkare till adaptern (Figur 1H). Var noga med att rikta in logotyper på både adaptern och förstärkare i en consistent orientering för både adaptern och förstärkaren för att förhindra kanal kartläggning fel. Ansluta förstärkaren till en RHD2000 seriell standardperiferigränssnittet (SPI) kabel. Denna kabel ansluter till förvärvet system för signalinspelnings.
- Placera musen i en kammare som har en fribärande arm monterad på kammarväggen. Fäst SPI gränssnittskabeln till konsolarmen och justera spänningen i konsolarmen för att motverka vikten av den tjudrade kabeln. Musen kan röra sig fritt och habituated för en timme om dagen i veckan före inspelning.
- För att koppla bort musen, helt enkelt dra ut kabeln och adaptern från musen när du använder en platt rostfritt stål mikro spatel till medhjälpare i att koppla bort adaptern från mus.
5. Signal Extraction Systeminställningar / signalinspelnings
- Anslut konstruerade adaptern i huvudbonaden av en implanterad mus. Anslut en huvudsteg förstärkare till adaptern ochbifoga en standard SPI-gränssnitt kabel till förstärkaren och till upptagningskortet. Har SPI kabeln ansluts till en sträckt fribärande så att den extra vikten på musens huvud minimeras.
- Placera en lokal Faradays bur, som skapats med ledande nät eller aluminiumfolie, runt huvudsteg och jorda lokala Faradays bur.
- Skaffa elektrod impedanser före början av varje inspelning genom att välja en 30 KS / sek samplingsfrekvens och mäta impedansen via modulen i det grafiska gränssnittet. krävs en impedans värde mindre än eller lika med 10 kW för ett enskilt stift för att bekräfta korrekt elektrodkontakt. Högre impedansvärden resulterar i kasserade data från den elektrod.
- För inspelning, skapa en signal kedja av Rhythm FPGA, bandpassfilter, och LFP betraktaren i det grafiska gränssnittet. Det rekommenderas att välja en samplingshastighet på 1,00 kS / s, bandbredd på 0.1-7,500 Hz och välja bort DSP. Ställ in bandpassfilter till 0,1-250 Hz och visa kanalerna efter opningsmedel LFP betraktaren. 250 och 400 μV kanal amplituder med metoden draw utvalda bäst visualiserar data.
- Börja spela in med hjälp av det grafiska gränssnittet. Skapa en ny mapp för varje inspelning och ställa in sökvägen för att spara filer till den mappen. Till att börja en inspelning bara slog rekord. Alla 32 kanaler från kontakten registreras som standard, men oönskade kanaler kan omark genom att klicka på den högra sidan av Rhythm FPGA-modulen före början av inspelningen.
- Importera data till Matlab för analys. Det finns en mängd open-source verktygslådor som kan användas för att hjälpa till i analysen.
Representative Results
Exempeldata som spelats in i en fritt glidande mus implanterades med en hög-densitet EEG huvudstycke visas i fig 3. Enskilda EEG-vågformer motsvarar den kanalmappningsschemat som visas i figur 2. Exempel på cervikal och torakal EMG visas också i figur 3. notera att thorax EMG inspelning innehåller också inbäddad elektrisk aktivitet med ursprung i mus hjärta som blir lätt uppenbart när en differentialsignal mellan de två bröstkorg EMG trådar (T) beräknas. Med denna inspelning är det också möjligt att beräkna musens hjärtfrekvensen genom att mäta tiden mellan elektrokardiografiska QRS spikar. 23-24 På samma sätt är det möjligt att mäta musens andningsfrekvens genom att beräkna phasic variabilitet av QRS spik som brösthålan expanderar och kontrakt med varje andetag. 25 Därför denna inställnings tillstånd för förvärv of murin polysomnografi. Dessutom möjliggör installationen kortikala kartläggning av visuella framkallade potentialer (Figur 4). När en 10 ms ljuspuls är endast levereras till musens vänster öga, är klassiska svar registreras i den kontralaterala (men inte ipsilateral) primära syncentrum som följs av en fördröjd reaktion på kontra sekundär syncentrum. Filmen inbäddad i figur 4 visar den tidsvarierande elektriska potentialer över hela kortikala ytan tillsammans med grafer av aktiviteten i kontralate V1 och V2.
| AP | ||||||
| 3,3 | 0 | 0 | ||||
| 2 | 0,4 | 0,6 | 0,6 | 0,4 | ||
| 0,7 | 0,6 | 0,9 | 0,9 | 0,6 | ||
| -0,6 | 0,9 | 1 | 1 | 0,9 | ||
| -1,9 | 1 | 1,1 | 1,1 | 1 | ||
| -3,2 | 3 | 1 | 1 | 1 | 1 | 3 |
| -4,5 | 3 | 0,7 | 0,7 | 0,7 | 0,7 | 3 |
| ML | -2,3 | -1 | 1 | 2,3 |
Tabell 1:. Pin Trimning Längder Denna figur visar de nödvändiga trimning längder i mm per stift för huvudbonaden. Längder för stift trimning förvärvades från en mushjärna atlas. After trimnings stift, matchar headpiece ytprofilen av hjärnan. 20 EMG stift är helt avskuren som de trådar som används för att spela in EMG-signal är fastlödda på stiftet stöta.
Figur 1:. Headpiece Components, Intermediate Construction trappan och korrekt anslutning för inspelning Denna figur visar den råvara som används för att skapa överstycken. Börjar med en 100 tapp kärl connecter, är mindre 2 x 7 och 2 x 1 komponenter skapas. Observera att i 2 x 1-komponent, är den ursprungliga kanten av 2 x 50 intakt, vilket tillåter konsekvent huvudbonaden konstruktion och tillåter en adapter för att ansluta till många implanterade möss. Figur 1B och 1C presentera de råvaror som behövs för att skapa adaptern från huvudstycket till förstärkaren. 1B presenterar huvudbonaden slutet avadaptern som på liknande sätt skärs ned för att ansluta till huvudbonaden. Observera att det 2 x 1 har återigen en ursprungskant från den råa komponenten, säkerställer korrekt anslutning mellan adaptern och huvudbonaden. Figur 1C visar änden av adaptern som ansluts till förstärkaren. Figur 1D visar epoxied 2 x 7 och 2 x 1 komponenter tillsammans med förberedda EMG kablar för signalinspelning. Figur 1E visar en färdig huvudbonad. Figur 1F visar en färdig adapter. Figur 1G visar en ordentlig koppling mellan stycken och adaptern. Slutligen visar figur 1H en implanterad mus med ansluten adapter och förstärkare. Förstärkaren chip är ansluten till en gränssnittskabel som går till upptagningskortet (ej visad). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Elektrod Montage och fullt utbyggt Headpiece Figuren visar elektrodplacering i förhållande till mushjärna. Elektrod platser baseras på stereotaktiska koordinater från bregma. Koordinater för varje elektrod kan hittas i steg 4.8 i protokollet. Elektrod färg motsvarar de underliggande hjärnregioner för varje elektrod. Vit = frontal förening cortex (FRA), Orange = primära motoriska cortex (M1), Rosa = sekundär motor cortex (M2), Mörkgrön = primära somatosensoriska cortex, forelimb regionen (S1FL), Grön = primära somatosensoriska cortex, dysgranular zon (S1DZ ) Ljusgröna = primära somatosensoriska cortex, fat fält (S1BF), gul = medial parietal förening cortex (MPTA), mörkblå = primära syncentrum (V1), Ljusblå = sekundär syncentrum, mediomedial område (V2MM), svart = retrosplenial dysgranular cortex (RSD). 20 gemensamma referens / Ground visas också. Denna referens system minimerar andnings artefakt inom råsignalen. Siffror i samband med varje enskild elektrod ger en kanal karta för hela gruppen. Bild modifierad från Allen Mouse Brain Atlas. 21,22 Figur 2B visar en fullt utbyggt headpiece att skala med avseende på en dime. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Exempel på EEG och EMG Spår från elektrod Montage Elektrod vågformer motsvarar kanalmappningen visas i figur 1A.. Cervical EMG (C) ger möjlighet att bestämma nack muskeltonus (+). EMG signaler innehåller också hjärt QRS elektriska impulser(*). Skala barer på 200 μV för spår amplitud och en sekund för spårtiden visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Fysisk Fördelning av Visual Evoked Potential geografiska fördelningen av den framkallade potentialen efter applicering av en ensidig ljusblixt endast administreras till vänster öga.. Övre diagrammet visar den med hög densitet EEG montage med varje cirkel representerar en elektrod. Färgförändring över tiden motsvarar spänningsförändringar över tiden för respektive elektrod. Vid tiden = 0 ms, är en 10 ms ljuspuls levereras och representerade i mitten figuren. Botten grafiskt illustrerar detta framkallade potentiella spår för kontra V1 och V2 EEG elektroder (n = 108 EP prövningar). ljus pulSE sker vid 0 ms. Observera att motsvarande framkallade potentialen respons observeras i kontra V1 (svart spår), följt av en längre latens evoked potential svar i kontra V2 (röd spår). (Högerklicka för att ladda ner).
Discussion
Billig konstruktion och kirurgiska åtgärder som krävs för att korrekt uppnå en 26-kanal, hög densitet EEG montage i en mus beskrivs. Korrekt epidural elektrodkontakt är avgörande för att förvärva kvalitet EEG-signaler i detta system. Två steg inom IP-adress denna fråga: stift trimning att matcha hjärnan kontur, och huvudbonaden implantation före akryl förstärkning. Det är viktigt att inte skära ett stift för kort under byggfasen. Vid implantering av de överstycken, är det absolut nödvändigt att kontrollera stiftplaceringen innan den slutliga akryl förstärkning. Ett sätt att bekräfta korrekt elektrodkontakt är genom impedans tester. Skenbart, impedans på 5-10 kQ föreslå korrekt epidural placering. 26 Impedansmätningar demonstrera överstycken 'hållbarhet, eftersom elektrod impedansvärden är stabila inom denna 5-10 kQ intervall under minst 4 månader efter implantation. Den andraviktigt steg innebär att rikta in EMG stiften med de två bakersta raderna i 2 x 7 EEG tegel. Detta är avgörande för adapteranslutning, som feljusterade EMG och EEG stift kommer att resultera i en oförmåga att ansluta adaptern eller böjda adapter stift.
En stor fördel med detta förvärv system är lätt att modifiera formen på elektroduppsättningen för att optimera olika experimentella behov. Anpassade elektrodarrangemang som är optimalt lämpade för specifika experiment lätt kan skapas. Anpassning för specifika experiment skulle kunna kombinera EEG med kanyl för riktad läkemedelstillförsel för kombinerad farmakologisk, elektroencefalografiska och beteendestudier. 27 stycken, adaptrar och kirurgiska ingrepp är enkelt anpassas till ett stort antal studier när man följer de metoder som beskrivs i protokollet ovan . En andra stor fördel med detta inhämtningssystemet är dess låga kostnad. För närvarande förvärvet systemet kanrekord 128 ingångskanaler på upp till 4 separata kablar, som tillåter samtidiga inspelningar från 4 möss eller om så önskas, råttor med galler med högre densitet. En sådan utvidgning skulle bara kräver extra kablar och adaptrar.
Detta sätt att hög densitet EEG förvärvet tar nackdelarna med andra hög densitet EEG förvärvsmetoder hos möss. Det system som beskrivs i detta arbete är behändigt konstrueras med enkla material och använder öppen hårdvara och mjukvara som är billig och stabil, tillåter upprepade mätningar i samma djur under månader, tillåter fri rörlighet under ett experiment, och kräver inte möss att vara bedövades för inspelning. Begränsningar i detta system är att det bara har validerats hittills i möss som väger 20 g eller mer, och är äldre än 12 veckor. Mindre eller yngre möss kan ha svårt med huvudbonaden implantation. En sekundär begränsning av denna metod är oförmågan att exakt kontrollera elektrod djup efter headpIECE tillverkning. Men samma begränsning gäller för traditionella skruv EEG elektroder eftersom det inte finns något sätt att exakt veta före slakt skruvdjup i förhållande till den kortikala ytan. Felsökning för denna metod typiskt involverar korrekt skärmning interfererande signal från musen när bundna för att erhålla brusfri signal.
Hög densitet EEG arrayer är viktiga för de komplexa Spatiotemporal analyser av EEG-data som är den nya normala i modern EEG tolkning. Även geografiska fördelningen av en visuell framkallade potentialen illustreras kan data som samlats in med hjälp av detta system analyseras med hjälp av elektriska källavbildningstekniker och nervkopplingar åtgärder. En minskning 60% till 70% i kontaktytan mellan dessa elektrodstift jämfört med traditionella skruvkontakter medger mer exakt signal lokalisering, såsom visas i figur 4. Under användning hög densitet analytiska tekniker i genetiskt modifierade möss, efter Pharmacological ingripande, eller djur med inneboende patologi såsom krampsjukdomar kan hjälpa urskilja de mekanismer som genererar specifika kortikala svängningar, lokalisera källor till ERP-system och EPs, och avslöjar storskaliga nätverksegenskaper. Genom bättre parallell mänskliga system, kommer denna metod att förbättra små djurmodeller för mänskliga neurofysiologi och neuropatologi, vilket ger enklare översättning av upptäckter som gjorts i gnagarmodeller till den vetenskapliga och kliniska relevansen hos människa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32 Channel RHD2132 amplifier headstage | Intan Technologies | C3314 | |
| Aquistion Board | Open Ephys | v2.2 | |
| 100 Position Receptable Connector | Digi-Key | ED85100-ND | Headpiece |
| Acetone (1 L) | Sigma Aldrich | 179973-1L | |
| Razor Blade (100 pack) | McMaster Carr | 3962A4 | |
| Wire-Cutting Pliers | MSC Industrial | 321786 | |
| 2-Part Epoxy | McMaster Carr | 7605A18 | |
| PFA Coated Silver Wire (25 ft) | A-M Systems | 787000 | EMG Wire |
| CircuitWriter Pen | MCM Electronics | 200-175 | Silver Applicator for Electrode Tips |
| 36 Position Dual Row Male Nano-Miniature Connector | Omnetics Connector Corporation | A79028-001 | Headpiece to Amplifier Adapter |
| Conn Strip Header 2 x 50 | Digi-Key | ED83100-ND | Headpiece to Amplifier Adapter |
| Clidox Base and Acitvator | Pharmacal | 95120F & 96120F | Sterilant |
| Isoflurane | Priamal Enterprises Ltd | 66794-019-10 | |
| Oxygen | Airgas | OX USP300 | |
| Closed Loop Temperature Controller | CWE Inc. | 08-130000 | |
| Curved Scissors | FST | 14085-09 | |
| 0.25% Bupivicaine Hydrochloride | Hospira | 0409-1159-02 | Local Anesthetic |
| Meloxicam 5mg/ml | Henry Schein | 6451602845 | Pain/Inflammation Relief |
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | 0409-4888-20 | Fluids |
| Cefazolin | Hospira | 0409-0806-01 | Antibacterial |
| No.11 Disposable Scapel (20 pk) | Feather | 2975#11 | |
| Micro Serrefines | FST | 18052-3 | |
| Cotton Swabs (1,000 pk) | MSC Industrial | 8749574 | |
| 0.5 mm Micro Drill Bit | FST | 19007-05 | |
| Stereotaxic Drill | Kopf | Model 1471 | |
| Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | |
| Methyl Methacrylate | A-M Systems | 525000 | Cement for headpiece |
| Methyl Methacrylate Crosslinking Compound | A-M Systems | 526000 | |
| Curved Hemostats | FST | 13003-10 | Aide in Adapter Connection |
| RHD2000 standard SPI interface cable (3ft) | Intan Technologies | C3203 | |
| Cantilever Arm | Instech | MCLA | |
| Micro Spatula (12 pk) | Fischer Scientific | S50822 | |
| Digital Soldering Station | MCM Electronics | 21-10115 | |
| Rosin Core Solder 60/40 Tin/Lead | MCM Electronics | 21-1045 | |
| Color Craze Nail Polish with Hardeners (Nitrocellulose based) | L.A. Colors | CNP508 | |
| Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console | Kopf | Model 940 |
References
- Choi, J. H., Koch, K. P., Poppendieck, W., Lee, M., Shin, H. -S. High resolution electroencephalography in freely moving mic. J. Neurophysiol. 104 (3), 1825-1834 (2010).
- Lee, M., Kim, D., Shin, H., Sung, H., Choi, J. H. High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode. J Vis Exp. (47), e2-e5 (2011).
- Megevand, P., Quairiaux, C., Lascano, A. M., Kiss, J. Z., Michel, C. M. A mouse model for studying large-scale neuronal networks using EEG mapping techniques. Neuroimage. 42 (2), 591-602 (2008).
- Sabourin, M. E., Cutcomb, S. D., Crawford, H. J., Pribram, K. EEG correlates of hypnotic susceptibility and hypnotic trance: spectral analysis and coherence. Int J Psychophysiol. 10 (2), 125-142 (1990).
- Miller, E. K., Wilson, M. A. All My Circuits: Using Multiple Electrodes to Understand Functioning Neural Networks. Neuron. 60 (3), 483-488 (2008).
- Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
- Kipke, D. R., et al. Advanced Neurotechnologies for Chronic Neural Interfaces: New Horizons and Clinical Opportunities. J Neurosci. 28 (46), 11830-11838 (2008).
- Logothetis, N. K., Kayser, C., Oeltermann, A. In Vivo Measurement of Cortical Impedance Spectrum in Monkeys: Implications for Signal Propagation. Neuron. 55 (5), 809-823 (2007).
- Michel, C. M., et al. Electric source imaging of human brain functions. Brain Res Rev. 36 (2-3), 108-118 (2001).
- Mitzdorf, U. Current source-density method and application in cat cerebral cortex: investigation of evoked potentials and EEG phenomena. Physiol Rev. 65 (1), 37-100 (1985).
- Cook, I. A., O'Hara, R., Uijtdehaage, S. H. J., Mandelkern, M., Leuchter, A. F. Assessing the accuracy of topographic EEG mapping for determining local brain function. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 107 (6), 408-414 (1998).
- Teplan, M. Fundamentals of EEG measurement. Meas Sci Rev. 2, 1-11 (2002).
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. a, Koch, C. The origin of extracellular fields and currents- EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Kahana, M. J. The Cognitive Correlates of Human Brain Oscillations. J Neurosci. 26 (6), 1669-1672 (2006).
- Olejniczak, P. Neurophysiologic basis of the EEG. J Clin Neurophysiol. 23 (3), 186-189 (2006).
- Thut, G. Modulating Brain Oscillations to Drive Brain Function. PLoS Biol. 12 (12), 1-4 (2014).
- Buzsáki, G., Draguhn, A. Neuronal Oscillations in Cortical Networks. Science. 304, 1926-1929 (2004).
- Crick, F., Koch, C. Towards a neurobiological theory of consciousness. Semin Neurosci. 2, 263-275 (1990).
- Murakami, S., Okada, Y. Contributions of principal neocortical neurons to magnetoencephalography and electroencephalography signals. J Physiol. 575 (3), 925-936 (2006).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 3rd ed. , Elsevier. New York. (2007).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Allen Mouse Brain Atlas. , Allen Institute for Brain Science. Available from: http://mouse.brain-map.org (2015).
- Berger, R. D., Akselrodv, S., Gordon, D., Cohen, R. J. An Efficient Algorithm for Spectral Analysis of Heart Rate Variability. IEEE Trans Biomed Eng. 33 (9), 900-904 (1986).
- Pan, J., Tompkins, W. J. A Real-Time QRS Detection Algorithm. IEEE Trans Biomed Eng. 32 (3), 230-236 (1985).
- Moody, G. B., Mark, R. G., Zoccola, A., Mantero, S. Derivation of Respiratory Signals from Multi-lead ECGs. Comput Cardiol. 12, 113-116 (1985).
- Thongpang, S., Richner, T. J., Brodnick, S. K., et al. A Micro-Electrocorticography Platform and Deployment Strategies for Chronic BCI Applications. Clin EEG Neurosci. 42 (4), 259-265 (2011).
- Laird, H. E. I., Hermansen, J. E., Huxtable, R. J. An electrode-cannula unit for intracerebral electrical stimulation, EEG recording and drug administration in small animals. Pharmacolgy Biochem Behav. 10 (2), 429-431 (1979).
