Abstract
técnicas de análise do eletroencefalograma avançados que exigem alta resolução espacial, incluindo imagens fonte elétrica e as medidas de conectividade de rede, são aplicáveis a uma crescente variedade de questões na neurociência. Executando esses tipos de análises em um modelo de roedor requer maior densidade eletrodo de eletrodos parafusos tradicionais pode realizar. Enquanto existem de alta densidade montagens electroencefalográficas para os roedores, eles são de disponibilidade limitada para a maioria dos investigadores, não são suficientemente robustos para experiências repetidas ao longo de um período prolongado de tempo, ou estão limitados à utilização em roedores anestesiados. 1-3 Um baixo custo proposto um método para a construção de alta contagem, conjunto de eléctrodos durável, transcraniana, que consiste em capacetes bilateralmente implantáveis é investigada como um meio para realizar análises avançada electroencefalograma em murganhos ou ratos.
Procedimentos para a fabricação capacete e cirúrgico de implantação necessary para produzir alto sinal ao ruído, eletroencefalograma baixa impedância e sinais de eletromiografia são apresentados. Embora a metodologia é útil em ambos os ratos e camundongos, este manuscrito centra-se na aplicação mais difícil para o crânio menor mouse. Livremente ratos móveis só são amarrados a cabos através de um adaptador comum durante a gravação. Uma versão deste sistema de eléctrodos que inclui 26 canais electroencefalográficas e 4 canais de eletromiográficas é descrito abaixo.
Introduction
A atividade neuronal pode ser gravado extracelularmente com vários níveis de granularidade de microscópicos (potenciais de ação individuais) para mesoscópicos (potenciais de campo locais) para macroscópica (eletroencefalograma). Esses traços de ondas cerebrais são classicamente analisados no domínio da freqüência para caracterizar comportamental, neurofisiológica, ou estados eletrofisiológicas. Isto pode ser feito com um único biopotencial, 4, mas EEG densidade esparsas não pode resolver o componente espacial da actividade neuronal. Análise eletroencefalograma moderna depende de vários eletrodos para produzir mapas detalhados da distribuição espaço-temporal da atividade cortical, a fim de correlacionar essa actividade com condições psicológicas específicas e processos fisiológicos. 5-7 Duas das categorias mais comumente usados de análise que necessitam de alta densidade montagens de EEG são imaging fonte elétrica e as medidas de conectividade de rede neural. 8-11
12-15 Desde EEG tem alta resolução temporal, os estudos de EEG possibilitar a avaliação em tempo real dos ERPs e EPs, bem como a análise temporal preciso post hoc. 3,11 , 12
Associando estados e funções cognitivas com a interação de oscilações vistas no electroencefalograma é o objetivo final das várias medidas de conectividade de rede neural. Numerosos estudos têm mostrado sincronização e bloqueio de fase de oscilações entre as diferentes regiões do cérebro estão associados com estados específicos de excitação, atenção e ação 6,13,14,16-19.
localização da fonte e da rede de análise de sinais de EEG originou com estudos em humanos, mas as investigações sobre a base neuronal para estes sinais envolve necessariamente modelos animais, como eles exigem técnicas invasivas que são impossíveis em seres humanos. A fim de replicar essas análises em modelos de roedores, é necessário um método para capturar sinais de EEG de alta densidade no cérebro de um roedor. Embora outros grupos construíram matrizes de microeléctrodos de alta densidade para utilização em ratinhos, tais abordagens são de disponibilidade limitada para os investigadores não têm acesso a instalações nanofabrico, não são suficientemente robustos para experiências repetidas ao longo de um período prolongado de tempo, ou são limitados à utilização em anestesiado camundongos. 1-3,7 Um protocolo alternativo de baixo custo para a construção de alta densidade crônica, transcraniana eletrodo arraY é demonstrada aqui.
A abordagem aqui descrita a aquisição de sinal não está limitado ao EEG, mas inclui sinais eletromiográficas (EMG). Aquisição de sinais de EMG pode ser uma abordagem complementar para a definição de estado de comportamento e é particularmente útil para estudos do sono. Esta abordagem proporciona um intermediário entre caro, ultra-alta densidade grades intracranianas, e os números de chumbo limitadas possíveis com eletrodos parafusos tradicionais que são insuficientes para abordagens de análise avançadas. O design capacete é facilmente construído e acessível para estudos de alto rendimento. A utilização deste sistema de aquisição em conjunto com técnicas de manipulação genética ou farmacológicas variadas dentro de modelos de roedores pode ajudar a descobrir os mecanismos de geração cortical oscilação, divergências de comportamento de verdadeiras diferenças genotípicas, localização de fontes de ERPs e EPs, e comunicação de rede em grande escala.
Protocol
Os estudos realizados ao longo desta investigação estavam de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade da Pensilvânia.
1. Headpiece Concepção e Construção
- Remover cada oitava linha de pinos do pino de tijolo 2 x 50 de um conector de recipiente 100 com a posição de um par de pinças, empurrando a porção de receptáculo do pino através do tijolo de plástico.
Nota: pinos virados no sentido descendente será a orientação que será referenciado para o resto do protocolo. (Tome nota desta especificamente no 2.6). - Cobrir os pinos com um casaco muito leve de unha polonês para isolar e deixar a unha polonês secar completamente.
- Retirar a unha polonês a partir das pontas dos pinos com acetona e um pano pequeno.
- Apare o excesso de plástico do 2 x 7 do usando uma lâmina de barbear ou o corte do arame ppessoas mentirosas. Isto irá resultar em 2 x 7 tijolos que são isoladas ao longo do comprimento dos pinos e expostos na ponta do pino. Estes irão eventualmente tornar-se os eletrodos de EEG transcraniana. Duas 2 x 7 de tijolos são necessárias para um conjunto de eléctrodos crónica completo (Figura 1A).
- Corte dois 1 x 2 tijolos de pinos para a gravação do sinal EMG. Usar o mesmo processo de remoção de pinos não desejados com uma pinça e cortando o excesso de plástico distância para criar os tijolos 1 x 2. Certifique-se estas 1 x 2 de ter um lado bom para eles a partir do original 100 Posição do receptáculo como essa distância se tornará a distância pinos padrão para cada capacete assim que um único adaptador irá funcionar para todos os capacetes (Figura 1A).
- Use 2-epóxi parte para prender a peça pino 1 x 2 para o 2 x 7 pin peça (Figura 1D).
- Como os dois conjuntos de pinos devem estar na mesma orientação, o epóxi 1 x 2 na face lateral de ambas as metades da peça de cabeça com os lados lisos das 1 X 2 e X 27 contactar uns aos outros. Alinhe os 1 x 2 furos e pinos com as posteriores-mais 2 linhas de pinos no 2 x 7.
Nota: As duas metades do capacete não são epoxied juntos. Isto permite flexibilidade para dentro das duas metades da peça de cabeça adaptador para facilitar a conexão de habituação, e durante os dias experimentais (Figura 1E). - Deixe as metades headpiece curar durante a noite. Após a conclusão, o capacete é bilateralmente simétrico. Cada metade consiste de um pino de 2 x 7 de tijolo com uma lateralmente anexada 2 x 1 tijolo pino que está em linha com a parte posterior a maioria das 2 fileiras do pino 2 x 7 de tijolo.
- Como os dois conjuntos de pinos devem estar na mesma orientação, o epóxi 1 x 2 na face lateral de ambas as metades da peça de cabeça com os lados lisos das 1 X 2 e X 27 contactar uns aos outros. Alinhe os 1 x 2 furos e pinos com as posteriores-mais 2 linhas de pinos no 2 x 7.
- Prepare os fios para a gravação do sinal EMG. De cadeia simples, 31 L de fio de prata com isolamento perfluoroalcoxi é utilizado para a gravação do sinal de EMG (Figura 1D). No entanto, multifilar ou outras ligações de metal pode ser substituído se desejado.
- Para criar fios EMG torácicas dar uma 3,0 cm longo pedaço de fio de prata perfluoroalkoxy isolado e remove 1 cm de isolamento de plástico a partir de uma extremidade, com uma lâmina de barbear. Enrolar o fio não isolado em torno de um par de pinças de duas vezes. Remover o fio de a pinça e retirar 25 mm de isolamento na extremidade não enrolada com uma lâmina de barbear.
- Para construir fios EMG cervicais, repetir o processo com um segmento de 1,5 centímetro do fio. Dois fios EMG cervicais e dois fios EMG torácicas são necessários para um capacete completo.
- Remover o pino lateral na linha mais anterior de ambos os capacetes, o que corresponde a um coordenadas estereotáxicas de 3,3 mm anterior de bregma e 2,3 mm lateral da bregma, como não há cérebro sob este local, tal como determinado por um atlas cerebral do rato 20 (Figura 2A).
- Em ambas as metades headpiece, cortar os pinos do tijolo 1 x 2 à base de plástico da peça de cabeça com um par de cortadores de fio (3,0 mm a partir da ponta do pino) e soldar o fio de EMG do colo do útero para o pino anterior e o torácica EMG à posterior pdentro.
- Verifique se cada pino é electricamente isolada. Realizar um teste de continuidade com um multímetro digital, ligando os dois terminais do voltímetro para diferentes pinos, enquanto no modo de continuidade. Eletricamente isoladas pinos não produzirá um sinal sonoro com este teste multímetro; no entanto, pinos acopladas electricamente vai. Cobrir as juntas soldadas com polonês unha e uma vez seco, dobrar os fios de EMG de tal modo que eles estão em paralelo ao eixo anterior / posterior com o deslocamento lateral mínimo.
- pinos de acabamento a um comprimento relativo de tal modo que elas coincidam com o perfil da superfície do cérebro.
- Com o auxílio de um rato atlas do cérebro, recorde de distância ventral à superfície cerebral de bregma para cada pino de coordenadas. 20 O pino cuja distância ventral a partir de bregma é o maior servirá de indicador para o pino de corte. Este pino não será cortado, enquanto todos os outros pinos vai ser cortado com respeito a este pino ventral distância máxima (Tabela 1).
Nota: Pinos pode ser moído para baixo para tamanho, mas isso deve ser feito com cuidado, pois o atrito entre o pino e rebolo pode causar os pinos do capacete para dobrar. Se um pino estiver torto, use uma pinça para endireitá-la. Uma alternativa para a moagem dos pinos para baixo para o comprimento é a ajustá-las com um par de alicates de corte do fio.
- Com o auxílio de um rato atlas do cérebro, recorde de distância ventral à superfície cerebral de bregma para cada pino de coordenadas. 20 O pino cuja distância ventral a partir de bregma é o maior servirá de indicador para o pino de corte. Este pino não será cortado, enquanto todos os outros pinos vai ser cortado com respeito a este pino ventral distância máxima (Tabela 1).
- Cobrir todas as dicas pinos com uma solução de prata usando uma solução de caneta de prata e deixe secar. Este passo reduz impedâncias dos eléctrodos para ≤30 kW, o que aumenta a relação sinal-ruído e simultaneamente elimina as arestas causado pelo pino de corte, portanto, diminuindo a probabilidade de danos nos tecidos e acelerar a recuperação de uma cirurgia. A preenchido pesos meio headpiece aproximadamente 0,5 g.
2. Adaptador de Construção e Mapeamento Canal
- Corte os fios do conector de um conector 36 de dupla posição Masculina Fila Nano-diminuto a um comprimento uniforme de 2 ou 3 cm, utilizando uma lâmina de barbear. Para cada fio, starrancar 2,5 mm de isolamento a partir do final e estanho do metal exposto para cada fio. Certifique-se quando estanhar a ter um único fio, fina de fio estanhado para cada fio adaptador nano como este é fundamental para isolar dos pinos. Cortando o isolamento despojado com um alicate de corte fio (Figura 1C).
- Criar um conector macho / macho de correspondência para o capacete usando Conn Faixa Cabeçalho 2 x 50. Corte dois 2 x 7 do e dois 2 x 1 do de um 2 x 50 tijolos. Remova os pinos indesejados do 2 x 50 tijolos rompendo um dos pinos do sexo masculino, e empurre a segunda metade inteira da mesma peça fora do conector com um par de pinças (Figura 1B).
Nota: Um lado destes pinos servirá como adaptador de pinos para conectar em cada capacete, enquanto a outra metade vai ser soldados aos fios do conector nano enlatados. Certifique-se de ter as bordas de plástico planas do toque 2 x 1 e 2 x 7 para garantir o acasalamento adequado do conector macho / masculino com o capacete criado na etapa1. - Solda em um dos fios de terra / de referência do conector nano ao pino terra / referência desejado. fios de terra e de referência estão amarrados juntos no chip amplificador RHD2132. Use o único pino que é de 0,60 mm anterior ao bregma e 1,00 mm lateral do bregma tanto como referência e terra. (Esquerda peça de cabeça, do pino medial da terceira fila mais anterior, no entanto, qualquer outro pino poderia ser atribuído, se preferido, Figura 2.) Note-se que é possível separar do solo e de referência sobre o chip amplificador removendo o resistor 0Ω que une chão e de referência em conjunto, se isolar os dois é desejado.
- Soldar os fios do conector nano enlatados para o mesmo lado dos conectores macho / macho como a conexão pino terra / referência. Cada fio mapeia para um canal específico, de modo a configuração de canais pode ser concluída neste momento. diagramas de mapa de canal para os headstages amplificador são encontrados no local do Open Ephys Wiki (https://open-ephys.atlassian.net/wiki/display/OEW/Home). Soldar o fio correspondente cujo canal é conhecido para o respectivo pino de alcançar o mapeamento desejado.
- Cortar os fios não utilizados na base do conector nano com o alicate de corte fio.
- Use um voltímetro para garantir que cada pino é eletricamente isolado de todos os outros pinos. Uma vez que o isolamento seja confirmada, aplique uma fina camada de unha polonês em torno de cada junta de solda para isolar ainda mais cada pino.
- Usando 2-epóxi parte, reforçar o adaptador correspondente nano às bilaterais 2 x 7 e 2 x 1 pinos dos tijolos homem-macho.
Nota: Haverá duas metades para este único adaptador que coincidir com o arranjo de pinos das metades headpiece criados anteriormente. É crítico para se certificar de que a parte central de cada metade do adaptador não têm excesso de epoxi transbordando a borda de plástico do conector macho / macho, pois isso irá impedir que as duas metades da peça de cabeça a ser ligado simultaneamente. Não permitem qualquer epóxi para fluir para a parte inferior do adaptador POR pinoção do adaptador, pois isso impediria também conexões apropriadas. Use as 2 metades headpiece como um molde para um alinhamento adequado pinos. - Epóxi ambas as metades do adaptador e epoxi à base do conector nano para aumentar a sua durabilidade. Certifique-se de cobrir todas as juntas de solda com epóxi. Deixe o dia para o outro adaptador de cura.
- Confirmação de mapeamento de canal adequado pode ser realizada utilizando medidas de impedância na interface gráfica do usuário Open-Ephys (GUI). Um adaptador de completada pesa aproximadamente 1,3 g (Figura 1F).
3. Cirurgia
- Prepare um campo cirúrgico estéril.
- Usar luvas estéreis e outros equipamentos de protecção individual exigido. Esterilizar ferramentas num autoclave. Esterilizar a moldura estereotáxica com uma solução de dióxido de cloro de 1,0 mm. Pulveriza-se a solução sobre a armação e esperar cinco minutos antes da lavagem com água esterilizada.
- Para esterilizar headp implantávelpartes IECE, pulverizar os componentes com uma solução de dióxido de cloro 1,0 mM, e espere 5 minutos antes de enxaguar com água estéril. Coloque o hardware implantável agora estéril numa placa de Petri estéril.
- Obter um peso pré-cirúrgico para o mouse, em seguida, anestesiar o mouse em uma câmara de indução de 200 ml usando 1,5-2,0% de isoflurano em 100% de oxigênio. Use uma taxa de fluxo para a câmara de cerca de 500 ml / min.
- Confirmar a perda do reflexo de endireitamento, rodando a câmara de indução. Remover o rato da câmara de indução e local para o cone do nariz na armação estereotáxica sem garantir completamente a cabeça do rato com as barras de ouvido. Continuar a acompanhar para o bom profundidade da anestesia por avaliação toe pitada ao mesmo tempo, avaliar os sinais vitais.
- Manter a temperatura do corpo a 37 ° C com um controlador de temperatura de circuito fechado, tal como um sistema de almofada de aquecimento e sonda rectal. Cubra os olhos do rato com pomada oftálmica antes de cortar para fora da pelena parte superior do crânio usando tesoura curva ou alicate. Desinfectar a cabeça com betadine e permitir que o betadine para secar completamente antes de prosseguir.
- Administrar analgésicos e antibióticos, juntamente com fluidos por via intraperitoneal. Para um ratinho de 25 g, 0,5 mg cefazolina, 0,125 mg de meloxicam, 0,5 ml de solução salina, e 2,5 ug de buprenorfina Q HR 6/4 PRN.
- Injectar 250 mL de 0,25% por via subcutânea bupivacaína ao longo da linha média sobre a cabeça, e injectar 100 ul 0,25% por via subcutânea bupivacaína em ambos os arcos zigomáticos do mouse.
- Garantir o mouse no quadro estereotáxico e expor o crânio.
- Proteger a cabeça do rato com as barras de ouvido estereotáxica para o quadro estereotáxico. Certifique-se de que o rato é num plano cirúrgico de anestesia, confirmando a ausência do reflexo do pé pitada. Criar um 1,5-2,0 cm de incisão ao longo com um bisturi descartável No. 11 ao longo da linha média do crânio. A incisão vai começar a partir de entre os olhos e continuar posteriormente ao occipital. </ Li>
- Expor o crânio por espalhar a pele lateralmente com micro grampos. Reduzir a concentração de isoflurano, de 2,0% para uma concentração que mantém um plano cirúrgico de anestesia, mas não reduzem a inferior a 1,0% de isoflurano em 100% de oxigénio. analgesia pré-operatória reduz a quantidade de anestésico inalado necessária para manter uma profundidade de anestesia cirúrgica, e pode levar a uma recuperação mais rápida e os resultados de sobrevivência melhoradas.
- Nivelar os buracos da rebarba do crânio e de perfuração.
- Identificar bregma e zero as coordenadas estereotáxicas no bregma, que se torna a origem do sistema de coordenadas. Para nivelar o crânio no eixo medial / lateral, mover uma sonda de nivelamento anexado a um braço manipulador estereotáxica 1,50 mm para os lados em ambas as direções a partir de bregma e confirmar que o dorsal / profundidade ventral é inferior a 0,05 mm, quando os contatos da sonda à esquerda e à direita os lados do crânio.
Nota: A resolução da dorsal / ar manipulador ventral 10 mm usado em conjunto com um digital exibição de coordenadas simplifica nivelamento. O nivelamento do eixo anterior / posterior sobre bregma segue a mesma técnica. A diferença na distância ventral para contactar bregma e Lamda também deve ser inferior a 0,05 mm.- Ajustar o crânio até nivelamento é completa em ambos os sentidos, de modo que o plano transversal é paralelo ao chão. Isso permite que para os verdadeiros coordenadas estereotáxicas como pode ser visto no atlas do cérebro do rato 20.
- Com um diâmetro pouco micro broca 0,5 milímetros dentro de uma broca estereotáxica, furos de broca da rebarba de 3,30 mm anterior para 4,50 mm posterior ao bregma em incrementos de 1,30 mm a 1,00 mm para os lados da linha média em ambas as metades do crânio. Para os 2,30 mm colunas laterais de eléctrodos, furos de broca da rebarba de 2,00 mm anterior ao bregma a 4,50 mm posterior ao bregma, em incrementos de 1,30 mm em ambos os lados da linha média (Figura 2). A elevada exactidão e precisão que é necessário para este droperação Illing é simplificada a resolução de um braço manipulador estereotáxica digital de 10 mm.
Nota: Para que os pinos do capacete para ser devidamente implantado, o crânio do mouse deve ser firmemente no lugar dentro do quadro estereotáxico. Se o crânio se move durante a perfuração, o desalinhamento dos buracos headpiece e rebarba pode seguir.
- Identificar bregma e zero as coordenadas estereotáxicas no bregma, que se torna a origem do sistema de coordenadas. Para nivelar o crânio no eixo medial / lateral, mover uma sonda de nivelamento anexado a um braço manipulador estereotáxica 1,50 mm para os lados em ambas as direções a partir de bregma e confirmar que o dorsal / profundidade ventral é inferior a 0,05 mm, quando os contatos da sonda à esquerda e à direita os lados do crânio.
- Implantar os capacetes.
- Com uma pinça reta, prepare túneis fio EMG para os fios EMG torácicas. Enterrar 2,5 cm entre a pele e os músculos na parte de trás para ambos os fios EMG esquerdo e direito. Insira o torácicas e EMGs do colo do útero na cavidade criada com a pinça reta primeiro e, em seguida, manobrar o tijolo EEG com uma pinça curva de tal forma que os pinos alinhados com os orifícios da rebarba previamente perfurados.
- Aplique uma leve pressão sobre o capacete e mexer os pinos no crânio. diâmetro do pino é 0,46 mm. Com isolamento unha polonês, os pinos vai encaixar bem na rebarba perfurado holes. O capacete será estável, uma vez que está devidamente inserido. Ajuste fios EMG para posições finais. Repetir o mesmo processo para a peça de cabeça no outro lado.
- Prenda o capacete no lugar usando cimento dental.
- Quando ambos os capacetes são fixados no lugar, mistura 1: 1 de metacrilato de metilo com o composto reticulante. Aplique a mistura tal que cubra o crânio exposto, peças-polido unhas dos eletrodos de pino, e porção proximal dos fios EMG, mas não cobre os receptáculos femininas do capacete.
- Certifique-se de não ficar de cimento na pele. Não permitem cumes de cimento para formar que o mouse será capaz de agarrar. Garantir tempo suficiente para que o cimento secar, e em seguida, remover o mouse do quadro estereotáxico. O peso total que o mouse vai ter de fazer é a partir dos 2 metades do capacete e do cimento de fixação é de aproximadamente 1,2 g.
- Colocar o animal em um ambiente limpoárea de recuperação.
- Manter a temperatura corporal central com uma almofada de aquecimento. Monitorar o mouse até que ele recupere todos os reflexos posturais, significando a emergência da anestesia. habitação individual é recomendado para recuperação de longo prazo.
- acompanhamento diário por um período mínimo de 3 dias após a cirurgia é recomendada com analgesia intervencionista. Permitir 10-14 dias de recuperação pós-operatório antes de iniciar um período de habituação tethered.
4. Os animais se habituam a Tethering
- Ligue o adaptador para o rato usando um encosto de cabeça do rato (Figura 1G-H). Segure-se em cantos opostos do headpieces que são cimentadas no lugar com hemostats curvas uma vez que o rato é contido e, lentamente, insira os pinos do adaptador para o capacete implantado em ambos os lados.
- Ligue o amplificador de 32 canais ao adaptador (Figura 1H). Certifique-se de alinhar os logotipos em ambos, o adaptador e um amplificador em uma coorientação nsistent tanto para o adaptador e o amplificador para evitar erros de mapeamento de canal. Conecte o amplificador a um cabo RHD2000 padrão de interface periférica de série (SPI). Este cabo irá se conectar ao sistema de aquisição para a gravação do sinal.
- Colocar o rato dentro de uma câmara que tem um braço em consola instalada na parede da câmara. Anexar o cabo de interface SPI para o braço em consola e ajustar a tensão no braço de comutação para contrabalançar o peso do cabo de fio. O rato é capaz de mover-se livremente e está habituado durante uma hora por dia na semana antes da gravação.
- Para desligar o mouse, basta desconectar o cabo eo adaptador do rato enquanto estiver usando uma espátula de aço inoxidável micro plano para auxiliar na desligar o transformador do mouse.
Setup 5. Signal Extraction Sistema de Gravação / Sinal
- Ligue o adaptador construído para o capacete de um rato implantado. Ligar um amplificador headstage ao adaptador econectar um cabo de interface padrão SPI para o amplificador e à placa de aquisição. Tem o cabo SPI anexar a um cantilever com a tensão adequada para que o peso adicional sobre a cabeça do rato é minimizado.
- Coloque uma gaiola de Faraday locais, criado usando a realização de malha ou folha de alumínio, em torno do headstage e aterrar a gaiola de Faraday locais.
- Obter impedâncias eletrodo antes do início de cada gravação, selecionando a 30 kS / sec taxa de amostragem e medir impedâncias através do módulo na GUI. Um valor de impedância inferior ou igual a 10 kW por um pino indivíduo é necessário para confirmação de contacto de eléctrodo apropriado. Os valores de impedância mais altos resultam em dados rejeitados desse eletrodo.
- Para gravar, criar uma cadeia de sinal do Ritmo FPGA, filtro de banda, e LFP espectador na GUI. Recomenda-se para selecionar uma taxa de amostragem de 1,00 kS / s, largura de banda de 0.1-7,500 Hz e desmarque DSP. Defina o filtro de banda de 0,1-250 Hz e exibir os canais por opening o espectador LFP. 250 e 400 amplitudes canal mV com o método de sorteio selecionados melhor visualiza os dados.
- Começar a gravar usando a GUI. Crie uma nova pasta para cada gravação e definir o caminho para salvar arquivos para essa pasta. Para começar uma gravação simplesmente bateu recorde. Todos os 32 canais do conector são registados por padrão, mas canais indesejados pode ser desmarcou clicando no lado direito do módulo de ritmo FPGA antes do início da gravação.
- Importar dados para Matlab para análise. Há uma infinidade de caixas de ferramentas open-source que podem ser usados para ajudar na análise.
Representative Results
Os dados da amostra gravados num rato se mover livremente implantado com um EEG capacete de alta densidade é mostrado na Figura 3. Formas de onda de EEG individuais correspondem ao esquema de mapeamento de canal mostrado na Figura 2. Exemplos de EMG cervical e torácica são também apresentados na Figura 3. Note-se que a gravação EMG torácica contém também actividade eléctrica proveniente incorporado no coração do rato que se torna prontamente aparente quando um sinal diferencial entre os dois fios de EMG torácicas (t) é calculada. Com esta gravação é também possível calcular a frequência cardíaca do rato, medindo o tempo entre picos QRS electrocardiográficas. 23-24 Do mesmo modo, é possível medir a frequência respiratória do rato por meio do cálculo variabilidade fásica do pico de QRS como a cavidade torácica se expande e contratos com cada respiração. 25 Assim, o permitir instalação para aquisição opolissonografia murino f. Além disso, a configuração permite o mapeamento cortical dos potenciais evocados visuais (Figura 4). Quando a 10 de pulso ms de luz é entregue apenas para o olho esquerdo do rato, respostas clássicas são registrados no córtex visual primário contralateral (mas não ipsilateral) que são seguidas por uma resposta atrasada no córtex visual secundária contralateral. O filme incorporado na Figura 4 mostra o tempo variando potenciais eléctricos através de toda a superfície cortical juntamente com os gráficos de actividade em V1 e V2 contralateral.
| AP | ||||||
| 3.3 | 0 | 0 | ||||
| 2 | 0,4 | 0,6 | 0,6 | 0,4 | ||
| 0,7 | 0,6 | 0,9 | 0,9 | 0,6 | ||
| -0.6 | 0,9 | 1 | 1 | 0,9 | ||
| -1.9 | 1 | 1.1 | 1.1 | 1 | ||
| -3.2 | 3 | 1 | 1 | 1 | 1 | 3 |
| -4.5 | 3 | 0,7 | 0,7 | 0,7 | 0,7 | 3 |
| ML | -2.3 | -1 | 1 | 2.3 |
Tabela 1:. Pin aparamento Lengths Esta figura mostra os comprimentos de corte necessárias, em mm, por pino para o capacete. Comprimentos para pin corte foram adquiridos a partir de um atlas do cérebro do rato. After corte pinos, o capacete corresponde ao perfil da superfície do cérebro. 20 EMG pinos são completamente cortada como os fios utilizados para gravar sinal EMG são soldados para o topo pinos.
Figura 1:. Headpiece Componentes, Intermediário passos de construção e conexão adequada para a gravação Esta figura mostra a matéria-prima utilizada para criar headpieces. Começando com um conector de receptáculo 100 do pino, menores 7 e 2 x 2 x 1 componentes são criados. Note-se que no componente 2 x 1, o bordo inicial do 2 x 50 está intacta, a qual permite a construção capacete consistente e permite a um adaptador para ligar a muitos ratinhos implantados. Figura 1B e 1C apresentam as matérias-primas necessárias para criar o adaptador a partir da peça de cabeça para o amplificador. 1B apresenta a extremidade da peça de cabeçao adaptador que semelhante é cortada para se conectar ao capacete. Note-se que que 2 x 1 tem novamente um bordo de origem a partir do componente em bruto, assegurar a ligação adequada entre o adaptador e a peça de cabeça. A Figura 1C mostra a extremidade do adaptador que se liga ao amplificador. A Figura 1D ilustra o epoxied 2 x 7 e 2 x 1 componentes, juntamente com fios EMG preparados para gravação de sinal. Figura 1E demonstra um capacete completo. Figura 1F mostra um adaptador concluída. Figura 1G mostra uma ligação entre os headpieces e do adaptador. Por último, a Figura 1H mostra um rato implantado com adaptador e amplificador ligado. O chip amplificador é conectado a um cabo de interface que vai para a placa de aquisição (não mostrado). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Eletrodo Montagem e Headpiece totalmente construído Esta figura mostra a colocação do eletrodo em relação ao cérebro do rato. localizações dos eléctrodos são baseados em coordenadas estereotáxica de bregma. Coordenadas para cada eléctrodo pode ser encontrado na etapa 4.8 do protocolo. cor eléctrodo corresponde às regiões cerebrais subjacentes para cada eléctrodo. Branco = frontal córtex de associação (FRA), Orange = motor primário córtex (M1), Rosa = secundário córtex motor (M2), verde escuro = primário córtex somatosensorial, região membro anterior (S1FL), Verde = primário córtex somatosensorial, zona dysgranular (S1DZ ), Luz verde = córtex somatossensorial primário, campo barril (S1BF), Amarelo = parietal medial associação córtex (MPTA), azul escuro = primário córtex visual (V1), azul claro = córtex visual secundário, área mediomedial (V2MM), preto = dy retrospl�icocórtex sgranular (RSD). 20 Comum de Referência / Chão é mostrado também. Este esquema de referência minimiza artefato respiratória dentro do sinal bruto. Números associados com cada um dos eléctrodos individuais fornecer um mapa de canal para todo o conjunto. Imagem modificada de Allen rato Cérebro Atlas. 21,22 A figura 2B mostra um capacete totalmente construído à escala com respeito a um centavo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exemplo de EEG e EMG Traços do eléctrodo Montagem de formas de onda de eléctrodos correspondem ao mapeamento de canal mostrado na Figura 1A.. EMG Cervical (C) fornece a capacidade de determinar o tônus muscular nucal (+). sinais EMG também contêm cardíacos impulsos elétricos QRS(*). Barras de escala de 200 mV para amplitude do traço e 1 segundo para a duração de rastreamento são apresentados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Distribuição Espacial da Visual potencial evocado Distribuição espacial do potencial de aplicação a seguir evocados de um flash de luz unilateral administrado apenas para o olho esquerdo.. diagrama superior mostra a alta densidade de montagem EEG com cada círculo representando um eletrodo. Mudança de cor ao longo do tempo corresponde a variações de tensão ao longo do tempo para cada respectivo eletrodo. No tempo = 0 ms, um impulso de 10 ms de luz é entregue e representado na figura do meio. gráfico de fundo ilustra significa vestígios potenciais evocados para contralateral V1 e V2 EEG eletrodos (ensaios n = 108 EP). pul luzSE ocorre em 0 ms. Note-se que a resposta de potencial evocado correspondente é observada em V1 contralateral (traço preto), seguido por uma latência mais tempo de resposta evocada potencial V2 contralateral (traço vermelho). (Clique direito a download).
Discussion
A construção de baixo custo e passos cirúrgicos necessários para atingir adequadamente a 26 canais, de alta densidade EEG montagem em um rato é descrita. contato do eletrodo peridural adequado é fundamental na aquisição de sinais de qualidade EEG neste sistema. Dois passos dentro do protocolo endereço esse problema: pin corte para coincidir com o contorno do cérebro, ea implantação capacete antes de reforço acrílico. É importante para não cortar um pino muito curta durante a fase de construção. Ao implantar os headpieces, é imperativo para verificar o posicionamento do pino antes do reforço de acrílico final. Uma forma de confirmar contato do eletrodo adequada é através de testes de impedância. Aparentemente, impedância de 5-10 kW sugerem a aplicação da epidural adequada 26. As medições de impedância demonstrar a durabilidade dos capacetes, como valores de impedância dos eletrodos são estáveis dentro desta gama de 5-10 kW por pelo menos 4 meses após o implante. O outropasso essencial envolve alinhando os pinos EMG com as duas posteriores-mais linhas do 2 x 7 EEG tijolo. Isto é crítico para conexão com o adaptador, como EMG desalinhado e EEG pinos irá resultar em uma incapacidade de conectar o adaptador ou pinos do adaptador dobrados.
Uma grande vantagem deste sistema de aquisição é a facilidade de se alterar a forma do conjunto de eléctrodos, a fim de optimizar as necessidades experimentais variadas. arranjos de eletrodos personalizados que são perfeitamente adequados para experimentos específicos podem ser facilmente criados. Personalização para experiências específicas poderiam combinar EEG com a cânula para a entrega de drogas dirigido por farmacológica combinada, eletroencefalograma e estudos comportamentais. 27 Headpieces, adaptadores e procedimentos cirúrgicos são facilmente adaptado para um grande número de estudos, quando seguindo os métodos descritos no protocolo acima . Uma segunda grande vantagem do presente sistema de aquisição é o seu baixo custo. Presentemente, este sistema de aquisição podeficha 128 canais de entrada de até 4 cabos separados, permitindo gravações simultâneas a partir de 4 ratos ou se desejado, ratos com grades de maior densidade. Tal expansão exigiria apenas cabos extras e adaptadores.
Esta abordagem para a aquisição de alta densidade EEG aborda inconvenientes dos outros métodos de alta densidade de aquisição do EEG em ratos. O sistema descrito neste trabalho é manhosamente construídas com materiais simples e usa hardware de código aberto e software que é barato e estável, permite medições repetidas no mesmo animal ao longo de meses, permite a livre circulação durante um experimento, e não necessita de ratos para ser anestesiados para a gravação. As limitações deste sistema é que ele só foi validado até o momento em ratos que pesam 20 g ou mais e são mais de 12 semanas. camundongos menores ou mais jovens podem ter dificuldade com a implantação capacete. Uma limitação secundário desta metodologia é a incapacidade de controlar com precisão a profundidade do eletrodo após headpfabricação IECE. No entanto, esta mesma limitação se aplica a eletrodos parafuso EEG tradicionais, pois não há maneira de saber com precisão a profundidade de rosca pré-mortem em relação à superfície cortical. Solução de problemas para este método envolve tipicamente protegendo adequadamente sinal de interferência do rato quando conectado, a fim de obter o sinal sem ruído.
De alta densidade matrizes de EEG são essenciais para as análises espaço-temporais complexos de dados EEG que são o novo normal na interpretação moderna EEG. Enquanto distribuição espacial de um potencial evocado visual é ilustrado, os dados adquiridos utilizando este sistema pode ser analisado utilizando técnicas de imagem de fonte eléctrica e medidas de conectividade neuronais. Uma redução de 60% a 70% da área de contacto entre estes pinos de eléctrodo em comparação com os contactos de parafuso tradicionais de sinal permite a localização mais preciso, tal como mostrado na Figura 4. Empregando-alta densidade técnicas analíticas em murganhos geneticamente modificados, seguindo Pharmacolintervenção ogical, ou em animais com patologia intrínseca, tais como doenças convulsivas podem ajudar a discernir os mecanismos que geram oscilações corticais específicas, localizar fontes de ERPs e EPs, e revelam propriedades de rede em grande escala. Por melhores sistemas humanos de paralelismo, esta abordagem irá melhorar pequenos modelos animais de neurofisiologia humana e neuropatologia, proporcionando mais fácil tradução de descobertas feitas em modelos de roedores com a relevância científica e clínica em seres humanos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32 Channel RHD2132 amplifier headstage | Intan Technologies | C3314 | |
| Aquistion Board | Open Ephys | v2.2 | |
| 100 Position Receptable Connector | Digi-Key | ED85100-ND | Headpiece |
| Acetone (1 L) | Sigma Aldrich | 179973-1L | |
| Razor Blade (100 pack) | McMaster Carr | 3962A4 | |
| Wire-Cutting Pliers | MSC Industrial | 321786 | |
| 2-Part Epoxy | McMaster Carr | 7605A18 | |
| PFA Coated Silver Wire (25 ft) | A-M Systems | 787000 | EMG Wire |
| CircuitWriter Pen | MCM Electronics | 200-175 | Silver Applicator for Electrode Tips |
| 36 Position Dual Row Male Nano-Miniature Connector | Omnetics Connector Corporation | A79028-001 | Headpiece to Amplifier Adapter |
| Conn Strip Header 2 x 50 | Digi-Key | ED83100-ND | Headpiece to Amplifier Adapter |
| Clidox Base and Acitvator | Pharmacal | 95120F & 96120F | Sterilant |
| Isoflurane | Priamal Enterprises Ltd | 66794-019-10 | |
| Oxygen | Airgas | OX USP300 | |
| Closed Loop Temperature Controller | CWE Inc. | 08-130000 | |
| Curved Scissors | FST | 14085-09 | |
| 0.25% Bupivicaine Hydrochloride | Hospira | 0409-1159-02 | Local Anesthetic |
| Meloxicam 5mg/ml | Henry Schein | 6451602845 | Pain/Inflammation Relief |
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | 0409-4888-20 | Fluids |
| Cefazolin | Hospira | 0409-0806-01 | Antibacterial |
| No.11 Disposable Scapel (20 pk) | Feather | 2975#11 | |
| Micro Serrefines | FST | 18052-3 | |
| Cotton Swabs (1,000 pk) | MSC Industrial | 8749574 | |
| 0.5 mm Micro Drill Bit | FST | 19007-05 | |
| Stereotaxic Drill | Kopf | Model 1471 | |
| Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | |
| Methyl Methacrylate | A-M Systems | 525000 | Cement for headpiece |
| Methyl Methacrylate Crosslinking Compound | A-M Systems | 526000 | |
| Curved Hemostats | FST | 13003-10 | Aide in Adapter Connection |
| RHD2000 standard SPI interface cable (3ft) | Intan Technologies | C3203 | |
| Cantilever Arm | Instech | MCLA | |
| Micro Spatula (12 pk) | Fischer Scientific | S50822 | |
| Digital Soldering Station | MCM Electronics | 21-10115 | |
| Rosin Core Solder 60/40 Tin/Lead | MCM Electronics | 21-1045 | |
| Color Craze Nail Polish with Hardeners (Nitrocellulose based) | L.A. Colors | CNP508 | |
| Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console | Kopf | Model 940 |
References
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