Abstract
Las técnicas de análisis electroencefalográficos avanzadas que requieren una alta resolución espacial, incluyendo imágenes de la fuente eléctrica y las mediciones de la conectividad de red, son aplicables a una variedad amplia de preguntas en la neurociencia. La realización de estos tipos de análisis en un modelo de roedor requiere una mayor densidad de electrodos de electrodos tornillo tradicionales pueden lograr. Si bien existen montajes electroencefalográficos de mayor densidad de roedores, que son de disponibilidad limitada a la mayoría de los investigadores, no son lo suficientemente robusta como para los experimentos repetidos durante un período prolongado de tiempo, o se limitan a utilizar en los roedores anestesiados. Un 1-3 de bajo costo propuesto método para la construcción de una, de gran número, matriz de electrodos transcraneal durable, que consiste en piezas de cabeza bilateralmente implantables se investiga como un medio para llevar a cabo los análisis avanzado electroencefalograma en ratones o ratas.
Los procedimientos para la fabricación de casco y la implantación quirúrgica necesario para producir alta relación señal a ruido, se presentan electroencefalográfico de baja impedancia y señales electromiográficas. Aunque la metodología es útil tanto en ratas y ratones, este manuscrito se centra en la aplicación más desafiante para el cráneo más pequeño del ratón. Libremente los ratones se mueven sólo son atados a cables a través de un adaptador de corriente durante la grabación. Una versión de este sistema de electrodos que incluye 26 canales electroencefalográficas y 4 canales electromiográficos se describe a continuación.
Introduction
La actividad neuronal se puede grabar extracelularmente con varios niveles de granularidad de los potenciales de acción (individuales) microscópicas para mesoscopic (potenciales de campo locales) a macroscópica (electroencefalograma). Estas trazas de ondas cerebrales se analizan clásico en el dominio de la frecuencia para caracterizar de comportamiento, neurofisiológicos, o estados electrofisiológicos. Esto se puede hacer con una sola biopotencial, 4 pero los registros de EEG densidad dispersos no puede resolver el componente espacial de la actividad neuronal. El análisis del electroencefalograma moderna se basa en múltiples electrodos para producir mapas detallados de la distribución espacio-temporal de la actividad cortical con el fin de correlacionar la actividad de las condiciones psicológicas específicas y los procesos fisiológicos. 5-7 Dos de las categorías de uso más común de análisis requiriendo montajes de EEG de alta densidad son imagen fuente eléctrica y las medidas de conectividad de red neural. 8-11
12-15 Desde EEG tiene una alta resolución temporal, estudios de EEG permitir la evaluación en tiempo real de los ERP y EPs, así como el análisis temporal precisa post hoc. 3,11 , 12
La asociación de los estados y las funciones cognitivas con la interacción de las oscilaciones observadas en el electroencefalograma es el objetivo final de las distintas medidas de conectividad de redes neuronales. Numerosos estudios han demostrado la sincronización y el bloqueo de fase de las oscilaciones entre las diferentes regiones del cerebro están asociados con estados específicos de la excitación, la atención y la acción. 6,13,14,16-19
localización de la fuente y la red de análisis de señales de EEG se originó con los estudios en humanos, pero las investigaciones sobre la base neuronal de estas señales implican necesariamente modelos animales, ya que requieren técnicas invasivas que serían imposibles en los seres humanos. Con el fin de replicar estos análisis en modelos de roedores, se necesita un método para la captura de señales de EEG de alta densidad en el cerebro de un roedor. Mientras que otros grupos han construido matrices de microelectrodos de alta densidad para uso en ratones, estos enfoques son de disponibilidad limitada a los investigadores que no tienen acceso a las instalaciones de nanofabricación, no son lo suficientemente robusta como para los experimentos repetidos durante un período prolongado de tiempo, o se limitan a utilizar en anestesiado ratones. 1-3,7 Un protocolo alternativo de bajo costo para la construcción de alta densidad crónica, transcraneal electrodo array se demuestra aquí.
El enfoque de adquisición de señal se describe aquí no se limita a EEG, pero incluye señales electromiográficas (EMG). Adquisición de señales EMG puede ser un método complementario para la definición de estado de comportamiento y es particularmente útil para los estudios del sueño. Este enfoque proporciona un intermedio entre las redes intracraneales caro, ultra-alta densidad, y los números limitados de plomo posibles con electrodos de tornillo tradicionales que son insuficientes para el análisis de los enfoques avanzados. El diseño del casco se construye fácilmente y asequible para los estudios de alto rendimiento. El uso de este sistema de adquisición en conjunto con técnicas de manipulación genética o farmacológicas variadas dentro de modelos de roedores puede ayudar a descubrir los mecanismos de generación de oscilación cortical, las divergencias de comportamiento de verdaderas diferencias genotípicas, localización de la fuente de los ERP y EPs, y la comunicación de red a gran escala.
Protocol
Los estudios realizados a lo largo de esta investigación estaban de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Pennsylvania.
1. Celada de Diseño y Construcción
- Retirar cada octava fila de los pernos de la 2 x 50 pin de ladrillo de un conector de receptáculo 100 de posición con un par de pinzas, empujando la porción de receptáculo de la clavija a través del ladrillo de plástico.
Nota: clavijas frente a la baja será la orientación que se hará referencia para el resto del protocolo. (Tome nota de esto específicamente en el apartado 2.6). - Cubra las agujas con una capa muy fina de esmalte de uñas para aislar y dejar que el esmalte de uñas se seque por completo.
- Quitar el esmalte de uñas de las puntas de los pasadores con acetona y un paño pequeño.
- Recorte el exceso de plástico de 2 x 7 del uso de una hoja de afeitar o de corte de alambre pliers. Esto dará lugar a 2 x 7 ladrillos que están aislados a lo largo de la longitud de los pasadores y expuestos en la punta de la clavija. Estos con el tiempo se convertirán en los electrodos de EEG transcraneal. Dos 2 x 7 ladrillos son necesarios para una matriz de electrodos crónica completa (Figura 1A).
- Cortar dos 1 x 2 ladrillos de patillas para la grabación de la señal EMG. Utilice el mismo proceso de eliminación de pasadores no deseados con unas pinzas y cortar el exceso de plástico de distancia para crear las 1 x 2 ladrillos. Asegúrese de que estos 2 x 1 a echar un lado liso a los mismos desde el original de 100 Posición del receptáculo que esta distancia se convertirá en la distancia pin estándar para cada pieza de cabeza por lo que un solo adaptador funcionará para todas las piezas de cabeza (Figura 1A).
- Utilice 2 partes de epoxi para unir la pieza pin 1 x 2 x 2 a la 7 pieza pasador (Figura 1D).
- Como los dos conjuntos de pasadores deben estar en la misma orientación, epoxi el 1 x 2 en el lado lateral de las dos mitades de la pieza de cabeza con las suaves lados de los 1 x 2 y 2 x7 en contacto entre sí. Alinear los agujeros y los pines 1 x 2 con los más posterior 2 filas de pines en el 2 x 7.
Nota: Las dos mitades de la pieza de cabeza no se pegado con epóxido juntos. Esto permite la flexibilidad dentro de las dos mitades del adaptador de casco para facilitar la conexión durante la habituación y durante los días experimentales (Figura 1E). - Deje que las mitades headpiece curar toda la noche. Al finalizar, el casco es bilateralmente simétrica. Cada mitad se compone de un ladrillo pin 2 x 7 con un 2 x 1 ladrillo pasador lateralmente adjunto que está en línea con la mayoría de la parte posterior 2 filas de la 2 x 7 pines de ladrillo.
- Como los dos conjuntos de pasadores deben estar en la misma orientación, epoxi el 1 x 2 en el lado lateral de las dos mitades de la pieza de cabeza con las suaves lados de los 1 x 2 y 2 x7 en contacto entre sí. Alinear los agujeros y los pines 1 x 2 con los más posterior 2 filas de pines en el 2 x 7.
- Prepare los cables para la grabación de la señal EMG. De cadena sencilla, 31 G alambre de plata perfluoroalkoxy aislamiento se utiliza para la grabación de la señal EMG (Figura 1D). Sin embargo, multi-trenzado u otro cableado de metal puede ser sustituido, si se desea.
- Para crear cables EMG torácicos toman un 3,0 cm de largo trozo de alambre de plata-perfluoroalkoxy aislado y remove 1 cm de aislamiento de plástico de un extremo con una hoja de afeitar. Ajustar el cable sin aislamiento alrededor de un par de pinzas de dos veces. Retire el cable de las pinzas y retire 25 mm de aislamiento en el extremo no en bucle con una hoja de afeitar.
- Para construir cables EMG cervicales, repite el proceso con un segmento de 1,5 cm de alambre. Se necesitan dos cables EMG cervicales y torácicos dos cables de EMG para un casco completo.
- Retire el pasador lateral de la fila anterior más lejano de ambas piezas de cabeza, que corresponde a una coordenadas estereotáxica de 3,3 mm anterior de Bregma y 2,3 mm lateral de Bregma, ya que no hay cerebro por debajo de esta ubicación determinada por un atlas de cerebro de ratón 20 (figura 2A).
- En ambas mitades de casco, cortar las patillas del 1 x 2 ladrillo a la base de plástico de la pieza de cabeza con un par de cortadores de alambre (3.0 mm de la punta del pasador) y soldar el cable EMG cervical al pasador anterior y la torácica EMG a la parte posterior pen.
- Compruebe que cada pin está aislado eléctricamente. Realice una prueba de continuidad con un multímetro digital mediante la conexión de los dos cables del voltímetro a diferentes pines, mientras que en el modo de continuidad. Eléctricamente los contactos aislados no producirán un pitido audible con esta prueba multímetro; Sin embargo, los pasadores acoplados eléctricamente hará. Cubrir las juntas soldadas con esmalte de uñas y una vez seco, doblar los cables EMG tal que se encuentren en paralelo al eje anterior / posterior con desplazamiento lateral mínima.
- pasadores de recorte hasta una longitud relativa de tal manera que coincida con el perfil de la superficie del cerebro.
- Con la ayuda de un atlas del cerebro de ratón, récord de distancia a la superficie ventral del cerebro del bregma para cada pin de coordenadas. El pasador 20 cuya distancia ventral desde bregma es el mayor servirá como indicador para recortar patillas. Este perno no se recortará, mientras que todos los otros pines serán cortadas con respecto a este pasador distancia ventral máxima (Tabla 1).
Nota: pines pueden ser molido a un tamaño pero debe hacerse con cuidado ya que la fricción entre el pasador y la muela abrasiva puede hacer que los pasadores de la pieza de cabeza se doblen. Si una patilla se dobla, utilizar pinzas para enderezarlo. Una alternativa a la molienda de las clavijas hacia abajo a la longitud es de recortar con un par de alicates de corte de alambre.
- Con la ayuda de un atlas del cerebro de ratón, récord de distancia a la superficie ventral del cerebro del bregma para cada pin de coordenadas. El pasador 20 cuya distancia ventral desde bregma es el mayor servirá como indicador para recortar patillas. Este perno no se recortará, mientras que todos los otros pines serán cortadas con respecto a este pasador distancia ventral máxima (Tabla 1).
- Cubrir todos los consejos de pasador con una solución de plata utilizando una pluma solución de plata y dejar secar. Este paso reduce impedancias de los electrodos a ≤30 kW, lo que aumenta la relación señal a ruido y al mismo tiempo elimina las asperezas causadas por pin recorte, por lo que disminuye las posibilidades de daños en los tejidos y acelerar la recuperación de la cirugía. A mitad del recorrido pesos headpiece aproximadamente 0,5 g.
2. Construcción Adaptador y Asignación de canales
- Cortar los cables del conector de un conector de 36 posiciones de fila doble masculino Nano-miniatura a una longitud uniforme de 2 o 3 cm utilizando una hoja de afeitar. Para cada cable, stestafar a 2,5 mm de aislamiento del extremo de lata y el metal expuesto de cada cable. Asegúrese de que cuando estañado tener una sola hebra, alambre delgado de estañado para cada cable adaptador nano ya que esto es fundamental para aislar pasadores. Recortar el aislamiento despojado con unos alicates de corte de alambre (Figura 1C).
- Crear un conector macho / macho a juego con el casco con el Conn Gaza Cabecera 2 x 50. Corte dos de 2 x 7 y dos de 2 x 1 de un ladrillo de 2 x 50. Retirar los pasadores no deseados del 2 x 50 ladrillos por la ruptura de una de las patillas macho, y luego empujar la segunda mitad ininterrumpida de la misma pieza de conector con un par de pinzas (Figura 1B).
Nota: Un lado de estos pines servirá como pines adaptador de enchufe en cada pieza de cabeza, mientras que la otra mitad se suelda a los cables del conector nano conservas. Asegúrese de tener los bordes de plástico planas del 2 x 1 y 2 x 7 tocar para garantizar una inserción correcta del conector macho / macho con la pieza de cabeza creada en el paso1. - Soldadura en uno de los cables de tierra / de referencia del conector nano para el conector de tierra / de referencia deseado. cables de tierra y de referencia están unidas entre sí en el chip amplificador RHD2132. Usar el pasador único que es de 0,60 mm anterior al bregma y 1,00 mm lateral de bregma como referencia y la tierra. (Pieza de cabeza izquierda, pin medial de la tercera fila más anterior, sin embargo, cualquier otro pasador podría ser asignado si se prefiere, la figura 2) Tenga en cuenta que es posible separar tierra y de referencia en el chip amplificador mediante la eliminación de la resistencia de 0Ω que une planta y referencia juntos si se desea el aislamiento de los dos.
- Soldar los cables del conector nano estañado para el mismo lado de los conectores macho / macho como la conexión terminal de tierra / referencia. Cada cable se asigna a un canal específico, por lo que el ajuste de canales se puede completar en este momento. Mapa del canal de diagramas para los cabezales de amplificador se encuentran en el sitio abierto Ephys Wiki (https://open-ephys.atlassian.net/wiki/display/OEW/Home). Soldar el cable correspondiente cuyo canal se sabe que el pasador respectivo para lograr la asignación deseada.
- Cortar los cables no utilizados en la base del conector nano con los alicates de corte de alambre.
- Utilice un voltímetro para asegurarse de que cada pasador está aislado eléctricamente de todos los otros pines. Una vez que se confirma el aislamiento, aplique una capa delgada de esmalte de uñas alrededor de cada punto de soldadura para aislar aún más cada pin.
- Usando 2-epoxi parte, reforzar el adaptador adecuado a las nano bilaterales 2 x 7 x 1 y 2 clavijas de los ladrillos entre machos.
Nota: Habrá dos mitades a este único adaptador que coincide con la disposición de las patillas de las mitades headpiece creadas anteriormente. Es fundamental asegurarse de que la porción medial de cada mitad del adaptador no tiene exceso de epoxi que desborda el borde de plástico del conector macho / macho, ya que esto evitará que las dos mitades de la pieza de cabeza está conectado de forma simultánea. No permita que el epoxi fluya hacia la parte inferior del adaptador de contactos porción del adaptador, ya que esto también evitaría que las conexiones adecuadas. Utilice las 2 mitades headpiece como molde para la alineación apropiada pin conector. - Epoxi ambas mitades del adaptador y el epóxido de la base del conector nano para aumentar su durabilidad. Asegúrese de cubrir todos los puntos de soldadura con epoxi. Dejar que la noche a la mañana cura adaptador.
- La confirmación de la asignación de canales adecuada se puede realizar usando mediciones de impedancia en la interfaz gráfica de usuario abierta Ephys (GUI). Un adaptador completado pesa aproximadamente 1,3 g (Figura 1F).
3. Cirugía
- Preparar un campo quirúrgico estéril.
- Use guantes estériles y otros equipos de protección individual obligatorio. Esterilizar herramientas en un autoclave. Esterilizar el marco estereotáctico con una solución de dióxido de cloro 1,0 mM. Pulverizar la solución sobre el marco y esperar 5 min antes de enjuagar con agua estéril.
- Para esterilizar headp implantableIECE partes, rocíe los componentes con una solución de dióxido de cloro 1,0 mM, y esperar 5 minutos antes de enjuagar con agua estéril. Coloque el hardware implantable ahora estéril en una placa de Petri estéril.
- Obtener un peso pre-quirúrgico para el ratón, a continuación, anestesiar al ratón en una cámara de inducción 200 ml usando 1,5 a 2,0% de isoflurano en oxígeno al 100%. Utilice una velocidad de flujo en la cámara de aproximadamente 500 ml / min.
- Confirmar la pérdida del reflejo de enderezamiento por la rotación de la cámara de inducción. Retire el ratón desde la cámara de inducción y el lugar en el cono de la nariz en el marco estereotáctico sin asegurar por completo la cabeza del ratón con las barras de oído. Continuará monitoreando el adecuado profundidad de la anestesia mediante la evaluación del dedo del pie de presión al mismo tiempo que la evaluación de los signos vitales.
- Mantener la temperatura corporal a 37 ° C con un controlador de temperatura de bucle cerrado, tal como un sistema de almohadilla de sonda y calefacción rectal. Cubrir los ojos del ratón con el ungüento oftálmico antes de recortar fuera de la piel deen la parte superior del cráneo con tijeras curvas o tijeras. Desinfectar la cabeza con betadine y permitir que el betadine se seque por completo antes de proceder.
- Administrar analgésicos y antibióticos junto con los líquidos por vía intraperitoneal. Para un ratón de 25 g, 0,5 mg de cefazolina, 0,125 mg de meloxicam, 0,5 ml de solución salina, y 2,5 mg de buprenorfina q 4-6 horas prn.
- Inyectar 250 l 0,25% por vía subcutánea bupivacaína a lo largo de la línea media en la cabeza, e inyectar 100 l 0,25% por vía subcutánea bupivacaína en ambos arcos cigomáticos del ratón.
- Asegure el ratón en el marco estereotáxico y exponer el cráneo.
- Fije la cabeza del ratón con las barras de oído estereotáxica en el marco estereotáxico. Asegúrese de que el ratón está en un plano quirúrgico de anestesia mediante la confirmación de la ausencia del reflejo del dedo del pie de presión. Crear una incisión a lo largo de 1,5 a 2,0 cm con un escalpelo desechable No. 11 a lo largo de la línea media del cráneo. La incisión se iniciará desde entre los ojos y continuar posteriormente hasta el occipucio. </ Li>
- Exponer el cráneo mediante la difusión de la piel lateralmente con pinzas micro. Reducir la concentración de isoflurano de 2,0% a una concentración que mantiene un plano quirúrgico de anestesia, pero no reducir al menor que 1,0% de isoflurano en oxígeno al 100%. La analgesia preoperatoria reduce la cantidad de anestésico inhalado sea necesario para mantener una profundidad de la anestesia quirúrgica, y puede conducir a una recuperación más rápida y mejores resultados de supervivencia.
- Nivelar los orificios de trepanación de cráneo y de perforación.
- Identificar Bregma y poner a cero las coordenadas estereotácticas en Bregma, que se convierte en el origen del sistema de coordenadas. Para nivelar el cráneo en el eje medial / lateral, mover una sonda de nivelación unido a un brazo manipulador estereotáxica 1,50 mm lateralmente en ambas direcciones desde bregma y confirmar que el / la profundidad ventral dorsal es inferior a 0,05 mm cuando la sonda contacta la izquierda y la derecha lados del cráneo.
Nota: La resolución de la dorsal ar manipulador / ventral 10 micrasestoy se utiliza junto con un indicador digital de visualización de coordenadas simplifica la nivelación. Nivelación del eje anterior / posterior sobre Bregma sigue la misma técnica. La diferencia en la distancia ventral para poner en contacto Bregma y Lamda también debe ser inferior a 0,05 mm.- Ajuste el cráneo hasta nivelación es completa en ambas direcciones de modo que el plano transversal es paralelo al suelo. Esto permite verdaderas coordenadas estereotácticas como se ve en el atlas del cerebro del ratón. 20
- Con un diámetro de la broca de taladro micro 0,5 mm dentro de un taladro estereotáxica, los agujeros de perforación de las rebabas de 3,30 mm anterior a 4,50 mm posterior al bregma en incrementos de 1,30 mm a 1,00 mm lateralmente a la línea media en las dos mitades del cráneo. Para los 2,30 mm columnas laterales de electrodos, los agujeros de perforación de las rebabas de 2,00 mm anterior al bregma a 4,50 mm posterior al bregma en incrementos de 1,30 mm en ambos lados de la línea media (Figura 2). La alta exactitud y la precisión que se requiere para este drIlling operación se simplifica mediante la resolución de un brazo manipulador estereotáxica digital de 10 micras.
Nota: A fin de que los pasadores de la pieza de cabeza para ser implantado correctamente, el cráneo del ratón debe estar firmemente en su lugar dentro del marco estereotáxico. Si el cráneo se mueve durante la perforación, la desalineación de los agujeros de trépano headpiece y puede sobrevenir.
- Identificar Bregma y poner a cero las coordenadas estereotácticas en Bregma, que se convierte en el origen del sistema de coordenadas. Para nivelar el cráneo en el eje medial / lateral, mover una sonda de nivelación unido a un brazo manipulador estereotáxica 1,50 mm lateralmente en ambas direcciones desde bregma y confirmar que el / la profundidad ventral dorsal es inferior a 0,05 mm cuando la sonda contacta la izquierda y la derecha lados del cráneo.
- Implante los tocados.
- Con unas pinzas rectas, preparar túneles de alambre EMG para los cables de EMG torácicos. Burrow 2,5 cm entre la piel y el músculo en la parte posterior tanto para los hilos de EMG izquierdo y derecho. Inserte la columna torácica y cervical EMG en la cavidad creada con las pinzas rectas primera y, a continuación, maniobrar el ladrillo EEG con pinzas curvas de tal manera que los pasadores se alinean con los agujeros de trépano previamente perforados.
- Aplicar una ligera presión sobre la pieza de cabeza y mover las clavijas en el cráneo. diámetro del pasador es de 0,46 mm. Con aislante esmalte de uñas, los pasadores encajan firmemente en la rebaba perforado holes. La pieza de cabeza será estable una vez que se inserta apropiadamente. Ajuste cables EMG a las posiciones finales. Repetir el mismo proceso para la pieza de cabeza en el otro lado.
- Asegure la pieza de cabeza en su lugar con cemento dental.
- Cuando ambas piezas de cabeza se fijan en su lugar, se mezcla 1: 1 de metacrilato de metilo con su compuesto de entrecruzamiento. Aplicar la mezcla de tal manera que cubre el cráneo expuesto, las partes de uñas pulido de los electrodos de pasador, y la porción proximal de los cables EMG, pero no cubre los receptáculos hembra de la pieza de cabeza.
- Asegúrese de no obtener el cemento en la piel. No permitir que las crestas de cemento para formar el ratón que será capaz de agarrarse. Garantizar el tiempo suficiente para que el cemento se seque, y luego quitar el ratón desde el marco estereotáxico. El peso total de que el ratón tendrá que realizar es de las 2 mitades de la pieza de cabeza y el cemento de fijación es de aproximadamente 1,2 g.
- Colocar el animal en un lugar limpioárea de recuperación.
- Mantener la temperatura corporal central con una almohadilla térmica. Monitorear el ratón hasta que recupera todos los reflejos posturales, lo que significa despertar de la anestesia. viviendas individuales se recomienda para la recuperación a largo plazo.
- El control diario durante un mínimo de 3 días después de la cirugía se recomienda a la analgesia intervencionista. De 10-14 días de recuperación después de la operación antes de comenzar un periodo de habituación atado.
4. Los animales se habitúan a Tethering
- Conectar el adaptador al ratón usando un apoyacabezas del ratón (Figura 1G-H). Apóyese en las esquinas opuestas de las piezas de cabeza que se cementan en su lugar con pinzas hemostáticas curvas una vez que el ratón está restringida e inserte suavemente los pines adaptador en el casco implantado en ambos lados.
- Conectar el amplificador de 32 canales en el adaptador (Figura 1H). Asegúrese de alinear los logotipos en el adaptador y en el amplificador en un consistent orientación tanto para el adaptador y el amplificador para evitar errores de canal de asignación. Conectar el amplificador a un cable RHD2000 estándar de interfaz periférica en serie (SPI). Este cable se conectará al sistema de adquisición para la grabación de la señal.
- Coloque el ratón dentro de una cámara que tiene un brazo en voladizo instalado en la pared de la cámara. Una el cable de interfaz SPI al brazo en voladizo y ajustar la tensión en el brazo en voladizo para contrarrestar el peso del cable atado. El ratón es capaz de moverse libremente y está habituado a una hora al día de la semana antes de la grabación.
- Para desconectar el ratón, simplemente desconecte el cable y el adaptador del ratón mientras se utiliza un acero inoxidable micro espátula plana para ayudar en desconectar el adaptador del ratón.
5. Configuración del Sistema de extracción de señales de grabación / Señal
- Conecte el adaptador construido en el casco de un ratón implantado. Conectar un amplificador de cabezal de la platina al adaptador yconecte un cable de interfaz SPI estándar al amplificador y para la tarjeta de adquisición. Haga que el cable de SPI se adhieren a un voladizo correctamente tensada de manera que se reduzca al mínimo el peso adicional en la cabeza del ratón.
- Colocar una jaula de Faraday locales, creado mediante la realización de lámina de malla o de aluminio, alrededor del cabezal de la platina y apoyar la jaula de Faraday locales.
- Obtener impedancias de los electrodos antes del comienzo de cada grabación seleccionando a 30 kS / frecuencia de muestreo seg y la medición de impedancias a través del módulo en el GUI. Se requiere un valor de impedancia de menos de o igual a 10 kW para un PIN individual para la confirmación de un contacto adecuado de electrodos. los valores de impedancia altos proporcionan datos rechazados de ese electrodo.
- Para la grabación, crear una cadena de señal del ritmo FPGA, filtro de paso de banda, y el espectador LFP en la GUI. Se recomienda seleccionar una frecuencia de muestreo de 1,00 kS / s, ancho de banda de 0.1-7,500 Hz y anular la selección de DSP. Ajuste del filtro paso banda de 0,1 a 250 Hz y se muestren los canales de opEning el espectador LFP. 250 y 400 mV con amplitudes de canal método de dibujo seleccionadas mejor visualiza los datos.
- Comenzar a grabar utilizando la interfaz gráfica de usuario. Crear una nueva carpeta para cada registro y establecer la ruta para guardar los archivos a esa carpeta. Para empezar una grabación simplemente pulse registro. Los 32 canales desde el conector se registran de forma predeterminada, pero los canales no deseados pueden ser no seleccionada haciendo clic en el lado derecho del módulo FPGA ritmo antes del comienzo de la grabación.
- Importar datos en Matlab para el análisis. Hay una multitud de cajas de herramientas de código abierto que se pueden utilizar para ayudar en el análisis.
Representative Results
Los datos de muestra grabadas en un ratón que se mueve libremente implantado con una pieza de cabeza EEG de alta densidad se muestra en la Figura 3. Las formas de onda de EEG individuales corresponden con el esquema de canal de mapeo se muestra en la Figura 2. Ejemplos de EMG cervical y torácica también se muestran en la Figura 3. Tenga en cuenta que la grabación EMG torácica también contiene actividad eléctrica incrustado origina en el corazón del ratón que se convierte fácilmente evidentes cuando se calcula una señal diferencial entre los dos cables EMG torácicos (T). Con esta grabación también es posible calcular la frecuencia cardiaca del ratón midiendo el tiempo entre los picos QRS electrocardiográficos. 23-24 Del mismo modo, es posible medir la frecuencia respiratoria del ratón mediante el cálculo de la variabilidad fásica de la espiga QRS como la cavidad torácica se expande y contratos con cada respiración. 25 por lo tanto, esta configuración de permisos para la adquisición opolisomnografía murino f. Por otra parte, la configuración permite que el mapeo cortical de los potenciales evocados visuales (Figura 4). Cuando un pulso de 10 ms de la luz se entrega sólo para el ojo izquierdo del ratón, las respuestas clásicas se registran en la corteza visual primaria contralateral (pero no ipsilateral) que son seguidos por una respuesta tardía en la corteza visual secundaria contralateral. La película incrustado en la Figura 4 muestra el tiempo que varía potenciales eléctricos a través de toda la superficie cortical junto con gráficos de actividad en V1 y V2 contralateral.
| AP | ||||||
| 3.3 | 0 | 0 | ||||
| 2 | 0,4 | 0,6 | 0,6 | 0,4 | ||
| 0,7 | 0,6 | 0,9 | 0,9 | 0,6 | ||
| -0.6 | 0,9 | 1 | 1 | 0,9 | ||
| -1,9 | 1 | 1.1 | 1.1 | 1 | ||
| -3.2 | 3 | 1 | 1 | 1 | 1 | 3 |
| -4,5 | 3 | 0,7 | 0,7 | 0,7 | 0,7 | 3 |
| ML | -2.3 | -1 | 1 | 2.3 |
Tabla 1:. Pin Recorte Longitudes Esta figura muestra las longitudes requeridas de recorte, en mm, por pasador de la pieza de cabeza. Las longitudes de recorte pasador se adquirieron a partir de un atlas del cerebro del ratón. after pasadores de recorte, la pieza de cabeza coincide con el perfil de la superficie del cerebro. 20 pines EMG se cortan por completo ya que los cables utilizados para grabar la señal EMG se sueldan sobre el talón de pasador.
Figura 1:. Celada Componentes, Intermedio Pasos de Construcción, y la conexión apropiada para la grabación Esta figura muestra la materia prima utilizada para crear piezas de cabeza. Comenzando con un conector de receptáculo de 100 pines, se crean pequeñas 2 x 7 x 1 y 2 componentes. Tenga en cuenta que en el componente 2 x 1, el borde original de la 2 x 50 está intacta, lo que permite la construcción casco consistente y permite para un adaptador para conectar a muchos ratones implantados. Figura 1B y 1C presentan las materias primas necesarias para crear el adaptador de la pieza de cabeza al amplificador. 1B presenta el extremo de pieza de cabezael adaptador que de igual forma se corta hacia abajo para conectarse a la pieza de cabeza. Tenga en cuenta que que 2 x 1 de nuevo tiene un borde original de la componente en bruto, lo que garantiza la conexión apropiada entre el adaptador y la pieza de cabeza. La Figura 1C muestra el extremo del adaptador que se conecta al amplificador. La Figura 1D ilustra el pegado con resina 2 x 7 y 2 x 1 componentes, junto con los cables de EMG preparados para la grabación de la señal. la Figura 1E muestra una pieza de cabeza completado. Figura 1F muestra un adaptador completado. Figura 1G muestra una conexión adecuada entre las piezas de cabeza y el adaptador. Por último, la Figura 1H muestra un ratón implantado con el adaptador conectado y el amplificador. El chip amplificador está conectado a un cable de interfaz que se ejecuta a la tarjeta de adquisición (no se muestra). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Montaje de electrodos y Celada totalmente construido Esta figura muestra la colocación de electrodos con respecto al cerebro del ratón. localizaciones de los electrodos se basan en las coordenadas estereotáxica de bregma. Coordenadas para cada electrodo se puede encontrar en el paso 4.8 del protocolo. el color del electrodo corresponde a las regiones del cerebro subyacentes para cada electrodo. Blanco = asociación corteza frontal (FRA), Naranja = corteza motora primaria (M1), Rosa = secundaria corteza motora (M2), verde oscuro = primaria corteza somatosensorial, región de la extremidad anterior (S1FL), Verde = primaria corteza somatosensorial, zona dysgranular (S1DZ ), verde claro = corteza somatosensorial primaria, campo de barril (S1BF), amarillo = parietal medial corteza de asociación (MPTA), azul oscuro = primaria corteza visual (V1), azul claro = corteza visual secundaria, el área mediomedial (V2MM), Negro = dy retroesplenialcórtex sgranular (RSD). 20 Común de Referencia / Tierra se muestra también. Este sistema de referencias minimiza artefacto respiratoria dentro de la señal sin procesar. Números asociados con cada electrodo individual proporcionan un mapa de canal para toda la matriz. Allen imagen modificada de cerebro de ratón Atlas. 21,22 La figura 2B muestra un casco totalmente construida a escala con respecto a una moneda de diez centavos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Muestra EEG y EMG Traces desde el electrodo Montage formas de onda de electrodos corresponden a la asignación de canales se muestra en la Figura 1A.. EMG cervical (C) proporciona la capacidad de determinar el tono muscular de la nuca (+). señales EMG también contienen los impulsos eléctricos cardíacos QRS(*). Se muestran las barras de escala de 200 mV de amplitud de la traza y 1 segundo de duración rastro. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Distribución espacial de los potenciales evocados visuales Distribución espacial de la aplicación siguiente de potencial evocado de un flash de luz unilaterales se administra sólo para el ojo izquierdo.. diagrama superior representa el EEG montaje de alta densidad con cada círculo representa a un electrodo. El cambio de color con el tiempo corresponde a cambios de voltaje a través del tiempo para cada electrodo respectivo. En el tiempo = 0 ms, un pulso de 10 ms luz se entrega y se representa en la figura del medio. gráfico inferior ilustra significa rastros potenciales evocados para contralateral electrodos V1 y V2 EEG (ensayos n = 108 EP). Pul luzse produce a 0 mseg. Tenga en cuenta que se observa la respuesta de potencial evocado correspondiente en V1 contralateral (trazo negro), seguido de un tiempo de latencia de respuesta evocada potencial en V2 contralateral (línea roja). (Haga clic derecho para descargar).
Discussion
La construcción de bajo costo y los pasos quirúrgicos necesarios para alcanzar adecuadamente un canal 26, de alta densidad de montaje de EEG en un ratón se describe. Proper contacto del electrodo epidural es crítico en la adquisición de señales de EEG de calidad en este sistema. Dos pasos dentro de la dirección de protocolo de esta cuestión: Contacto de recorte para que coincida con el contorno del cerebro, y la implantación casco antes de refuerzo acrílico. Es importante no cortar un perno demasiado corto durante la fase de construcción. Para la implantación de los cascos, es imprescindible para comprobar posición de la bandera antes de que el refuerzo de acrílico final. Una forma de confirmar un contacto adecuado electrodo es a través de pruebas de impedancia. Aparentemente, las impedancias de 5-10 kW sugieren la colocación epidural adecuada. 26 Las mediciones de impedancia demuestran durabilidad las piezas de cabeza ', como los valores de impedancia de electrodos son estables dentro de este rango de 5 a 10 kW durante al menos 4 meses después de la implantación. El otropaso esencial consiste en la alineación de los pasadores de EMG con las dos filas más posteriores del 2 x 7 de ladrillo EEG. Esto es crítico para la conexión del adaptador, como EMG desalineados y los pasadores de EEG darán lugar a una incapacidad para conectar el adaptador o adaptadores pines doblados.
Una ventaja importante de este sistema de adquisición es la facilidad de modificación de la forma de la matriz de electrodos con el fin de optimizar las necesidades experimentales variadas. disposiciones de electrodos personalizados que se adaptan de manera óptima para los experimentos específicos se pueden crear fácilmente. Personalización para experimentos específicos potencialmente podría combinar el EEG con cánula para la administración de fármacos dirigida a farmacológico combinado, electroencefalográfica, y estudios de comportamiento. 27 Tocados, adaptadores, y los procedimientos quirúrgicos se adaptan fácilmente a una amplia serie de estudios, cuando siguiendo los métodos descritos en el protocolo anterior . Una segunda ventaja importante de este sistema de adquisición es su bajo costo. En la actualidad, este sistema de medición puedeficha 128 canales de entrada en hasta 4 cables separados, que permiten la grabación simultánea de 4 ratones o si se desea, las ratas con rejillas de mayor densidad. Tal expansión sólo requiere cables adicionales y adaptadores.
Este enfoque de la alta densidad de adquisición de EEG aborda los inconvenientes de otros métodos de adquisición de EEG de alta densidad en ratones. El sistema descrito en este trabajo se construye convenientemente con materiales simples y utiliza el hardware de código abierto y el software que es barato y estable, permite mediciones repetidas en el mismo animal durante meses, permite la libre circulación durante un experimento, y no requiere que los ratones que ser anestesiado para la grabación. Las limitaciones de este sistema es que sólo ha sido validado hasta la fecha en los ratones que pesan 20 gramos o más, o es mayor de 12 semanas. los ratones más jóvenes o más pequeños pueden tener dificultades con la implantación casco. Una limitación secundaria de esta metodología es la incapacidad de controlar con precisión la profundidad de la sonda después headpIECE fabricación. Sin embargo, esta misma limitación se aplica a los electrodos de EEG tradicionales tornillo ya que no hay manera de saber con precisión la profundidad de atornillado pre-mortem respecto a la superficie cortical. Solución de problemas de este método implica típicamente blindaje correctamente señal interferente del ratón cuando atados a fin de obtener la señal libre de ruido.
EEG matrices de alta densidad son esenciales para los complejos análisis espacio-temporales de datos de EEG que son normales en la nueva interpretación moderna EEG. Si bien se ilustra la distribución espacial de un potencial evocado visual, los datos adquiridos usando este sistema se pueden analizar usando técnicas de imagen fuente eléctrica y las medidas de la conectividad neuronal. Una reducción del 60% al 70% en el área de contacto entre estas clavijas de electrodo en comparación con los contactos de los tornillos tradicionales permite la localización más precisa de la señal, como se muestra en la Figura 4. El empleo de técnicas de análisis de alta densidad en ratones modificados genéticamente, siguiendo Pharmacological intervención, o en animales con patología intrínseca tales como trastornos convulsivos pueden ayudar a discernir los mecanismos que generan oscilaciones corticales específicas, localizar fuentes de ERPs y EPs, y para revelar las propiedades de red a gran escala. Por mejores sistemas de paralelismo humanos, este enfoque mejorará pequeños modelos animales de la neurofisiología humana y la neuropatología, proporcionando traducción más fácil de los descubrimientos realizados en modelos de roedores de relevancia científica y clínica en humanos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32 Channel RHD2132 amplifier headstage | Intan Technologies | C3314 | |
| Aquistion Board | Open Ephys | v2.2 | |
| 100 Position Receptable Connector | Digi-Key | ED85100-ND | Headpiece |
| Acetone (1 L) | Sigma Aldrich | 179973-1L | |
| Razor Blade (100 pack) | McMaster Carr | 3962A4 | |
| Wire-Cutting Pliers | MSC Industrial | 321786 | |
| 2-Part Epoxy | McMaster Carr | 7605A18 | |
| PFA Coated Silver Wire (25 ft) | A-M Systems | 787000 | EMG Wire |
| CircuitWriter Pen | MCM Electronics | 200-175 | Silver Applicator for Electrode Tips |
| 36 Position Dual Row Male Nano-Miniature Connector | Omnetics Connector Corporation | A79028-001 | Headpiece to Amplifier Adapter |
| Conn Strip Header 2 x 50 | Digi-Key | ED83100-ND | Headpiece to Amplifier Adapter |
| Clidox Base and Acitvator | Pharmacal | 95120F & 96120F | Sterilant |
| Isoflurane | Priamal Enterprises Ltd | 66794-019-10 | |
| Oxygen | Airgas | OX USP300 | |
| Closed Loop Temperature Controller | CWE Inc. | 08-130000 | |
| Curved Scissors | FST | 14085-09 | |
| 0.25% Bupivicaine Hydrochloride | Hospira | 0409-1159-02 | Local Anesthetic |
| Meloxicam 5mg/ml | Henry Schein | 6451602845 | Pain/Inflammation Relief |
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | 0409-4888-20 | Fluids |
| Cefazolin | Hospira | 0409-0806-01 | Antibacterial |
| No.11 Disposable Scapel (20 pk) | Feather | 2975#11 | |
| Micro Serrefines | FST | 18052-3 | |
| Cotton Swabs (1,000 pk) | MSC Industrial | 8749574 | |
| 0.5 mm Micro Drill Bit | FST | 19007-05 | |
| Stereotaxic Drill | Kopf | Model 1471 | |
| Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | |
| Methyl Methacrylate | A-M Systems | 525000 | Cement for headpiece |
| Methyl Methacrylate Crosslinking Compound | A-M Systems | 526000 | |
| Curved Hemostats | FST | 13003-10 | Aide in Adapter Connection |
| RHD2000 standard SPI interface cable (3ft) | Intan Technologies | C3203 | |
| Cantilever Arm | Instech | MCLA | |
| Micro Spatula (12 pk) | Fischer Scientific | S50822 | |
| Digital Soldering Station | MCM Electronics | 21-10115 | |
| Rosin Core Solder 60/40 Tin/Lead | MCM Electronics | 21-1045 | |
| Color Craze Nail Polish with Hardeners (Nitrocellulose based) | L.A. Colors | CNP508 | |
| Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console | Kopf | Model 940 |
References
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