Introduction
Des défauts dans le cartilage articulaire ne guérissent pas naturellement. Par conséquent, transplantation de cellules souches a été proposée comme une approche prometteuse pour la réparation d'altération du cartilage. Cependant, cette méthode nécessite à la fois l'acquisition d'un nombre suffisant de cellules souches et l'induction de ces cellules à subir une différenciation chondrogénique. La moelle osseuse (BM) a été largement utilisé en tant que source de cellules souches, mais l'isolement des cellules de BM présente deux inconvénients majeurs: le rendement de propagation et insuffisante. En raison de sa facilité d'acquisition, le tissu adipeux est une source de cellules souches préférables. Des études antérieures ont démontré la faisabilité d'isoler des cellules souches du tissu adipeux et d' induire la différenciation chondrocytaire dans ces cellules en utilisant des cytokines, telles que le TGF-β1 1, 2. Ces méthodes sont efficaces mais coûteux.
Comme une alternative moins coûteuse aux cytokines, une contrainte mécanique peut être utilisé pourinduire la différenciation chondrogénique. Chargement mécanique joue un rôle essentiel dans le maintien de la santé du cartilage articulaire 3, et elle peut induire des phénotypes chondrogéniques dans différentes cellules. Par exemple, la pression hydrostatique induit des phénotypes chondrogéniques dans les cellules progénitrices dérivées de la synoviale par la voie de la MAP kinase / JNK 4, et une compression mécanique induit une chondrogenèse dans des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSM) , par la régulation positive des gènes 5 chondrocytes. En outre, la contrainte de cisaillement contribue à l'expression liée chondrogenèse matrice extracellulaire (ECM) dans les cellules souches mésenchymateuses humaines 6. Gravité centrifuge (CG), une contrainte mécanique facilement appliquée et contrôlée générée par centrifugation, peut induire l' expression différentielle des gènes dans les cellules 7. Par exemple, dans des cellules de carcinome de l' épithélium du poumon, l'expression de l' interleukine (IL) -1 ter est régulée positivement par centrifugation 8. Tinsi, en tant que contrainte mécanique expérimentalement inductible, CG peut être utilisé pour induire l'expression du gène chondrocytaire dans les cellules souches. Cependant, il reste difficile de savoir si CG peut induire la différenciation chondrogénique des cellules souches.
Dans cette étude, nous avons constaté que CG a induit la surexpression de SOX9, un régulateur de maître de chondrogenèse en ASCs humains, ce qui entraîne la surexpression des gènes chondrocytes. De plus, nous avons comparé les effets de la CG sur la chondrogenèse avec celles du TGF-β1, le facteur de croissance les plus couramment utilisés pour induire une chondrogenèse in vitro dans des cellules souches.
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Protocol
Ce protocole d'étude a été approuvé par le comité d'examen institutionnel de l'Université catholique de Corée (KC16EAME0162) et réalisée selon les directives du NIH. Tous les tissus ont été obtenus avec le consentement éclairé par écrit.
Chargement 1. centrifuge Gravité et Pellet Culture
- La culture cellulaire et la récolte
- ASCs de culture (P2-P3; voir la liste des matériaux) dans Modifié Moyennement bas de glucose de Eagle Dulbecco (DMEM-LG) additionné de 10% de sérum de veau fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine (P / S) à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO 2.
- Lorsque les cellules atteignent 80% de confluence, éliminer le milieu et laver les cellules avec 5 ml de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Ajouter 1 ml de PBS contenant de l' EDTA 1 mM et on incube pendant 2 min à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO 2.
- Appuyez sur la plaque de culture doucement, ajouter 4 ml de milieu frais, transférer les cellules àun tube conique de 15 ml et centrifuger les cellules à 250 xg pendant 2 minutes à la température ambiante (TA).
- Centrifuge chargement gravitaire
- Après centrifugation (étape 1.1.4), retirer le surnageant sans perturber le culot et resuspendre le culot dans 10 ml de DMEM-LG avec 10% de FBS. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.
- CG pour le chargement, transférer 2,5 x 10 5 cellules dans un nouveau tube conique de 15 ml et on centrifuge à 2400 x g pendant 15 min.
- culture Pellet
- Immédiatement après la centrifugation, Aspirer le surnageant et ajouter 500 ul de milieu de différenciation chondrogénique définie (MDP-DMEM riche en glucose supplémenté avec 1% de FBS, 1% de ITS + Prémix, 100 nM de dexaméthasone, d'une solution d'acides aminés 1 x MEM non essentiels, 50 pg / ml de L-proline, et 1% de pénicilline / streptomycine). Ajouter 50 pg / ml fraîchement préparée de l'acide L-ascorbique 2-phosphate, à chaque changement de milieu. En tant que contrôle positif, induisent differentiati chondrogéniquesdans les cellules non centrifugé en ajoutant MCD contenant 10 ng / ml de TGF-β1.
- Placer les tubes coiffés de manière lâche contenant les pastilles dans une position debout et incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO 2.
- Changer le milieu tous les jours pendant 3 semaines.
- culture Micromass
- Immédiatement après centrifugation (étape 1.2.2; 2400 × g pendant 15 min), aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 10 pi de MDP.
- Pour former un Micromass, placer les cellules remises en suspension au centre d'un puits d'une plaque à 24 puits.
- Après 2 h, ajouter avec précaution 1 ml de MDP au bien, pipetage contre le mur de la plaque pour éviter de perturber l'micromasse. En tant que contrôle positif, effectuer une culture de micromasse avec des cellules non centrifugés en ajoutant CDM contenant 10 ng / ml de TGF-β1.
- Incuber la micromasse à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO 2.
- Changez le ev moyenEry autre jour pendant 3 semaines.
2. transcriptase inverse-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) pour détecter transcriptionnelle de régulation positive Chondrogène Différenciation Marqueurs
- Au jour 14, utiliser une pipette pour transférer les pastilles de sphéroïdes dans un nouveau tube de 1,5 ml et les laver dans PBS 1x.
- Extraire l'ARN total à partir des pastilles en utilisant le thiocyanate-phénol-chloroforme méthode 9 d'extraction de guanidinium.
- Synthétiser un ADNc à partir de 2 pg d'ARN total en utilisant une transcriptase inverse selon le protocole du fabricant (incuber à 42 ° C pendant 1 h et ensuite inactiver l'enzyme à 70 ° C pendant 5 min).
- Effectuer une PCR avec des amorces spécifiques pour les marqueurs de 10 différenciation chondrocytaire.
3. Coloration pour détecter la surexpression de chondrogéniques Différenciation Marqueur Protéines
- culots cellulaires Paraffin-enrobage
- Au jour 21,utiliser une pipette pour récolter les granulés sphéroïdes et les laver avec PBS 1x.
- Fixer les granules sphéroïdaux par immersion dans 4% de paraformaldehyde pendant 24 h.
Attention: paraformaldéhyde est hautement toxique. Éviter tout contact avec les yeux, la peau ou les muqueuses. Minimiser l'exposition et éviter l'inhalation lors de la préparation. Porter un équipement de protection individuelle approprié. - Jeter le fixateur et rincer les pastilles de cellules avec de l'eau déminéralisée (DW).
- Placer une couche de gaze sur la cassette et transférer les pastilles fixes à l'aide d'une pipette. Couvrir le culot par pliage de la gaze et fermer le couvercle de la cassette.
- Déshydrater les pellets.
- Immerger les pastilles dans 70% d'éthanol (EtOH) pendant 5 min à température ambiante.
- Immerger les pastilles dans 80% de EtOH pendant 5 min à température ambiante.
- Immerger les pastilles dans EtOH à 95% pendant 5 min à température ambiante.
- Immerger les pastilles dans EtOH à 100% pendant 5 min à température ambiante. Répéter deux fois.
- Immerger les pastilles dans 100% de xylène pendant 15 minutes à température ambiante. Répétez twice.
- Incorporer les culots de cellules fixes dans la paraffine à 56 ° C dans un moule; les pastilles peuvent être incorporées dans de la paraffine en utilisant des systèmes de traitement de tissu automatisé spécialisés.
- Couper les sections 5 um d'épaisseur à partir du culot cellulaire inclus dans la paraffine en utilisant un microtome rotatif.
- Float les sections dans 50% EtOH puis les transférer à un bain à 50 ° de l'eau en utilisant une diapositive.
- Placez les sections flottantes sur des lames.
- Safranine O et coloration au bleu Alcian
- Réhydrater les sections de paraffine.
- Immerger les lames dans du xylène pendant 15 min. Répéter deux fois.
- Immerger les lames dans EtOH à 100% pendant 5 min. Répéter deux fois.
- Immerger les lames dans 90% de EtOH pendant 5 min.
- Immerger les lames dans 80% EtOH pendant 5 min.
- Immerger les lames dans 70% EtOH pendant 5 min, puis lavez-les dans PBS 1x.
- Colorer les sections réhydratés avec 1% solution safranine O et 3% de bleu Alcian pour30 minutes.
- Jeter la solution de coloration et rincer les sections avec DW.
- Colorer les sections avec une solution hématoxyline / éosine (colorante de) pendant 1 min.
- Jeter la solution de coloration et rincer les sections avec DW.
- Placer une goutte de milieu de montage sur une lamelle couvre-objet après avoir retiré l'eau résiduelle. Placez délicatement la lame (cellule vers le bas) sur la lamelle contenant le milieu de montage.
- Laisser les lames sécher pendant 2-3 h à température ambiante.
- Capture d'images en utilisant un microscope à champ lumineux (microscope droit automatisé, 50X et 200X).
- Réhydrater les sections de paraffine.
- immunofluorescence
- Réhydrater les sections comme décrit dans la section 3.2.1.
- Immerger les lames dans du tampon citrate de sodium (citrate de sodium 10 mM, 0,05% de Tween 20, pH 6,0), puis de les maintenir à une température sub-bouillante pendant 10 minutes en utilisant un four micro-ondes.
- Refroidir les lames pendant 20 min à température ambiante, puis les laver avec de l'eau du robinet.
- Incuber les lames dans 3%H 2 O 2 (1x PBS) pendant 15 min, puis les laver avec de l' eau du robinet pendant 15 min 11.
- Bloquer les lames avec un tampon de blocage (10% de sérum de chèvre normal dans du PBS) pendant 1 h.
- Aspirer la solution de blocage, et ensuite appliquer un anticorps primaire dilué avec 5% de sérum de chèvre normal sur les lames.
- Incuber les lames pendant une nuit à 4 ° C.
- Laver les lames trois fois en 1x PBS pendant 5 min chacun.
- Incuber les lames dans un anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome dilué avec 5% de sérum de chèvre normal pendant 1 h à température ambiante dans l'obscurité.
- Laver les lames trois fois dans du 1 x PBS pendant 5 min à chaque fois dans l'obscurité.
- Incuber les lames avec DAPI (1 pg / ml) pendant 10 min, puis lavez-les deux fois en 1x PBS pendant 5 minutes chacun.
- Placer une goutte de milieu de montage sur une lamelle couvre-objet après avoir retiré l'eau résiduelle. Placez délicatement la lame (cellule vers le bas) sur le support de montage.
- Laisser les lames sécher pendant 2-3h dans l'obscurité à la température ambiante.
- Visualisez les diapositives en utilisant la microscopie à fluorescence (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; 60X et 200X) 12.
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Representative Results
gravité centrifuge induit une surexpression de marqueurs de différenciation chondrocytaire dans les cellules souches dérivées de tissu adipeux.
Pour déterminer le degré de la force de gravité centrifuge qui est apte à induire la différenciation chondrogénique, ASCs ont été stimulées avec divers degrés de CG (0, 300, 600, 1200 et 2400 x g) pendant 15 min. Après stimulation, les ASCs ont été re-ensemencées sur des plaques de culture et cultivées pendant 24 h. Comme on le voit sur la figure 1A, l' expression de l' ARNm SOX9 a été significativement augmentée à 2400 x g; il était d'environ 1,5 fois plus élevée à 2.400 xg que dans le contrôle (ASCs pas chargés avec CG). Pour confirmer si CG induit la différenciation chondrogénique, nous avons stimulé ASCs par CG chargement ou par traitement TGF-β1. Comme témoin négatif, ASCs ont été cultivées sans aucune stimulation. Des échantillons ont été récoltés au jour 14 et qRT-PCR a été réalisée. Comme cela est représenté en Figure 1, COL2A1 ARNm, un marqueur représentatif de différenciation chondrogénique, a été régulée positivement dans ASCs stimulées par CG par rapport aux cellules témoins (les ASCS) non stimulées. Le niveau de la régulation positive de l' ARNm COL2A1 par CG stimulation était similaire à celle induite par le traitement de TGF-β1. D'autre part, col10, un marqueur de chondrocytes hypertrophiques, a été régulée à la baisse par CG stimulation. ACAN ARNm, qui code pour un composant structurel majeur du cartilage articulaire a été régulée à la hausse d' environ 2 fois par CG stimulation, alors que COL1 n'a pas été détectable élevée par rapport aux témoins. Ni ACAN ni COL1 été régulée à la hausse dans ASCs traitées avec du TGF-β1.
gravité centrifuge induit l'expression d'une matrice extracellulaire liée chondrogenèse dans la culture de culot de cellules souches dérivées de tissu adipeux.
Dépôtion de l'ECM, comme glycosaminoglycanes, est un phénotype caractéristique de différenciation chondrogénique. Pour détecter ce matériau, nous avons coloré ASCs pellet-culture avec safranine O et bleu Alcian le jour 21. Comme le montre la figure 2A, ASCs stimulées par CG déposées plus glycosaminoglycanes (rouge pour la safranine O et bleu pour le bleu Alcian) que les contrôles, à un niveau similaire à celui déposé par ASCs traitées avec du TGF-β1. Dans ces expériences, une coloration positive a montré la formation d'une matrice de cartilage. Pour confirmation, nous avons surveillé l'expression de la protéine COL2A1 en utilisant l'anticorps anti-COL2A1 conjugué à PE. COL2A1 a été surexprimé dans ASCs stimulées par CG à un peu plus que dans ASCs traitées avec le TGF-β1 (figure 2B).
la formation d'agrégats chondrogénique est induite par gravité centrifuge dans une culture de micromasses de cellules souches dérivées de tissu adipeux.
13. Par conséquent, nous avons comparé la condensation dans les micromasse entre les cultures de ASCs de contrôle et ASCs stimulées avec CG ou TGF-β1. Comme le montre la figure 3, agrégations plus grandes et les plus denses de ASCs ( de couleur blanche dans le carré en pointillés) ont été détectés dans des cultures de micromasse en ASCs stimulées avec CG ou TGF-β1 que dans les cultures de contrôle.
SOX9 est régulée positivement par gravité centrifuge dans les cellules souches dérivées de tissu adipeux.
Sox9 est un régulateur maître de différenciation chondrogénique 14, 15. Pour déterminer si CG induit la surexpression de Sox9 dans ASCs, nous avons suivi l'expression de l' ARNm dans SOX9 ASCs exposés à diverses durées de CG stimulation (2,400 × g). Expression SOX9 a été étudiée à des degrés divers de CG, mais il ne différait pas significativement entre les conditions CG avec des forces supérieures à 2400 × g (données non présentées). L' expression de l' ARNm SOX9 a commencé à augmenter après 15 min de CG stimulation, et on a saturé après 30 minutes (figure 4A). Ensuite, pour déterminer combien de temps surexpression de Sox9 CG-induite peut être maintenue, nous avons récolté ASCs CG-stimulés au niveau des points de temps indiqués et surveillé l'expression de Sox9. Comme cela est représenté sur la figure 4B, l'expression de la protéine Sox9 augmentée jusqu'à 3 h après la stimulation CG et est restée à ce niveau pendant au moins 12 heures.
Figure 1. gravité centrifuge provoque la régulation positive des marqueurs de différenciation chondrocytaire dans les cellules souches dérivées de tissu adipeux. A) Pour déterminer quela force de gravité centrifuge uitable, ASCs CG ont été centrifugés à différentes (0, 300, 600, 1200, et 2400 x g) pendant 15 min. expression SOX9 ARNm a été évaluée à 24 h après CG stimulation. B) Pour évaluer l'expression des gènes liés à la chondrogenèse, l' ARN total a été extrait de ASCs qui avait été centrifugés, traités avec le TGF-β1 (10 ng / ml), ou non stimulées (témoins). L'ARN a été soumis à une transcription inverse pour synthétiser un ADNc, qui a ensuite été amplifié par RT-PCR. Toutes les expériences ont été effectuées au moins trois fois. Les barres d'erreur représentent l'écart type. ** P <0,01 pour ASCs stimulées par CG par rapport au témoin (non stimulé ASCs).
Figure 2. gravité centrifuge induit une matrice extracellulaire liée chondrogenèse dans des cultures de culot de cellules souches dérivées de tissu adipeux. A) sous forme de matrice de protéoglycanesion par CG chargement. B) la surexpression induite par CG-collagène de type 2. Pour CG le chargement, les ASC ont été centrifugés à 2400 xg pendant 15 min. La surexpression de l'ECM lié à la chondrogenèse a été évaluée sous forme de granulés sphéroïdes constitués de ASCs centrifugés à travers l'utilisation de la safranine O et une coloration au bleu alcian. La surexpression de collagène de type 2 a été confirmée par immunofluorescence en utilisant un anticorps contre le collagène de type 2 et d'un 594 anticorps secondaire conjugué à Alexa Fluor (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm). Pour déterminer l'effet de CG sur liés chondrogenèse-ECM surexpression, ASCs ont été traités avec le TGF-β1 (10 ng / ml) comme témoin positif. Le contrôle négatif était une culture de granulés non soumis à CG chargement ou traitement TGF-β1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
![figure 3]("/files/ftp_upload/54934/54934fig3.jpg")
La figure 3. Chondrogène la formation d' agrégats est induite par gravité centrifuge dans des cultures de micromasses de cellules souches dérivées de tissu adipeux. Pour induire la différenciation chondrocytaire, ASCs (2,5 x 10 5) ont été stimulées par centrifugation à 2400 x g ou par traitement avec du TGF-β1 (10 ng / ml). ASCs non stimulées ont été utilisées comme témoins. Pour former micromasses, les cellules (2,5 x 10 5/10 pi) ont été placés au centre des puits dans une plaque de 24 puits. Après 2 h d'incubation, du milieu frais MDP pour les contrôles et centrifugés ASCs et CDM contenant du TGF-β1 (10 ng / ml) pendant ASCs traitées avec du TGF-β1, a été ajouté aux puits et les échantillons ont été mis en incubation pendant 14 jours. La condensation chondrocytes a été évaluée par la taille des agrégats.
Figure 4 est SOX9 upregmenté par gravité centrifuge dans les cellules souches dérivées de tissu adipeux. A) La régulation positive de l' ARNm SOX9 par CG stimulation pour différents intervalles de temps. B) expression de la protéine dans Sox9 ASCs CG stimulées à différents points de temps. ASCs ont été autorisés à grandir en tant que monocouche pendant 24 h après CG chargement. l'ARNm et la régulation positive de l'expression de la protéine de Sox9 a été confirmée par RT-PCR et transfert de Western, respectivement.
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Discussion
L'état des cellules de stemness est très important pour la surexpression CG-induite de SOX9. Dans notre étude, l'expression de SOX9 pourrait être induite par CG en ASCs début de passage (2-3), mais pas dans ASCs plus tard, passage. Il a été rapporté que, pendant la culture, ASCs contiennent des cellules CD34 + jusqu'à 3 passages 16. ASCs ont tendance à perdre l'expression de CD34 que les cellules sont repiquées, ce qui entraîne une faible réponse au CG.
Avec la force de gravité centrifuge, la pression hydrostatique peut être chargé sur des cellules CG pendant la stimulation. Par conséquent, le volume de milieu peut être l'un des facteurs qui affectent l'induction de SOX9. Afin de maintenir un environnement de pression hydrostatique , même pour chaque essai, 1 ml de milieu a été utilisé pour 1 x 10 5 cellules dans un tube de 15 ml. En outre, un rotor oscillant seau a été utilisé pour appliquer uniformément CG aux cellules (en formant un angle droit).
Par rapport au TGF-β1, le GC a montré une capacité inférieure àinduire SOX9 et l'expression du marqueur chondrogénique dans ASCs. Cela peut être une limitation de cette technique. Pour une application clinique, il faut en outre étudié si ASCs CG stimulées par régénèrent altération du cartilage jusqu'au niveau de fonctionnement normal dans un modèle in vivo.
La culture in vitro avec des facteurs de croissance, en particulier du TGF-β1, est la méthode la plus efficace pour induire la différenciation chondrocytaire des cellules souches 17. Cette méthode est connue pour être utile pour l'enrichissement des cellules et la différenciation chondrogénique induction. Cependant, sénescence précoce et la différenciation de la lignée inattendue se produisent souvent pendant la culture in vitro 18, 19. Plus grave est le risque élevé de contamination par des cultures in vitro. D'autre part, notre procédé ne nécessite pas la différenciation chondrogénique in vitro avec des facteurs de croissance. Les cellules souches peuvent être transplantées dans un patients immédiatement après l'isolement et après centrifugation, ce qui peut garantir un faible risque de contamination et d'une durée de traitement plus courte. Le microenvironnement autour des cellules souches est critique pour chondrogénique induction de la différenciation. La différenciation de la lignée inattendue peut résulter d'une mauvaise environnement in vitro. Comme mentionné dans notre méthode, parce que les cellules souches centrifugés peuvent être transplantées dans le cartilage d'un patient (l'environnement approprié pour la différenciation chondrogénique) sans un processus de différenciation supplémentaire, la différenciation de la lignée inattendue peut être diminuée.
Ici, nous présentons un protocole qui utilise CG pour induire la différenciation chondrogénique des ASCs. Nos résultats montrent que CG induit Sox9 surexpression et phénotypes de différenciation chondrogéniques dans ASCs, y compris surexpression COL2A1, plus vaste dépôt d'ECM, et la formation d'agrégats chondrogénique. Sur la base de nos résultats, les ASCs exposés à CG sont un bon substitut pour ee CSM traitées avec du TGF-β1 et peuvent donc être utilisés dans des transplantations pour la régénération du cartilage.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 60 mm Dish | TPP | 93060 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| ASC Culture Media Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM Low glucose | Life Technologies | 11885-084 | growth base media |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
| DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | chondrogenic differentiation base media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D2915 | 100 nM |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | 50 μg/mL |
| L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50 μg/mL |
| ITS | BD | 354352 | 1% |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL |
| Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Human adipose-derived stem cells (ASCs) | Catholic MASTER Cells | ||
References
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