Introduction
Los defectos en el cartílago articular no se curan de forma natural. En consecuencia, trasplante de células madre ha sido propuesta como un enfoque prometedor para la reparación de cartílago deteriorado. Sin embargo, este método requiere tanto la adquisición de un número suficiente de células madre y la inducción de estas células a someterse a la diferenciación condrogénica. La médula ósea (BM) se ha usado ampliamente como una fuente de células madre, pero el aislamiento de células de BM tiene dos desventajas principales: invasión y de rendimiento insuficiente. Debido a su facilidad de adquisición, el tejido adiposo es una fuente preferida de células madre. Estudios previos demostraron la factibilidad de aislamiento de células madre a partir de tejido adiposo y la inducción de la diferenciación condrogénica en estas células por medio de citocinas, tales como TGF-β1 1, 2. Estos métodos son eficaces, pero caro.
Como una alternativa de bajo costo para las citoquinas, la tensión mecánica se puede utilizar parainducir la diferenciación condrogénica. Carga mecánica juega un papel crítico en el mantenimiento de la salud del cartílago articular 3, y que puede inducir fenotipos condrogénicas en diversas células. Por ejemplo, la presión hidrostática induce fenotipos condrogénicas en las células progenitoras sinovial derivado a través de la vía de la MAP quinasa / JNK 4, y la compresión mecánica induce condrogénesis en células madre mesenquimales humanas (MSCs) upregulating genes chondrocytic 5. Además, la tensión de cizallamiento contribuye a la expresión de la matriz extracelular relacionados condrogénesis-(ECM), en MSC humanas 6. Gravedad centrífuga (CG), una tensión mecánica fácilmente aplicada y controlada generada por centrifugación, se puede inducir la expresión génica diferencial en las células 7. Por ejemplo, en células de carcinoma de pulmón epiteliales, la expresión de la interleucina 1b (IL) es upregulated por centrifugación 8. Tor lo tanto, como una tensión mecánica experimentalmente inducible, CG se puede utilizar para inducir la expresión de genes en las células madre chondrocytic. Sin embargo, no queda claro si CG puede inducir la diferenciación condrogénica de las células madre.
En este estudio, se encontró que CG indujo la regulación al alza de SOX9, un regulador maestro de la condrogénesis, en ASC humanos, dando como resultado la sobreexpresión de los genes chondrocytic. Además, se compararon los efectos de CG en la condrogénesis con las de TGF-β1, el factor de crecimiento más comúnmente utilizado para inducir la condrogénesis in vitro en las células madre.
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Protocol
Este protocolo de estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional de la Universidad Católica de Corea (KC16EAME0162) y lleva a cabo según las directrices del NIH. Todos los tejidos se obtuvieron con consentimiento informado por escrito.
1. La gravedad centrífuga Carga y Pellet Cultura
- Cultivo de células y la cosecha
- Cultura ASC (P2-P3; véase la Lista de Materiales) en Modificado Medio-bajo nivel de glucosa de Eagle de Dulbecco (DMEM-LG) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina (P / S) a 37 ° C en un incubador humidificado que contiene 5% de CO 2.
- Cuando las células alcanzan el 80% de confluencia, se elimina el medio y se lavan las células con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS).
- Añadir 1 ml de PBS que contenía EDTA 1 mM y se incuba durante 2 min a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO 2.
- Toque suavemente la placa de cultivo, añadir 4 ml de medio fresco, transferir las células aun tubo de 15 ml cónico, y centrifugar las células a 250 xg durante 2 min a temperatura ambiente (RT).
- Centrífuga de carga por gravedad
- Después de la centrifugación (paso 1.1.4), eliminar el sobrenadante sin perturbar el sedimento y volver a suspender el sedimento en 10 ml de DMEM-LG con 10% de SFB. Contar las células utilizando un hemocitómetro.
- Para CG de carga, la transferencia de 2,5 × 10 5 células a un nuevo tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 2400 xg durante 15 min.
- la cultura de pellets
- Inmediatamente después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y añadir 500 l de medio de diferenciación condrogénica definido (CDM, DMEM de alta glucosa suplementado con 1% de FBS,, 100 nM de dexametasona, solución de aminoácidos 1x MEM no esenciales 1% ITS + Premix, 50 g / ml de L-prolina, y 1% de penicilina / estreptomicina). Añadir 50 g / ml de recién preparada de ácido L-ascórbico 2-fosfato en cada cambio de medio. Como control positivo, inducir differentiati condrogénicasen las células no centrifugadas mediante la adición de CDM que contiene 10 ng / ml de TGF-β1.
- Colocar los tubos tapados holgadamente que contienen las pastillas en una posición de pie y se incuba a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO 2.
- Cambiar el medio cada dos días durante 3 semanas.
- cultura Micromass
- Inmediatamente después de la centrifugación (etapa 1.2.2; 2.400 × g durante 15 min), aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 l de CDM.
- Para formar un Micromass, colocar las células resuspendidas en el centro de un pocillo de una placa de 24 pocillos.
- Después de 2 h, se añade cuidadosamente 1 ml de MDL a la fuente, el pipeteado contra la pared de la placa para evitar la interrupción de la Micromass. Como control positivo, realizar un cultivo en micromasa con células no centrifugadas mediante la adición de CDM que contiene 10 ng / ml de TGF-β1.
- Incubar la Micromass a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO 2.
- Cambiar el medio evEry otro día durante 3 semanas.
2. la transcriptasa reversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) para detectar la transcripción regulación al alza de diferenciación condrogénica Marcadores
- En el día 14, utilizar una pipeta para transferir los gránulos esferoidales a un nuevo tubo de 1,5 ml y lavar en 1 x PBS.
- Se extrae el ARN total de las pastillas utilizando el método de extracción con tiocianato-fenol-cloroformo guanidinio 9.
- Sintetizar ADNc a partir de 2 g de ARN total usando la transcriptasa inversa de acuerdo con el protocolo del fabricante (incubar a 42 ° C durante 1 h y después inactivar la enzima a 70 ° C durante 5 min).
- Realizar PCR con cebadores específicos para los marcadores de diferenciación condrogénica 10.
3. La tinción para detectar la sobreexpresión de proteínas condrogénicas diferenciación de un marcador
- sedimentos de células de inclusión en parafina
- En el día 21,utilizar una pipeta para recoger las bolitas esferoide y lavarlos con PBS 1x.
- Fijar los pellets de esferoides por inmersión en paraformaldehído al 4% durante 24 h.
Precaución: El paraformaldehído es altamente tóxico. Evitar el contacto con los ojos, la piel o las membranas mucosas. Minimizar la exposición y evitar la inhalación durante la preparación. Use equipo de protección personal adecuado. - Desechar el fijador y enjuagar los sedimentos celulares con agua desionizada (DW).
- Colocar una capa de gasa sobre el cassette y transferir los pellets fijas usando una pipeta. Cubrir el sedimento doblando la gasa y cierre la tapa.
- Deshidratar los pellets.
- Sumergir los gránulos en 70% de etanol (EtOH) durante 5 min a RT.
- Sumergir los gránulos en 80% de EtOH durante 5 min a RT.
- Sumergir los gránulos en 95% de EtOH durante 5 min a RT.
- Sumergir los gránulos en 100% de EtOH durante 5 min a RT. Repetir dos veces.
- Sumergir los gránulos en 100% de xileno durante 15 min a RT. Repita TWIce.
- Insertar los sedimentos celulares fijos en parafina a 56 ° C en un molde; las pastillas puede ser embebido en parafina utilizando sistemas de procesamiento automatizado de tejidos especializados.
- Cortar secciones de 5 micras de espesor del sedimento celular en parafina usando un micrótomo rotatorio.
- Flotar las secciones en EtOH al 50% y luego transferirlos a un baño de agua a 50 ° utilizando una diapositiva.
- Coloque las secciones flotantes en portaobjetos.
- Safranina O y tinción con azul Alcian
- Rehidratar las secciones de parafina.
- Sumergir los portaobjetos en xileno durante 15 minutos. Repetir dos veces.
- Sumergir los portaobjetos en EtOH al 100% durante 5 min. Repetir dos veces.
- Sumergir los portaobjetos en EtOH al 90% durante 5 min.
- Sumergir los portaobjetos en EtOH al 80% durante 5 min.
- Sumergir los portaobjetos en EtOH al 70% durante 5 minutos, y luego lavarlos en 1x PBS.
- Tinción de las secciones rehidratadas con solución de safranina O 1% y 3% de azul Alcian para30 minutos.
- Desechar la solución de tinción y enjuague las secciones con DW.
- Manchar las secciones con solución de hematoxilina / eosina (contratinción) durante 1 minuto.
- Desechar la solución de tinción y enjuague las secciones con DW.
- Colocar una gota de medio de montaje sobre un cubreobjetos después de la eliminación de cualquier agua residual. Con cuidado, coloque la corredera (célula boca abajo) sobre el portaobjetos que contiene el medio de montaje.
- Deje que los portaobjetos se sequen durante 2-3 horas a temperatura ambiente.
- Capturar imágenes utilizando un microscopio de campo brillante (microscopio vertical automatizado, 50X y 200X).
- Rehidratar las secciones de parafina.
- ensayo de inmunofluorescencia
- Rehidratar las secciones tal como se describe en la sección 3.2.1.
- Sumergir los portaobjetos en tampón de citrato de sodio (citrato de sodio 10 mM, 0,05% de Tween 20, pH 6,0) y, a continuación, mantenerlas a una temperatura sub-hirviendo durante 10 min usando un horno de microondas.
- Enfriar los portaobjetos durante 20 minutos a temperatura ambiente y luego lavar con agua del grifo.
- Incubar los portaobjetos en un 3%H 2 O 2 (en 1x PBS) durante 15 min, y luego los lavar con agua del grifo durante 15 min 11.
- Bloquear los portaobjetos con tampón de bloqueo (10% de suero de cabra normal en PBS) durante 1 h.
- Aspirar la solución de bloqueo, y luego aplicar un anticuerpo primario diluido con suero de cabra normal al 5% sobre los portaobjetos.
- Incubar los portaobjetos durante la noche a 4 ° C.
- Lavar los portaobjetos tres veces en 1X PBS durante 5 min cada uno.
- Incubar las diapositivas de anticuerpo secundario conjugado a un fluorocromo diluido con suero de cabra normal al 5% durante 1 h a TA en la oscuridad.
- Lavar los portaobjetos tres veces en 1X PBS durante 5 min cada uno en la oscuridad.
- Incubar los portaobjetos con DAPI (1 mg / ml) durante 10 min, y luego los de lavado dos veces en 1X PBS durante 5 min cada uno.
- Colocar una gota de medio de montaje sobre un cubreobjetos después de la eliminación de cualquier agua residual. Con cuidado, coloque la corredera (celular lado negativo) en el medio de montaje.
- Deje que los portaobjetos se sequen durante 2-3h en la oscuridad a temperatura ambiente.
- Visualizar las diapositivas utilizando microscopía de fluorescencia (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; 60X y 200X) 12.
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Representative Results
gravedad centrífuga induce la sobreexpresión de los marcadores de diferenciación condrogénica de las células madre derivadas de tejido adiposo.
Para determinar el grado de fuerza de gravedad centrífuga que es adecuado para inducir la diferenciación condrogénica, ASC se estimularon con diferentes grados de CG (0, 300, 600, 1.200, y 2.400 xg) durante 15 min. Después de la estimulación, las ASC fueron re-sembradas en placas de cultivo y se cultivaron durante 24 h. Como se muestra en la Figura 1A, la expresión SOX9 mRNA fue significativamente mayor en 2.400 xg; que era aproximadamente 1,5 veces superior a 2.400 xg que en el control (ASC no cargan con CG). Para confirmar si CG induce la diferenciación condrogénica, estimulamos ASC por CG de carga o por el tratamiento de TGF-β1. Como control negativo, ASC se cultivaron sin ninguna estimulación. Las muestras se recogieron el día 14 y se realizó qRT-PCR. Como se muestra en Figura 1, COL2A1 mRNA, un marcador de diferenciación condrogénica representativa, se reguló en ASC estimuladas por CG con respecto a las células control (sin estimular las ASC). El nivel de la regulación positiva de COL2A1 mRNA por la estimulación CG fue similar a la inducida por el tratamiento de TGF-β1. Por otro lado, COL10, un marcador de condrocitos hipertróficos, se downregulated por la estimulación CG. ACAN mRNA, que codifica un componente estructural principal del cartílago articular, se upregulated aproximadamente 2 veces por estimulación CG, mientras que no era detectable COL1 elevada respecto a los controles. Ni ACAN ni COL1 fueron upregulated en ASC tratados con TGF-β1.
gravedad centrífuga induce la expresión de una matriz extracelular relacionados con la condrogénesis en la cultura pellet de células madre derivadas de tejido adiposo.
Depositarion de ECM, tales como glicosaminoglicanos, es un fenotipo distintivo de diferenciación condrogénica. Para detectar este material, teñidas ASCs pellet-cultivadas con safranina O y el azul Alcian en el día 21. Como se muestra en la Figura 2A, ASC estimuladas con CG depositan más glicosaminoglicano (rojo para safranina O y el azul para azul Alcian) que los controles, a una nivel similar al que haya depositado ASC tratados con TGF-β1. En estos experimentos, la tinción positiva indicó la formación de una matriz de cartílago. Para mayor confirmación, que supervisó la expresión de la proteína COL2A1 utilizando el anticuerpo anti-COL2A1 conjugado con PE. COL2A1 se sobreexpresa en ASCs estimuladas con CG en una medida ligeramente mayor que en ASCs tratados con TGF-β1 (Figura 2B).
la formación de agregados condrogénica se induce por gravedad centrífuga en un cultivo en micromasa de células madre derivadas de tejido adiposo.
13. Por lo tanto, se comparó la condensación en las Micromass entre las culturas de ASC y ASC de control estimulados con CG o TGF-β1. Como se muestra en la Figura 3, se detectaron agregados más grandes y más densas de ASC (en la plaza de puntos de color blanco) en cultivos de micromasa hechas de ASC estimuladas con CG o TGF-β1 que en los cultivos de control.
SOX9 está regulada positivamente por gravedad centrífuga en las células madre derivadas de tejido adiposo.
Sox9 es un regulador maestro de la diferenciación condrogénica 14, 15. Para determinar si CG induce la regulación al alza de Sox9 en ASC, que supervisó la expresión de mRNA en SOX9 ASC expuestos a diferentes duraciones de CG STIMULAción (2.400 xg). Expresión SOX9 se investigó en varios grados de CG, pero no difirió significativamente entre las condiciones de CG con fuerzas superiores a 2400 × g (datos no mostrados). La expresión de mRNA SOX9 comenzó a aumentar después de 15 min de estimulación CG, y se saturó después de 30 minutos (Figura 4A). A continuación, para determinar cuánto tiempo SOX9 sobreexpresión inducida por CG se puede mantener, cosechamos ASC estimuladas con CG en los puntos de tiempo indicados y se controló la expresión de Sox9. Como se muestra en la Figura 4B, la expresión de la proteína Sox9 aumentó hasta 3 h después de la estimulación CG y se mantuvo en ese nivel durante al menos 12 h.
Figura 1. gravedad centrífuga induce la regulación al alza de los marcadores de diferenciación condrogénica de las células madre derivadas de tejido adiposo. A) Para determinar con la mayoruitable fuerza de gravedad centrífuga, ASC se centrifugaron a diferente CG (0, 300, 600, 1.200, y 2.400 xg) durante 15 min. SOX9 expresión de ARNm se evaluó a las 24 h después de la estimulación CG. B) para evaluar la expresión de genes relacionados con la condrogénesis, el ARN total fue extraído de ASC que había sido centrifugadas, tratados con TGF-β1 (10 ng / ml), o no estimuladas (controles). El ARN se sometió a transcripción inversa para sintetizar ADNc, que después se amplificó por RT-PCR. Todos los experimentos fueron realizados al menos tres veces. Las barras de error representan la desviación estándar. ** P <0,01 para las ASC estimulados con CG frente al control (ASC-no estimuladas).
Figura 2. gravedad centrífuga induce una matriz extracelular relacionados con la condrogénesis en los cultivos de pellets de células madre derivadas de tejido adiposo. A) formato de la matriz de proteoglicanosion por CG de carga. B) la sobreexpresión CG-inducida de colágeno de tipo 2. Para CG carga, ASC se centrifugaron a 2400 xg durante 15 min. La sobreexpresión de ECM condrogénesis relacionada se evaluó en pellets de esferoide consistentes en ASC centrifugados a través del uso de safranina O y tinción con azul de Alcian. La sobreexpresión de colágeno de tipo 2 se confirmó por inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo contra el colágeno de tipo 2 y un Alexa Fluor 594 conjugado con anticuerpo secundario (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm). Para determinar el efecto de CG en la sobreexpresión ECM relacionados condrogénesis-, ASC fueron tratados con TGF-β1 (10 ng / ml) como control positivo. El control negativo fue una cultura de pellets no sometido a carga CG o el tratamiento de TGF-β1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
![figura 3]("/files/ftp_upload/54934/54934fig3.jpg")
Figura 3. formación de agregados condrogénica se induce por gravedad centrífuga en cultivos de micromasa de células madre derivadas de tejido adiposo. Para inducir la diferenciación condrogénica, ASC (2,5 × 10 5) se estimularon por centrifugación a 2400 × g o por tratamiento con TGF-β1 (10 ng / ml). ASC no estimuladas se utilizaron como controles. Para formar micromasas, se colocaron células (2,5 × 10 5/10 l) en el centro de pozos en una placa de 24 pocillos. Después de 2 h de incubación, fresco medio-CDM para los controles y se centrifugó ASC y CDM que contienen TGF-β1 (10 ng / ml) durante ASCs tratados con TGF-β1-se añaden a los pocillos, y las muestras se incubaron durante 14 días. condensación de condrocitos se evaluó por el tamaño de los agregados.
Figura 4. SOX9 es upregulados por gravedad centrífuga en las células madre derivadas de tejido adiposo. A) Regulación al alza de SOX9 mRNA por la estimulación CG para diversos intervalos de tiempo. B) expresión de la proteína Sox9 en ASCs estimuladas con CG en diferentes puntos temporales. ASC se dejaron crecer como una monocapa durante 24 h después de la CG de carga. mRNA upregulation y la expresión de la proteína de Sox9 fueron confirmados por RT-PCR e inmunotransferencia de tipo Western, respectivamente.
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Discussion
El estado stemness de las células es muy importante para la sobreexpresión inducida por CG de SOX9. En nuestro estudio, la expresión SOX9 podría ser inducida por CG en ASC-paso temprano (2-3), pero no en ASC-tarde de paso. Se ha informado de que, durante el cultivo, ASC contienen CD34 + células hasta 3 pasajes 16. ASCs tienden a perder la expresión de CD34 como se pasan las células, lo que resulta en una baja respuesta a CG.
Con la fuerza de gravedad centrífuga, la presión hidrostática puede cargarse en las células durante la estimulación CG. Por lo tanto, el volumen de medio puede ser uno de los factores que afectan a la inducción de SOX9. Para mantener un ambiente de presión hidrostática, incluso para cada experimento, se utilizó 1 ml de medio por 1 × 10 5 células en un tubo de 15 ml. Además, se utilizó un rotor basculante cubo para aplicar de manera uniforme CG a las células (mediante la formación de un ángulo recto).
En comparación con el TGF-β1, CG mostró una capacidad inferior ainducir la expresión de marcadores de SOX9 y condrogénica en ASC. Esto puede ser una limitación de esta técnica. Para una aplicación clínica, se debe investigar más a fondo si ASC-estimulado CG regenerar el cartílago deteriorado hasta el nivel de la función normal en un modelo in vivo.
El cultivo in vitro con factores de crecimiento, especialmente TGF-β1, es el método más eficaz para inducir la diferenciación condrogénica de las células madre 17. Este método es conocido por ser útil para el enriquecimiento celular y la inducción diferenciación condrogénica. Sin embargo, la senescencia temprana y la diferenciación del linaje inesperada a menudo se producen durante el cultivo in vitro 18, 19. Más grave es el alto riesgo de contaminación de los cultivos in vitro. Por otro lado, nuestro método no requiere en la diferenciación condrogénica in vitro con factores de crecimiento. Las células madre se pueden trasplantar a un papa- inmediatamente después del aislamiento y después de la centrifugación, lo que puede garantizar un riesgo de contaminación bajo y un tiempo de procesamiento más corto. El microambiente alrededor de las células madre es fundamental para la inducción de la diferenciación condrogénica. La diferenciación del linaje inesperado puede ser el resultado de una inadecuada en el entorno vitro. Como se mencionó en nuestro método, porque las células madre centrifugadas pueden ser trasplantados en el cartílago de un paciente (el entorno adecuado para la diferenciación condrogénica) sin un proceso de diferenciación adicional, la diferenciación de linaje inesperado puede disminuir.
A continuación, presentamos un protocolo que utiliza CG para inducir la diferenciación condrogénica de ASC. Nuestros resultados muestran que CG induce upregulation Sox9 y fenotipos diferenciación condrogénica en ASC, incluyendo la sobreexpresión COL2A1, más extensa deposición de ECM y formación de agregados condrogénica. En base a los resultados, las ASC expuestos a CG son un buen sustituto para el the MSCs tratados con TGF-β1 y por lo tanto pueden usarse en trasplantes para la regeneración del cartílago.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 60 mm Dish | TPP | 93060 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| ASC Culture Media Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM Low glucose | Life Technologies | 11885-084 | growth base media |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
| DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | chondrogenic differentiation base media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D2915 | 100 nM |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | 50 μg/mL |
| L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50 μg/mL |
| ITS | BD | 354352 | 1% |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL |
| Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Human adipose-derived stem cells (ASCs) | Catholic MASTER Cells | ||
References
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