Introduction
जोड़ कार्टिलेज में दोष स्वाभाविक रूप से ठीक नहीं है। नतीजतन, स्टेम सेल प्रत्यारोपण बिगड़ा उपास्थि की मरम्मत के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण के रूप में प्रस्तावित किया गया है। हालांकि, इस पद्धति दोनों स्टेम कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या के अधिग्रहण और इन कोशिकाओं की प्रेरण chondrogenic भेदभाव से गुजरना करने की आवश्यकता है। अस्थि मज्जा (बीएम) व्यापक रूप से स्टेम सेल के एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया है, लेकिन बी.एम. से सेल अलगाव दो प्रमुख नुकसान है: invasiveness और अपर्याप्त उपज। अधिग्रहण के अपने आसानी के कारण, वसा ऊतकों से स्टेम कोशिकाओं का एक बेहतर स्रोत है। पिछले अध्ययनों से वसा ऊतकों से स्टेम कोशिकाओं को अलग-थलग और ये ऐसे TGF-β1 1, 2 के रूप में साइटोकिन्स, का उपयोग कोशिकाओं में chondrogenic भेदभाव उत्प्रेरण की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया। इन विधियों प्रभावी लेकिन महंगे हैं।
साइटोकिन्स के लिए एक कम लागत विकल्प के रूप में, यांत्रिक तनाव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताchondrogenic भेदभाव प्रेरित। यांत्रिक लोड हो रहा जोड़ कार्टिलेज 3 के स्वास्थ्य को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और यह विभिन्न कोशिकाओं में chondrogenic phenotypes पैदा कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, हीड्रास्टाटिक दबाव एमएपी काइनेज / JNK मार्ग 4 के माध्यम से synovium व्युत्पन्न पूर्वज कोशिकाओं में chondrogenic phenotypes लाती है, और यांत्रिक संपीड़न chondrocytic जीन 5 upregulating द्वारा मानव mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) में उपास्थिजनन लाती है। इसके अलावा, कतरनी तनाव मानव MSCs 6 में उपास्थिजनन से संबंधित बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) की अभिव्यक्ति के लिए योगदान देता है। केन्द्रापसारक गुरुत्वाकर्षण (सीजी), एक आसानी से लागू किया और नियंत्रित यांत्रिक centrifugation द्वारा उत्पन्न तनाव, कोशिकाओं 7 में अंतर जीन अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, फेफड़ों उपकला कार्सिनोमा कोशिकाओं में, इंटरल्यूकिन (IL) -1b की अभिव्यक्ति centrifugation 8 से upregulated है। टीherefore, एक प्रयोगात्मक inducible यांत्रिक तनाव के रूप में, तटरक्षक स्टेम कोशिकाओं में chondrocytic जीन अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, यह स्पष्ट नहीं हुआ है तटरक्षक स्टेम कोशिकाओं की chondrogenic भेदभाव प्रेरित कर सकते हैं।
इस अध्ययन में हमने पाया कि तटरक्षक SOX9 की upregulation, उपास्थिजनन के एक मास्टर नियामक प्रेरित, मानव ASCs में, chondrocytic जीन की overexpression में जिसके परिणामस्वरूप। इसके अलावा, हम TGF-β1 के लोगों के साथ उपास्थिजनन पर तटरक्षक के प्रभाव, वृद्धि कारक सबसे अधिक स्टेम कोशिकाओं में इन विट्रो उपास्थिजनन के लिए प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल की तुलना में।
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Protocol
इस अध्ययन प्रोटोकॉल कोरिया के कैथोलिक विश्वविद्यालय (KC16EAME0162) के संस्थागत समीक्षा बोर्ड ने मंजूरी दे दी है और एनआईएच दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया था। सभी ऊतकों लिखित सूचित सहमति से प्राप्त किया गया।
1. केन्द्रापसारक गुरुत्वाकर्षण लोड हो रहा है और गोली संस्कृति
- सेल संस्कृति और फसल
- संस्कृति ASCs (p2-पी 3, सामग्री की सूची देखें) 37 डिग्री सेल्सियस पर Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम कम ग्लूकोज (DMEM-एलजी) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) के साथ पूरक में जिसमें 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में।
- कोशिकाओं को 80% संगम तक पहुँचने, मध्यम त्यागने और 1x फॉस्फेट बफर खारा के 5 एमएल (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को धो लें।
- पीबीएस युक्त 1 मिमी EDTA के 1 एमएल जोड़ें और युक्त 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए सेते हैं।
- , धीरे संस्कृति थाली नल ताजा माध्यम से 4 एमएल जोड़ने के लिए, कोशिकाओं हस्तांतरणएक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब, और सेंट्रीफ्यूज (आरटी) कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 250 × छ कोशिकाओं।
- केन्द्रापसारक गुरुत्वाकर्षण लोड हो रहा है
- centrifugation (कदम 1.1.4) के बाद, गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला हटाने और 10% FBS के साथ DMEM-एलजी के 10 एमएल में गोली resuspend। एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
- तटरक्षक लोड करने के लिए, 15 मिनट के लिए 2,400 × छ एक नया 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए 2.5 × 10 5 कोशिकाओं को हस्तांतरण।
- गोली संस्कृति
- इसके तत्काल बाद centrifugation, तैरनेवाला aspirate और परिभाषित chondrogenic भेदभाव माध्यम के 500 μL जोड़ने (सीडीएम, उच्च ग्लूकोज DMEM 1% FBS, 1% अपनी + Premix, 100 एनएम dexamethasone, 1x सदस्य गैर आवश्यक अमीनो एसिड समाधान, 50 ग्राम के साथ पूरक / एमएल एल प्रोलाइन, और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन)। हर माध्यम परिवर्तन पर हौसले से तैयार एल ascorbic एसिड 2-फॉस्फेट के 50 माइक्रोग्राम / एमएल जोड़ें। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, chondrogenic differentiati प्रेरितजोड़कर uncentrifuged कोशिकाओं में सीडीएम पर 10 एनजी / एमएल TGF-β1 हैं।
- शिथिल छाया हुआ ट्यूबों के छर्रों से युक्त एक खड़ी स्थिति में रखें और युक्त 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- 3 सप्ताह के लिए हर दूसरे दिन मध्यम बदलें।
- Micromass संस्कृति
- इसके तत्काल बाद centrifugation (कदम 1.2.2, 15 मिनट के लिए 2,400 × छ) के बाद, सतह पर तैरनेवाला aspirate और सीडीएम के 10 μL में गोली resuspend।
- एक Micromass फार्म करने के लिए, एक 24 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से केंद्र में resuspended कोशिकाओं जगह है।
- 2 घंटे के बाद, ध्यान Micromass में खलल न डालें से बचने के लिए अच्छी तरह से, प्लेट की दीवार के खिलाफ pipetting को सीडीएम के 1 एमएल जोड़ें। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, 10 एनजी / एमएल TGF-β1 युक्त सीडीएम जोड़कर uncentrifuged कोशिकाओं के साथ एक Micromass संस्कृति प्रदर्शन करते हैं।
- जिसमें 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर Micromass सेते हैं।
- मध्यम EV बदलें3 सप्ताह के लिए दूसरे दिन ery।
2. रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी पीसीआर) Chondrogenic भेदभाव मार्करों के Transcriptional अपरेगुलेशन का पता लगाने के लिए
- 14 दिन, 1x पीबीएस में एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को अंडाकार आकृति छर्रों हस्तांतरण और उन्हें धोने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
- Guanidinium thiocyanate फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण विधि 9 का उपयोग छर्रों से कुल शाही सेना निकालें।
- कुल शाही सेना निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग कर के 2 माइक्रोग्राम से सीडीएनए synthesize (1 घंटे के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और फिर 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइम निष्क्रिय)।
- Chondrogenic भेदभाव मार्करों 10 के लिए विशिष्ट प्राइमरों के साथ पीसीआर प्रदर्शन करना।
3. धुंधला Chondrogenic भेदभाव मार्कर प्रोटीन की overexpression का पता लगाने के लिए
- आयल embedding सेल छर्रों
- 21 दिन,अंडाकार आकृति छर्रों फसल और उन्हें 1x पीबीएस के साथ धोने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
- 24 घंटे के लिए 4% paraformaldehyde में विसर्जन से अंडाकार आकृति छर्रों को ठीक करें।
सावधानी: Paraformaldehyde बेहद जहरीला है। आंखों, त्वचा, या श्लेष्मा झिल्ली के साथ संपर्क से बचें। जोखिम को कम करने और तैयारी के दौरान साँस लेना बचें। उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें। - लगानेवाला त्यागें और विआयनीकृत पानी (DW) के साथ सेल छर्रों कुल्ला।
- धुंध की एक परत कैसेट पर प्लेस और एक पिपेट का उपयोग कर तय छर्रों हस्तांतरण। धुंध तह करके गोली कवर और कैसेट ढक्कन बंद कर दें।
- छर्रों निर्जलीकरण।
- आरटी पर 5 मिनट के लिए 70% इथेनॉल (EtOH) में छर्रों विसर्जित कर दिया।
- आरटी पर 5 मिनट के लिए 80% EtOH में छर्रों विसर्जित कर दिया।
- आरटी पर 5 मिनट के लिए 95% EtOH में छर्रों विसर्जित कर दिया।
- आरटी पर 5 मिनट के लिए 100% EtOH में छर्रों विसर्जित कर दिया। दो बार दोहराएँ।
- आरटी पर 15 मिनट के लिए 100% xylene में छर्रों विसर्जित कर दिया। दोहराएँ ट्वीसीई।
- एक सांचे में 56 डिग्री सेल्सियस पर आयल में तय सेल छर्रों एम्बेड; छर्रों विशेष स्वचालित ऊतक प्रोसेसिंग सिस्टम का उपयोग कर आयल में एम्बेड किया जा सकता है।
- आयल एम्बेडेड सेल एक रोटरी microtome का उपयोग कर गोली से 5 माइक्रोन मोटी वर्गों में कटौती।
- 50% EtOH में वर्गों फ्लोट और फिर एक स्लाइड का उपयोग कर एक 50 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान के लिए उन्हें स्थानांतरित।
- अस्थायी वर्गों स्लाइड पर रखें।
- सैफरैनीन हे और Alcian नीले धुंधला
- आयल वर्गों rehydrate।
- 15 मिनट के लिए xylene में विसर्जित स्लाइड। दो बार दोहराएँ।
- 5 मिनट के लिए 100% EtOH में विसर्जित स्लाइड। दो बार दोहराएँ।
- 5 मिनट के लिए 90% EtOH में विसर्जित स्लाइड।
- 5 मिनट के लिए 80% EtOH में विसर्जित स्लाइड।
- 5 मिनट के लिए 70% EtOH में विसर्जित स्लाइड, और फिर उन्हें 1x पीबीएस में धो लें।
- 1% सैफरैनीन हे समाधान और के लिए 3% Alcian नीले रंग के साथ rehydrated वर्गों दाग30 मिनट।
- धुंधला समाधान त्यागें और DW के साथ वर्गों कुल्ला।
- 1 मिनट के लिए Hematoxylin / Eosin समाधान (counterstain) के साथ वर्गों दाग।
- धुंधला समाधान त्यागें और DW के साथ वर्गों कुल्ला।
- किसी भी अवशिष्ट पानी को हटाने के बाद एक coverslip पर बढ़ते मध्यम की एक बूंद रखें। ध्यान से बढ़ते मध्यम युक्त coverslip पर स्लाइड (नीचे सेल की ओर) जगह है।
- स्लाइड आरटी पर 2-3 घंटे के लिए शुष्क करने की अनुमति दें।
- एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप (स्वचालित ईमानदार माइक्रोस्कोप, 50X और 200X) का उपयोग कर छवियों पर कब्जा।
- आयल वर्गों rehydrate।
- immunofluorescence परख
- खंड 3.2.1 में वर्णित के रूप वर्गों rehydrate।
- सोडियम साइट्रेट बफर में स्लाइड्स (10 मिमी सोडियम साइट्रेट, 0.05% के बीच 20, पीएच 6.0) को विसर्जित कर दिया, और फिर एक माइक्रोवेव का उपयोग कर 10 मिनट के लिए एक उप-उबलते तापमान पर उन्हें बनाए रखना।
- आरटी पर 20 मिनट के लिए स्लाइड शांत और फिर उन्हें नल के पानी से धो लें।
- 3% में स्लाइड्स सेतेएच 2 ओ 2 से 15 मिनट के लिए (1x पीबीएस में), और फिर 15 मिनट के लिए 11 नल के पानी से धो लें।
- 1 घंटे के लिए बफर (10% पीबीएस में सामान्य बकरी सीरम) को रोकने के साथ स्लाइड ब्लॉक।
- अवरुद्ध समाधान Aspirate, और फिर एक प्राथमिक एंटीबॉडी स्लाइड पर 5% सामान्य बकरी सीरम के साथ पतला लागू होते हैं।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्लाइड सेते हैं।
- स्लाइड 5 मिनट प्रत्येक के लिए 1x पीबीएस में तीन बार धोएं।
- fluorochrome संयुग्मित माध्यमिक अंधेरे में आरटी पर 1 घंटे के लिए 5% सामान्य बकरी सीरम के साथ पतला एंटीबॉडी में स्लाइड्स सेते हैं।
- स्लाइड अंधेरे में 5 मिनट प्रत्येक के लिए 1x पीबीएस में तीन बार धोएं।
- 10 मिनट के लिए DAPI (1 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ स्लाइड्स सेते हैं, और फिर उन्हें 5 मिनट प्रत्येक के लिए 1x पीबीएस में दो बार धो लो।
- किसी भी अवशिष्ट पानी को हटाने के बाद एक coverslip पर बढ़ते मध्यम की एक बूंद रखें। ध्यान से बढ़ते मध्यम पर स्लाइड (नीचे सेल की ओर) जगह है।
- स्लाइड 2-3 के लिए सूखे की अनुमति देंआरटी पर अंधेरे में एच।
- प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर स्लाइड कल्पना (: 594 एनएम, DAPI: Rhod 340 एनएम, 60X और 200x बढ़ाई) 12।
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Representative Results
केन्द्रापसारक गुरुत्वाकर्षण वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं में chondrogenic भेदभाव मार्करों की overexpression लाती है।
केन्द्रापसारक गुरुत्वाकर्षण बल chondrogenic भेदभाव प्रेरित करने के लिए उपयुक्त है कि की डिग्री का निर्धारण करने के लिए, ASCs 15 मिनट के लिए तटरक्षक के विभिन्न डिग्री (0, 300, 600, 1200, और 2400 XG) के साथ प्रेरित किया गया। उत्तेजना के बाद, ASCs संस्कृति प्लेटों पर फिर से वरीयता प्राप्त और 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत थे। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 1 ए, SOX9 mRNA अभिव्यक्ति काफी 2,400 XG पर वृद्धि की गई थी; यह लगभग 2,400 XG पर उच्च 1.5 गुना नियंत्रण (ASCs तटरक्षक के साथ लोड नहीं) की तुलना में था। कि क्या तटरक्षक chondrogenic भेदभाव लाती है इस बात की पुष्टि करने के लिए, हम तटरक्षक लोडिंग द्वारा या TGF-β1 उपचार द्वारा ASCs को प्रेरित किया। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, ASCs किसी भी उत्तेजना के बिना सुसंस्कृत थे। नमूने 14 दिन पर काटा गया और QRT- पीसीआर प्रदर्शन किया गया था। एफ में दिखाया गया हैigure 1, COL2A1 mRNA, एक प्रतिनिधि chondrogenic भेदभाव मार्कर, तटरक्षक रिश्तेदार द्वारा प्रेरित कोशिकाओं (unstimulated ASCs) को नियंत्रित करने के लिए ASCs में upregulated था। तटरक्षक उत्तेजना से COL2A1 mRNA की अपरेगुलेशन स्तर TGF-β1 उपचार से प्रेरित है कि करने के लिए इसी तरह की थी। दूसरी ओर, COL10, हाईपरट्राफिक chondrocytes के एक मार्कर, तटरक्षक उत्तेजना से downregulated था। ACAN mRNA, जो जोड़ कार्टिलेज का एक प्रमुख संरचनात्मक घटक को कूटबद्ध, तटरक्षक उत्तेजना से लगभग 2 गुना upregulated किया गया था, जबकि Col1 नियंत्रण करने के लिए detectably ऊंचा रिश्तेदार नहीं था। न तो है और न ही ACAN Col1 TGF-β1 के साथ इलाज किया ASCs में upregulated थे।
केन्द्रापसारक गुरुत्वाकर्षण एक उपास्थिजनन संबंधी वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं की गोली संस्कृति में बाह्य मैट्रिक्स की अभिव्यक्ति लाती है।
जमाईसीएम के आयन, इस तरह के रूप में ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन, chondrogenic भेदभाव की एक बानगी phenotype है। इस सामग्री का पता लगाने के लिए, हम सैफरैनीन हे और 21 दिन पर Alcian नीले रंग के साथ गोली सुसंस्कृत ASCs दाग के रूप में चित्रा 2A में दिखाया गया है, तटरक्षक के साथ प्रेरित ASCs, जमा और अधिक ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन नियंत्रण से (सैफरैनीन ओ के लिए लाल और नीले रंग के लिए Alcian ब्लू) एक पर TGF-β1 के साथ इलाज किया ASCs द्वारा जमा की है कि इसी तरह के स्तर। इन प्रयोगों में, सकारात्मक धुंधला एक उपास्थि मैट्रिक्स के गठन का संकेत दिया। आगे की पुष्टि के लिए, हम पीई संयुग्मित विरोधी COL2A1 एंटीबॉडी का उपयोग COL2A1 प्रोटीन की अभिव्यक्ति पर नजर रखी। COL2A1 TGF-β1 (चित्रा 2 बी) के साथ इलाज ASCs में की तुलना में थोड़ा अधिक से अधिक हद तक तटरक्षक के साथ प्रेरित ASCs में overexpressed था।
Chondrogenic कुल गठन वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं का एक Micromass संस्कृति में केन्द्रापसारक गुरुत्वाकर्षण से प्रेरित है।
13 के लिए एक शर्त है। इसलिए, हम नियंत्रण ASCs की संस्कृतियों और ASCs तटरक्षक या TGF-β1 के साथ प्रेरित बीच Micromass में संक्षेपण तुलना में। के रूप में 3 चित्र में दिखाया, ASCs (सफेद रंग बिंदीदार वर्ग में) के बड़े और सघन एकत्रित Micromass नियंत्रण संस्कृतियों में से तटरक्षक या TGF-β1 के साथ प्रेरित ASCs के बने संस्कृतियों में पाया गया।
SOX9 वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं में केन्द्रापसारक गंभीरता से upregulated है।
Sox9 chondrogenic भेदभाव 14, 15 के एक मास्टर नियामक है। कि क्या तटरक्षक ASCs में Sox9 की upregulation लाती है निर्धारित करने के लिए, हम तटरक्षक stimula के विभिन्न अवधियों के संपर्क में ASCs में SOX9 mRNA की अभिव्यक्ति पर नजर रखीtion (2,400 × छ)। SOX9 अभिव्यक्ति तटरक्षक के विभिन्न डिग्री पर जांच की गई है, लेकिन यह काफी की तुलना में 2,400 × छ अधिक से अधिक बलों के साथ तटरक्षक की स्थिति के बीच अलग नहीं किया था (डेटा) नहीं दिखाया। SOX9 mRNA की अभिव्यक्ति तटरक्षक उत्तेजना के 15 मिनट के बाद बढ़ाने के लिए शुरू किया, और यह 30 मिनट (चित्रा 4 ए) के बाद संतृप्त किया गया था। अगले, यह निर्धारित करने के लिए कितनी देर तक तटरक्षक प्रेरित Sox9 overexpression बनाए रखा जा सकता है, हमने संकेत समय बिंदुओं पर तटरक्षक उत्तेजित ASCs काटा और Sox9 की अभिव्यक्ति पर नजर रखी। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 4 बी, Sox9 प्रोटीन की अभिव्यक्ति जब तक 3 घंटे तटरक्षक उत्तेजना के बाद वृद्धि हुई है और कम से कम 12 घंटे के लिए उस स्तर पर बने रहे।
चित्रा 1. केन्द्रापसारक गुरुत्वाकर्षण वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं में chondrogenic भेदभाव मार्कर की अपरेगुलेशन लाती है। ए) के रूप में निर्धारित करने के लिएuitable केन्द्रापसारक गुरुत्वाकर्षण बल, ASCs 15 मिनट के लिए अलग तटरक्षक (0, 300, 600, 1200, और 2400 XG) पर centrifuged थे। SOX9 mRNA अभिव्यक्ति 24 घंटे के तटरक्षक उत्तेजना के बाद में मूल्यांकन किया गया था। बी) उपास्थिजनन से संबंधित जीन की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए, कुल शाही सेना ASCs कि centrifuged किया गया था, TGF-β1 के साथ इलाज से unstimulated (नियंत्रण निकाला गया था (10 एनजी / एमएल), या)। आरएनए प्रतिलेखन रिवर्स करने के लिए सीडीएनए, जो तब आरटी पीसीआर से परिलक्षित किया गया था synthesize के अधीन था। सभी प्रयोगों में कम से कम तीन बार प्रदर्शन किया गया। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते। ** पी <नियंत्रण (गैर उत्तेजित ASCs) बनाम तटरक्षक के साथ प्रेरित ASCs के लिए 0.01।
चित्रा 2. केन्द्रापसारक गुरुत्वाकर्षण वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं की गोली संस्कृतियों में एक उपास्थिजनन से संबंधित बाह्य मैट्रिक्स लाती है। ए) proteoglycan मैट्रिक्स प्रारूपतटरक्षक लोडिंग द्वारा आयन। बी) कोलेजन प्रकार 2. तटरक्षक लोडिंग के लिए तटरक्षक प्रेरित overexpression, ASCs 15 मिनट के लिए 2,400 × छ centrifuged थे। उपास्थिजनन से संबंधित ईसीएम की overexpression अंडाकार आकृति सैफरैनीन हे और Alcian नीले धुंधला के उपयोग के माध्यम से centrifuged ASCs से मिलकर छर्रों में मूल्यांकन किया गया था। (: 594 एनएम, DAPI: 340 एनएम Rhod) कोलेजन टाइप 2 की overexpression कोलेजन टाइप 2 के खिलाफ एक एंटीबॉडी और एक एलेक्सा स्त्राव 594 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग immunofluorescence द्वारा पुष्टि की गई। उपास्थिजनन से संबंधित ईसीएम overexpression पर तटरक्षक के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, ASCs TGF-β1 (10 एनजी / एमएल) एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में साथ इलाज किया गया। नकारात्मक नियंत्रण तटरक्षक लोड हो रहा है या TGF-β1 उपचार के अधीन नहीं एक गोली संस्कृति था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
![चित्र तीन]("/files/ftp_upload/54934/54934fig3.jpg")
चित्रा 3. Chondrogenic कुल गठन वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं की Micromass संस्कृतियों में केन्द्रापसारक गुरुत्वाकर्षण से प्रेरित है। Chondrogenic भेदभाव प्रेरित करने के लिए, ASCs (2.5 × 10 5) 2,400 × छ पर या TGF-β1 (10 एनजी / एमएल) के साथ इलाज के द्वारा centrifugation द्वारा प्रेरित किया गया। Unstimulated ASCs नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। Micromasses फार्म के लिए, कोशिकाओं (2.5 × 10 5/10 μL) एक 24 अच्छी तरह से थाली में कुओं के केंद्र में रखा गया था। साथ इलाज ASCs के लिए नियंत्रण के लिए ऊष्मायन, ताजा मध्यम सीडीएम के 2 एच और ASCs और सीडीएम TGF-β1 युक्त centrifuged (10 एनजी / एमएल) के बाद कुओं के लिए TGF-β1-गया था जोड़ा, और नमूने 14 दिनों के लिए incubated रहे थे। उपास्थिकोशिका संक्षेपण समुच्चय के आकार के द्वारा मूल्यांकन किया गया था।
चित्रा 4. SOX9 upreg हैवसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं में केन्द्रापसारक गंभीरता से संचित। ए) समय की विभिन्न अंतरालों के लिए तटरक्षक उत्तेजना से SOX9 mRNA की अपरेगुलेशन। बी) के अलग अलग समय बिंदुओं पर तटरक्षक उत्तेजित ASCs में Sox9 प्रोटीन अभिव्यक्ति। ASCs 24 घंटे के तटरक्षक लदान के बाद के लिए एक monolayer के रूप में विकसित करने के लिए अनुमति दी गई। mRNA अपरेगुलेशन और Sox9 के प्रोटीन अभिव्यक्ति, आरटी पीसीआर और पश्चिमी सोख्ता द्वारा पुष्टि की गई क्रमशः।
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Discussion
कोशिकाओं के stemness राज्य SOX9 के तटरक्षक प्रेरित overexpression के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। हमारे अध्ययन में, SOX9 अभिव्यक्ति जल्दी पारित होने ASCs (2-3) में तटरक्षक द्वारा प्रेरित किया जा सकता है, लेकिन बाद में पारित होने के ASCs में नहीं है। यह बताया गया है कि, खेती के दौरान, ASCs 3 अंश 16 तक CD34 + कोशिकाओं होते हैं। ASCs CD34 की अभिव्यक्ति के रूप में कम करने के लिए कोशिकाओं, passaged हैं तटरक्षक के लिए एक कम प्रतिक्रिया में जिसके परिणामस्वरूप करते हैं।
केन्द्रापसारक गुरुत्वाकर्षण बल के साथ, हीड्रास्टाटिक दबाव तटरक्षक उत्तेजना के दौरान कोशिकाओं पर लोड किया जा सकता है। इसलिए, मध्यम की मात्रा कारक है कि SOX9 की प्रेरण को प्रभावित में से एक हो सकता है। एक प्रयोग के लिए एक भी हीड्रास्टाटिक दबाव के माहौल बनाए रखने के लिए माध्यम के 1 एमएल 15 एमएल ट्यूब में प्रति 1 × 10 5 कोशिकाओं का इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, एक स्विंग बाल्टी रोटर समान रूप से (एक सही कोण बनाने के द्वारा) कोशिकाओं को तटरक्षक लागू करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।
TGF-β1 की तुलना में, तटरक्षक के लिए एक कम क्षमता से पता चलाASCs में SOX9 और chondrogenic मार्कर अभिव्यक्ति प्रेरित। यह इस तकनीक की एक सीमा हो सकती है। एक नैदानिक आवेदन के लिए, यह आगे की जांच की जानी चाहिए तटरक्षक उत्तेजित ASCs एक विवो मॉडल में सामान्य कार्य के स्तर तक बिगड़ा उपास्थि पुनर्जन्म है।
वृद्धि कारक है, विशेष रूप से TGF-β1 के साथ इन विट्रो संस्कृति में, स्टेम कोशिकाओं को 17 साल की chondrogenic भेदभाव प्रेरित करने के लिए सबसे प्रभावी तरीका है। इस विधि सेल संवर्धन और chondrogenic भेदभाव शामिल करने के लिए उपयोगी होने के लिए जाना जाता है। हालांकि, जल्दी वार्धक्य और अप्रत्याशित वंश भेदभाव अक्सर इन विट्रो संस्कृति 18, 19 के दौरान हो। अधिक गंभीर विट्रो संस्कृतियों में से प्रदूषण का उच्च जोखिम है। दूसरी ओर, हमारे विधि में वृद्धि कारकों के साथ इन विट्रो chondrogenic भेदभाव में की आवश्यकता नहीं है। स्टेम कोशिकाओं को एक देहात में प्रत्यारोपित किया जा सकता हैtient तुरंत अलगाव और निम्नलिखित centrifugation, जो एक कम प्रदूषण को जोखिम और एक छोटा प्रसंस्करण समय की गारंटी कर सकते हैं के बाद। स्टेम कोशिकाओं के आसपास microenvironment chondrogenic भेदभाव शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है। अप्रत्याशित वंश भेदभाव विट्रो वातावरण में एक अनुचित से हो सकता है। के रूप में, हमारे विधि में उल्लेख किया है क्योंकि centrifuged स्टेम कोशिकाओं को एक अतिरिक्त भेदभाव प्रक्रिया के बिना एक मरीज (chondrogenic भेदभाव के लिए उचित वातावरण) की उपास्थि में प्रत्यारोपित किया जा सकता है, अप्रत्याशित वंश भेदभाव कम किया जा सकता है।
यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल ASCs के chondrogenic भेदभाव प्रेरित करने के लिए तटरक्षक का उपयोग करता है प्रस्तुत करते हैं। हमारे परिणाम है कि तटरक्षक Sox9 अपरेगुलेशन और ASCs में chondrogenic भेदभाव phenotypes, COL2A1 overexpression, और अधिक व्यापक ईसीएम बयान, और chondrogenic कुल गठन सहित लाती दिखा। हमारे परिणामों के आधार पर, ASCs तटरक्षक से अवगत कराया वीं के लिए एक अच्छा विकल्प हैंई MSCs TGF-β1 के साथ इलाज किया है और इसलिए उपास्थि उत्थान के लिए प्रत्यारोपण में इस्तेमाल किया जा सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 60 mm Dish | TPP | 93060 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| ASC Culture Media Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM Low glucose | Life Technologies | 11885-084 | growth base media |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
| DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | chondrogenic differentiation base media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D2915 | 100 nM |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | 50 μg/mL |
| L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50 μg/mL |
| ITS | BD | 354352 | 1% |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL |
| Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Human adipose-derived stem cells (ASCs) | Catholic MASTER Cells | ||
References
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