Introduction
Defekter i ledbrosk inte läka naturligt. Följaktligen stamcellstransplantation har föreslagits som en lovande metod för reparation av försämrad brosk. Detta kräver dock att metoden både förvärv av ett tillräckligt antal stamceller och induktion av dessa celler att genomgå kondrogen differentiering. Benmärg (BM) har använts i stor utsträckning som en källa till stamceller, men cellisolering från BM har två stora nackdelar: invasivitet och otillräcklig avkastning. På grund av dess lätthet att förvärvet är fettvävnad en föredragen källa för stamceller. Tidigare studier visat att det är möjligt att isolera stamceller från fettvävnad och inducera kondrogen differentiering i dessa celler med användning av cytokiner, såsom TGF-β1 1, 2. Dessa metoder är effektiva men dyra.
Som en lägre kostnad alternativ till cytokiner, kan mekanisk påfrestning användas för attinducera kondrogen differentiering. Mekanisk belastning spelar en avgörande roll för att bevara hälsan hos ledbrosk 3, och det kan inducera kondrogena fenotyper i olika celler. Till exempel inducerar hydrostatiska trycket kondrogena fenotyper i synovium-härledda progenitorceller via MAP-kinas / JNK-vägen 4, och mekanisk kompression inducerar kondrogenes i humana mesenkymala stamceller (MSC) genom uppreglering chondrocytic gener 5. Dessutom bidrar skjuvspänning till uttrycket av kondrogenes relaterade extracellulära matrisen (ECM) i mänskliga MSC 6. Centrifugal punkten (CG), en lätt appliceras och kontrollerad mekanisk påkänning som alstras av centrifugering, kan inducera differentiell genexpression i celler 7. Till exempel i lung epiteliala karcinomceller, är uttrycket av interleukin (IL) -1b uppregleras genom centrifugering 8. Thärför, såsom en experimentellt inducerbar mekanisk påfrestning, CG kan användas för att inducera chondrocytic genuttryck i stamceller. Det är dock fortfarande oklart om CG kan inducera den kondrogena differentieringen av stamceller.
I denna studie fann vi att CG inducerade uppregleringen av SOX9, en master regulator av kondrogenes, i humana DSKer, vilket resulterar i överuttryck av chondrocytic gener. Dessutom, jämfört vi effekterna av CG på kondrogenes med de av TGF-β1, tillväxtfaktor som oftast används för att inducera in vitro kondrogenes i stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studieprotokoll godkändes av Institutional Review Board av det katolska universitetet i Korea (KC16EAME0162) och utfördes enligt NIH riktlinjer. Alla vävnader erhölls med skriftligt informerat samtycke.
1. Radial Gravity Lastning och Pellet kultur
- Cellodling och skörd
- Odlings DSKer (P2-P3; se lista över material) i Dulbeccos modifierade Eagles medium-låg glukos (DMEM-LG) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin (P / S) vid 37 ° C i en fuktad inkubator innehållande 5% CO2.
- När cellerna når 80% konfluens, kassera mediet och tvätta cellerna med 5 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Tillsätt 1 ml av PBS innehållande 1 mM EDTA och inkubera i 2 min vid 37 ° C i en fuktad inkubator innehållande 5% CO2.
- Tryck på odlingsplattan försiktigt, tillsätt 4 ml färskt medium, överföra celler tillen 15-ml koniska rör och centrifugera cellerna vid 250 x g under 2 min vid rumstemperatur (RT).
- Centrifugal gravitation loading
- Efter centrifugering (steg 1.1.4), avlägsna supernatanten utan att störa pelleten och suspendera pelleten i 10 ml DMEM-LG med 10% FBS. Räkna cellerna med användning av en hemocytometer.
- För CG lastning, överföra 2,5 x 10 5 celler i ett annat 15-ml koniska rör och centrifugera vid 2400 x g under 15 min.
- pelletkultur
- Omedelbart efter centrifugeringen, aspirera supernatanten och tillsätt 500 mikroliter av definierade kondrogena differentieringsmedium (CDM, hög-glukos DMEM kompletterat med 1% FBS, 1% ITS + Premix, 100 nM dexametason, 1x MEM icke-essentiell aminosyralösning, 50 mikrogram / ml L-prolin, och 1% penicillin / streptomycin). Tillsätt 50 | ig / ml av nyberedd L-askorbinsyra 2-fosfat vid varje byte av medium. Som en positiv kontroll, framkalla kondrogena differentiatipå i uncentrifuged celler genom att lägga till CDM innehållande 10 ng / ml TGF-β1.
- Placera de löst förslutna rör innehållande pelletsen i en stående position och inkubera vid 37 ° C i en fuktad inkubator innehållande 5% CO2.
- Ändra mediet varannan dag i 3 veckor.
- Micromass kultur
- Omedelbart efter centrifugering (steg 1.2.2, 2400 x g under 15 minuter), aspirera supernatanten och suspendera pelleten i 10 mikroliter av CDM.
- För att bilda en mikromass, placera de återsuspenderade cellerna i centrum av en brunn i en 24-brunnars platta.
- Efter 2 timmar, tillsätt försiktigt 1 ml CDM till brunnen, pipettering mot väggen av plattan för att undvika att störa mikromass. Som en positiv kontroll, utför en Micro kultur med uncentrifuged celler genom att tillsätta CDM innehållande 10 ng / ml TGF-β1.
- Inkubera mikromass vid 37 ° C i en fuktad inkubator innehållande 5% CO2.
- Ändra mediet every annan dag i 3 veckor.
2. Omvänt transkriptas-polymeraskedjereaktion (RT-PCR) för att detektera Transkriptionell Uppreglering av kondrogen differentieringsmarkörer
- På dag 14, använd en pipett för att överföra sfäroida pellets till en ny 1,5 ml rör och tvätta dem i 1x PBS.
- Extrahera totalt RNA från pelletsen med användning av guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform-extraktion metod 9.
- Syntetisera cDNA från 2 | ig av totalt RNA med användning av omvänt transkriptas enligt tillverkarens protokoll (inkubera vid 42 ° C under 1 h och därefter inaktivera enzymet vid 70 ° C under 5 min).
- Utför PCR med primers specifika för kondrogena differentieringsmarkörer 10.
3. Färgning att upptäcka överuttryck av kondrogen differentieringsmarkör Proteiner
- Paraffin inbäddning cellpelletar
- På dag 21,Använd en pipett för att skörda sfäroida pellets och tvätta dem med 1x PBS.
- Fäst sfäroida pellets genom nedsänkning i 4% paraformaldehyd under 24 timmar.
Varning: Paraformaldehyd är mycket giftigt. Undvik kontakt med ögon, hud eller slemhinnor. Minimera exponeringen och undvika inandning under beredning. Bär lämplig personlig skyddsutrustning. - Kassera fixativ och skölj cellpelletarna med avjoniserat vatten (DW).
- Placera ett lager av gasväv på kassetten och överföra de fasta pellets med hjälp av en pipett. Täck pelleten genom att vika gasväv och stäng kassettluckan.
- Dehydratisera pelletsen.
- Doppa pellets i 70% etanol (EtOH) under 5 min vid RT.
- Doppa pellets i 80% EtOH under 5 min vid RT.
- Doppa pellets i 95% EtOH under 5 min vid RT.
- Doppa pellets i 100% EtOH under 5 min vid RT. Upprepa två gånger.
- Doppa pellets i 100% xylen under 15 min vid RT. Upprepa twice.
- Bädda in de fasta cellpelletar i paraffin vid 56 ° C i en form; pelletsen kan bäddas in i paraffin med hjälp av specialiserade automatiserade vävnadsbehandlingssystem.
- Klipp 5 um tjocka sektioner från paraffininbäddade cellpelleten med en roterande mikrotom.
- Flyta sektionerna i 50% EtOH och sedan överföra dem till en 50 ° C vattenbad med användning av en bild.
- Placera flytande sektionerna på objektglas.
- Safranin O och Alcian blue-färgning
- Rehydrera paraffinsnitt.
- Sänk ned objektglasen i xylen i 15 min. Upprepa två gånger.
- Sänk ned objektglasen i 100% EtOH under 5 min. Upprepa två gånger.
- Sänk ned objektglasen i 90% EtOH under 5 min.
- Sänk ned objektglasen i 80% EtOH under 5 min.
- Sänk ned objektglasen i 70% EtOH under 5 min, och sedan tvätta dem i 1 x PBS.
- Färga rehydrerade sektionerna med 1% Safranin O-lösning och 3% Alcian blue för30 minuter.
- Kasta färglösningen och skölj sektionerna med DW.
- Färga sektioner med Hematoxylin / eosin-lösning (kontrast) under 1 minut.
- Kasta färglösningen och skölj sektionerna med DW.
- Placera en droppe monteringsmedium på en täck efter avlägsnande av eventuellt kvarvarande vatten. Placera försiktigt bild (cellsidan nedåt) på täck innehåller monteringsmedium.
- Låt bilderna torka 2-3 timmar vid RT.
- Fånga bilder med hjälp av en ljusfältsmikroskop (automatisk upprätt mikroskop, 50X och 200X).
- Rehydrera paraffinsnitt.
- immunofluorescensanalys
- Rehydrera sektioner som beskrivs i avsnitt 3.2.1.
- Sänk ned objektglasen i natriumcitratbuffert (10 mM natriumcitrat, 0,05% Tween 20, pH 6,0), och sedan bibehålla dem vid en sub-koktemperatur i 10 min med användning av en mikrovågsugn.
- Svalna objektglasen under 20 min vid RT och sedan tvätta dem med kranvatten.
- Inkubera glasen i 3%H2O 2 (i 1x PBS) under 15 min, och sedan tvätta dem med kranvatten under 15 min 11.
- Blockera objektglasen med blockeringsbuffert (10% normalt getserum i PBS) under 1 h.
- Aspirera blockerande lösningen, och sedan använda en primär antikropp utspädd med 5% normalt getserum på bilderna.
- Inkubera objektglasen över natt vid 4 ° C.
- Tvätta bilderna tre gånger i 1 x PBS under 5 min vardera.
- Inkubera objektglasen i fluorokrom-konjugerad sekundär antikropp utspädd med 5% normalt getserum under 1 h vid RT i mörker.
- Tvätta bilderna tre gånger i 1 x PBS under 5 min vardera i mörker.
- Inkubera objektglasen med DAPI (1 | ig / ml) under 10 min, och sedan tvätta dem två gånger i 1 x PBS under 5 min vardera.
- Placera en droppe monteringsmedium på en täck efter avlägsnande av eventuellt kvarvarande vatten. Placera försiktigt bild (cellsidan nedåt) på monteringsmedium.
- Låt bilderna torka i 2-3h i mörker vid RT.
- Visualisera bilderna med hjälp av fluorescensmikroskopi (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; 60X och 200X förstoring) 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Centrifugal allvar inducerar överuttryck av kondrogena differentieringsmarkörer i fett-härledda stamceller.
Att bestämma graden av centrifugal tyngdkraften som är lämplig för att inducera kondrogen differentiering, var ASC: er stimulerades med olika grader av CG (0, 300, 600, 1200, och 2400 x g) under 15 min. Efter stimulering, de ASC: er var åter ympas på odlingsplattor och odlades under 24 h. Som visas i figur 1A, var SOX9 mRNA-uttryck ökade signifikant vid 2400 xg; Det var cirka 1,5 gånger högre vid 2400 xg än i kontroll (DSKer inte laddat med CG). För att bekräfta huruvida CG inducerar kondrogena differentieringen, stimuleras vi DSKer av CG lastning eller TGF-β1 behandling. Som en negativ kontroll, ASC: er odlades utan någon stimulering. Prover skördades på dag 14 och QRT-PCR utfördes. Såsom visas i Figure 1 COL2A1 mRNA, en representant kondrogen differentieringsmarkör var uppreglerad i DSKer stimulerade av CG jämfört med kontrollceller (de ostimulerade DSK). Uppregleringen nivå av COL2A1-mRNA av CG-stimulering var liknande den som induceras av TGF-β1-behandling. Å andra sidan, COL10, en markör av hypertrofa kondrocyter var nedreglerade av CG stimulering. ACAN mRNA, som kodar för en viktig strukturell komponent i ledbrosk, uppreglerades cirka 2-faldigt av CG-stimulering, medan Col1 var inte detekterbart förhöjda i förhållande till kontrollerna. Varken ACAN eller Col1 var uppreglerad i DSKer behandlade med TGF-β1.
Centrifugal gravitationen leder till uttryck av en kondrogenes relaterade extracellulär matrix i pelleten kultur av adipösa-härledda stamceller.
Depositionion av ECM, såsom glykosaminoglykan, är ett kännetecken fenotyp kondrogen differentiering. För att detektera detta material, färgade vi pellet-odlade DSKer med Safranin O och Alcian blue på dag 21. Såsom visas i fig 2A, DSKer stimulerade med CG deponeras mer glykosaminoglykan (röd för Safranin O och blå för Alcian blue) än kontroller, vid en samma nivå som deponerats av DSKer behandlade med TGF-β1. I dessa experiment, positiv färgning indikerade bildningen av en broskmatrix. För ytterligare bekräftelse, övervakas vi uttrycket av COL2A1 protein med användning av PE-konjugerad anti-COL2A1 antikropp. COL2A1 överuttrycktes i DSKer stimulerade med CG i något större utsträckning än i DSKer behandlade med TGF-β1 (Figur 2B).
Kondrogena aggregatbildning induceras av centrifugal allvar i en Microkultur adipösa-härledda stamceller.
13. Därför har vi jämfört kondensation i mikromass mellan kulturer av kontroll DSK och DSKer stimulerade med CG eller TGF-β1. Såsom visas i figur 3, var större och tätare aggregeringar av ASC: er (vita-färgad i den streckade kvadratiskt) detekteras i mikromasskulturer gjorda av ASC: er stimulerade med CG eller TGF-β1 än i kontrollkulturer.
SOX9 uppregleras genom centrifugal allvar i fett--härledda stamceller.
Sox9 är en mästare regulator av kondrogena differentieringen 14, 15. För att bestämma huruvida CG inducerar uppreglering av Sox9 i DSK: er, övervakas vi uttrycket av SOX9 mRNA i DSK som utsätts för olika löptider av CG stimulation (2400 x g). SOX9 uttryck undersöktes vid olika grader av CG, men det skilde sig inte signifikant mellan CG förhållanden med krafter större än 2400 x g (data visas ej). Expression av SOX9 mRNA började öka efter 15 min av CG-stimulering, och den var mättad efter 30 min (Figur 4A). Nästa, för att avgöra hur länge CG-inducerad Sox9 uttryck kan upprätthållas, skördade vi CG-stimulerade DSKer vid de angivna tidpunkterna och övervakas uttrycket av Sox9. Som visas i figur 4B, ökat uttryck av Sox9 protein till 3 timmar efter CG stimulans och låg kvar på den nivån under minst 12 timmar.
Figur 1. Radial allvar inducerar uppreglering av kondrogena differentieringsmarkörer i fett-härledda stamceller. A) För att avgöra somuitable centrifugal gravitationskraft, ades DSKer centrifugerades vid olika CG (0, 300, 600, 1200, och 2400 x g) under 15 min. SOX9 mRNA-uttryck utvärderades vid 24 timmar efter CG stimulering. B) För att utvärdera uttrycket av kondrogenes relaterade gener, extraherades totalt RNA från DSKer som hade centrifuge, behandlade med TGF-β1 (10 ng / ml), eller ostimulerade (kontroll). RNA utsattes för omvänd transkription för att syntetisera cDNA, som därefter amplifierades med RT-PCR. Alla experiment utfördes minst tre gånger. Felstaplar representerar standardavvikelsen. ** P <0,01 för DSKer stimulerade med CG vs. kontroll (icke-stimulerade ASC: er).
Figur 2. Radial allvar inducerar en kondrogenes relaterade extracellulära matrix i pellets kulturer av adipos-härledda stamceller. A) proteoglykan matrisformation av CG belastning. B) CG-inducerad överexpression av kollagen typ 2. För CG lastning, ades DSKer centrifugerades vid 2400 x g under 15 min. Överuttryck av kondrogenes relaterad ECM utvärderades i sfäroida pelletar bestående av centrifuge ASC: er genom användning av Safranin O och Alcian blue-färgning. Överuttryck av kollagen typ 2 bekräftades genom immunofluorescens med användning av en antikropp mot kollagen typ 2 och en Alexa Fluor 594-konjugerad sekundär antikropp (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm). För att bestämma effekten av CG på kondrogenes relaterade ECM överuttryck var ASC: er som behandlats med TGF-β1 (10 ng / ml) som en positiv kontroll. Den negativa kontrollen var en pelletkultur inte utsätts för CG lastning eller TGF-β1 behandling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
![Figur 3]("/files/ftp_upload/54934/54934fig3.jpg")
Figur 3. kondrogena aggregatbildning induceras av centrifugal allvar i mikromasskulturer av adipos-härledda stamceller. För att inducera kondrogen differentiering, var ASC: er (2,5 x 10 5) stimulerades genom centrifugering vid 2400 x g eller genom behandling med TGF-β1 (10 ng / ml). Ostimulerade ASC: er användes som kontroller. Att bilda micromasses ades celler (2,5 x 10 5/10 il) placeras i centrum av brunnar i en 24-brunnsplatta. Efter två timmars inkubering, färskt medium-CDM för kontroller och centrifugerades ASCs och CDM innehållande TGF-β1 (10 ng / ml) under DSKer behandlade med TGF-β1-sattes till brunnarna, och proverna inkuberades under 14 dagar. Kondrocyt kondensation utvärderades genom storleken på aggregaten.
Figur 4. SOX9 är upregulated av centrifugal allvar i fett--härledda stamceller. A) uppreglering av SOX9 mRNA av CG stimulans för olika tidsintervall. B) Sox9 proteinuttryck i CG-stimulerade DSKer vid olika tidpunkter. DSK tilläts växa som ett monoskikt under 24 timmar efter CG belastning. mRNA-uppreglering och proteinuttryck av Sox9 bekräftades genom RT-PCR och Western blotting, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den stemness tillstånd av celler är mycket viktigt för CG-inducerad överexpression av SOX9. I vår studie kunde SOX9 expression induceras av CG i tidig-passage DSKer (2-3), men inte i senare-passage ASCs. Det har rapporterats att, under odling, ASC: er innehåller CD34 + celler tills 3 passager 16. ASC: er tenderar att förlora uttrycket av CD34 som cellerna passe, vilket resulterar i ett lågt svar på CG.
Med centrifugal gravitationskraft, kan hydrostatiskt tryck lastas på celler under CG stimulering. Därför kan volymen av mediet vara en av de faktorer som påverkar induktionen av SOX9. Att hålla en jämn hydrostatiskt tryck miljö för varje experiment var 1 ml av medium som används per 1 x 10 5-celler i en 15-ml rör. Dessutom genomfördes en swing-bucket rötor används för att jämnt applicera CG till cellerna (genom att bilda en rät vinkel).
Jämfört med TGF-β1, CG visade en lägre förmåga attinducera SOX9 och kondrogen markör expression i ASC: er. Detta kan vara en begränsning av denna teknik. För en klinisk applikation, bör undersökas närmare huruvida CG-stimulerade DSKer regenerera försämrad brosk upp till nivån för normal funktion i en in vivo-modell.
In vitro-kultur med tillväxtfaktorer, speciellt TGF-β1, är den mest effektiva metoden för att inducera kondrogen differentiering av stamceller 17. Denna metod är känd för att vara användbar för cellberikning och kondrogena differentieringsinduktion. Men inträffa tidigt åldrande och oväntad härstamning differentiering ofta under odling in vitro 18, 19. Allvarligare är den höga risken för kontamination från in vitro-kulturer. Å andra sidan, inte vår metod inte kräver in vitro kondrogena differentieringen med tillväxtfaktorer. Stamceller kan transplanteras in i en patienten omedelbart efter isolering och efter centrifugering, vilket kan garantera en låg föroreningsrisk och en förkortad behandlingstid. Mikromiljön kring stamceller är avgörande för kondrogen differentiering induktion. Oväntad härstamning differentiering kan bero på en felaktig in vitro miljö. Som nämnts i vår metod, eftersom centrifuge stamceller kan transplanteras in i brosk hos en patient (den rätta miljön för kondrogen differentiering) utan ytterligare differentieringsprocess, kan oväntade härstamning differentiering minskas.
Här presenterar vi ett protokoll som använder CG att inducera den kondrogena differentieringen av ASC: er. Våra resultat visar att CG inducerar Sox9 uppreglering och kondrogena differentierings fenotyper i ASC: er, inklusive COL2A1 överuttryck, mera omfattande ECM-inlagring, och kondrogen aggregatbildning. Baserat på våra resultat, DSK utsätts för CG är ett bra substitut för the MSC behandlas med TGF-β1 och kan därför användas i transplantationer för brosk förnyelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 60 mm Dish | TPP | 93060 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| ASC Culture Media Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM Low glucose | Life Technologies | 11885-084 | growth base media |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
| DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | chondrogenic differentiation base media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D2915 | 100 nM |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | 50 μg/mL |
| L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50 μg/mL |
| ITS | BD | 354352 | 1% |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL |
| Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Human adipose-derived stem cells (ASCs) | Catholic MASTER Cells | ||
References
- Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
- Erickson, G. R., et al. Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 290 (2), 763-769 (2002).
- Sah, R. L., et al. Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression. J Orthop Res. 7 (5), 619-636 (1989).
- Sakao, K., et al. Induction of chondrogenic phenotype in synovium-derived progenitor cells by intermittent hydrostatic pressure. Osteoarthritis Cartilage. 16 (7), 805-814 (2008).
- Li, Z., Yao, S. J., Alini, M., Stoddart, M. J. Chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells in fibrin-polyurethane composites is modulated by frequency and amplitude of dynamic compression and shear stress. Tissue Eng Part A. 16 (2), 575-584 (2010).
- Alves da Silva, M. L., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. J Tissue Eng Regen Med. 5 (9), 722-732 (2011).
- Maeda, S., et al. Changes in microstructure and gene expression of articular chondrocytes cultured in a tube under mechanical stress. Osteoarthritis Cartilage. 13 (2), 154-161 (2005).
- Yang, J., Hooper, W. C., Phillips, D. J., Tondella, M. L., Talkington, D. F. Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (5), 1142-1143 (2002).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. (6), (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Jang, Y., et al. UVB induces HIF-1alpha-dependent TSLP expression via the JNK and ERK pathways. J Invest Dermatol. 133 (11), 2601-2608 (2013).
- Wu, Y. L., et al. Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths. J Cell Sci. 119, Pt 13 2797-2806 (2006).
- Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
- Akiyama, H., Chaboissier, M. C., Martin, J. F., Schedl, A., de Crombrugghe, B. The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6. Genes Dev. 16 (21), 2813-2828 (2002).
- Lefebvre, V., Huang, W., Harley, V. R., Goodfellow, P. N., de Crombrugghe, B. SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha1(II) collagen gene. Mol Cell Biol. 17 (4), 2336-2346 (1997).
- Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (2), 142-150 (2015).
- Chen, J., et al. Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds. Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).
- Janzen, V., et al. Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a. Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).
- Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113, Pt 7 1161-1166 (2000).
