Introduction
Дефекты в суставном хряще не заживают естественным образом. Следовательно, трансплантации стволовых клеток была предложена в качестве перспективного подхода для ремонта нарушенного хряща. Тем не менее, этот метод требует как приобретение достаточного количества стволовых клеток и индукции этих клеток к дифференцировке хондрогенное. Костный мозг (ВМ) широко используется в качестве источника стволовых клеток, но изоляция клеток из ВМ имеет два основных недостатка: инвазивность и недостаточная урожайность. Из-за своей легкости приобретения, жировая ткань является предпочтительным источником стволовых клеток. Предыдущие исследования показали возможность выделения стволовых клеток из жировой ткани и вызывая хондрогенное дифференцировки в этих клетках с использованием цитокинов, таких как TGF & beta ; 1-1, 2. Эти методы являются эффективными, но дорогими.
В качестве альтернативы меньшей стоимости на цитокины, механическое напряжение, может быть использован дляиндуцируют хондрогенный дифференциации. Механическая нагрузка играет важную роль в поддержании здоровья суставном хряще 3, и это может вызвать хондрогенное фенотипы в различных клетках. Например, гидростатическое давление вызывает хондрогенное фенотипы в синовиальной оболочке , полученных клеток - предшественников с помощью МАР - киназы / JNK пути 4, и механическое сжатие вызывает хондрогенез в человеческих мезенхимальных стволовых клеток (МСК) с помощью повышающей регуляции генов chondrocytic 5. Кроме того, напряжение сдвига способствует экспрессии хондрогенезе связанных с внеклеточным матриксом (ECM) в человеческих ПКЦ 6. Центробежная сила тяжести (CG), легко наносится и под контролем механического напряжения генерируется путем центрифугирования, может вызывать дифференциальную экспрессию генов в клетках 7. Например, в клетках карциномы эпителия легких, экспрессия интерлейкина (IL) -1B позитивно регулируется с помощью центрифугирования 8. Therefore, как экспериментально индуцибельной механических напряжений, CG может быть использован для индукции chondrocytic экспрессии генов в стволовых клетках. Тем не менее, остается неясным, может ли CG вызвать хондрогенный дифференцировки стволовых клеток.
В этом исследовании мы обнаружили, что CG индуцирует повышающую регуляцию SOX9, мастер-регулятор хондрогенезе, в человеческих ИСС, что приводит к избыточной экспрессии генов chondrocytic. Кроме того, мы сравнили эффекты CG на хондрогенезе с теми TGF- 1, фактор роста наиболее часто используется , чтобы вызвать в пробирке хондрогенез в стволовых клетках.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол исследования был одобрен этическими комитетами католического университета Кореи (KC16EAME0162) и осуществляется в соответствии с руководящими принципами NIH. Все ткани были получены с письменного информированного согласия.
1. Центробежные силы тяжести Загрузка и пеллетах Культура
- Клеточные культуры и урожай
- Культура ИСС (Р2-Р3, см список материалов) в модифицированной среде низкой глюкозы Дульбекко Eagle (DMEM-LG), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина (P / S) при 37 ° C в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO 2.
- Когда клетки достигают 80% сплошности, отбрасывать среды и промыть клетки с 5 мл 1х фосфатно-солевым буферным раствором (PBS).
- Добавить 1 мл PBS , содержащего 1 мМ ЭДТА и инкубировать в течение 2 мин при 37 ° С в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO 2.
- Нажмите на культуральную пластину осторожно, добавить 4 мл свежей среды, передают клеткамконическая трубка 15-мл, и центрифуга клетки при 250 х г в течение 2 мин при комнатной температуре (RT).
- Центробежная сила тяжести нагрузки
- После центрифугирования (этап 1.1.4), удалить супернатант, не нарушая гранул и ресуспендируют осадок в 10 мл DMEM-LG с добавлением 10% FBS. Граф клеток с использованием гемоцитометра.
- Для CG нагрузки, передача 2,5 × 10 5 клеток в новую коническую пробирку и центрифугировать 15 мл при 2400 х г в течение 15 мин.
- Пелле культура
- Сразу же после центрифугирования, аспирация супернатант и добавляют 500 мкл определенной среде хондрогенный дифференцировки (МЧР, DMEM с высоким глюкозы с добавлением 1% FBS, 1% ITS + премикс, 100 нМ дексаметазона, 1x MEM несущественные аминокислотного раствора, 50 мкг / мл L-пролина, и 1% пенициллина / стрептомицина). Добавить 50 мкг / мл свежеприготовленного L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата при каждой смены среды. В качестве положительного контроля, вызывают хондрогенный differentiatiна в uncentrifuged клетках путем добавления МЧР, содержащий 10 нг / мл TGF- 1.
- Поместите неполностью закрываютс крышкой , пробирки , содержащие гранулы в стоячем положении и инкубировать при 37 ° С в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO 2.
- Изменение носителя через день в течение 3-х недель.
- Micromass культура
- Сразу же после центрифугирования (этап 1.2.2; 2400 & bull; g в течение 15 мин), аспирата супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мкл МЧР.
- Чтобы сформировать Micromass, поместите ресуспензированной клетки в центре лунки 24-луночного планшета.
- Через 2 ч, осторожно добавляют 1 мл CDM к колодцу, пипеткой к стенке пластины, чтобы избежать срыве Micromass. В качестве положительного контроля, выполнить Micromass культуру с uncentrifuged клеток путем добавления CDM, содержащий 10 нг / мл TGF- 1.
- Выдержите Micromass при 37 ° С в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO 2.
- Изменение среды эвERy день в течение 3-х недель.
2. обратной транскриптазы-полимеразной цепной реакции (RT-PCR) для обнаружения транскрипционные повышающую регуляцию хондрогенный Дифференциация Маркеры
- На 14-й день, используйте пипетку для переноса сфероидами гранул в новую 1,5-мл пробирку и промойте их в 1x PBS.
- Извлечение общей РНК из гранул с использованием гуанидина тиоцианата-фенол-хлороформ метод 9 экстракции.
- Синтеза кДНК из 2 мкг тотальной РНК с использованием обратной транскриптазы в соответствии с протоколом производителя (инкубировать при 42 ° С в течение 1 ч, а затем инактивации фермента при температуре 70 ° С в течение 5 мин).
- Выполните ПЦР с использованием праймеров , специфичных для хондрогенными маркеров дифференцировки 10.
3. Окрашивание для обнаружения сверхэкспрессии хондрогенный Дифференциация маркерных белков
- Парафин-встраивание гранулы клеток
- На 21-й день,использовать пипетку для сбора сфероидами гранул и мыть их с 1x PBS.
- Закрепить сфероидами гранул путем погружения в 4% параформальдегида в течение 24 ч.
Внимание: параформальдегид очень токсичен. Избегать попадания в глаза, на кожу или слизистые оболочки. Сведение к минимуму воздействия и избегать вдыхания во время приготовления. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты. - Выбросьте закрепитель и промыть гранулы клеток деионизированной водой (DW).
- Поместите один слой марли на кассету и передавать неподвижные гранулы с помощью пипетки. Покрытие гранул путем складывания марлю и закройте крышку кассеты.
- Высушить гранул.
- Погружают гранулы в 70% этаноле (EtOH) в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Погружают гранул в 80% этанола в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Погружают гранул в 95% этанола в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Погружают гранул в 100% EtOH в течение 5 мин при комнатной температуре. Повторите дважды.
- Погружают гранул в 100% ксилола в течение 15 мин при комнатной температуре. Повторить Twiсе.
- Встраивание фиксированных гранул клеток в парафин при температуре 56 ° С в пресс-форме; гранулы могут быть встроены в парафин с использованием специализированных систем автоматизированной обработки тканей.
- Вырезать 5 мкм срезы толщиной от залитой в парафин клеточного осадка с помощью роторного микротома.
- Поплавок секции в 50% этанола, а затем передавать их на водяной бане при 50 ° C с использованием слайд.
- Поместите плавающие разделы на слайдах.
- Safranin O и Альциановый голубое окрашивание
- Увлажняет секции парафина.
- Погрузите слайды в ксилоле в течение 15 мин. Повторите дважды.
- Погрузитесь слайдов в 100% EtOH в течение 5 мин. Повторите дважды.
- Погрузитесь слайдов в 90% этанола в течение 5 мин.
- Погрузитесь слайдов в 80% этанола в течение 5 мин.
- Погрузитесь слайдов в 70% этанола в течение 5 минут, а затем промойте их в 1x PBS.
- Пятно регидрировали секций с 1% -ным раствором Safranin O и 3% Альциановый синий для30 минут.
- Выбросьте окрашивание раствора и промойте участки с DW.
- Пятно секции с раствором гематоксилин / эозином (контрастное) в течение 1 мин.
- Выбросьте окрашивание раствора и промойте участки с DW.
- Поместите каплю монтажа среды на покровным после удаления остаточной воды. Осторожно поместите слайд (ячейка стороной вниз) на покровное содержащей монтажную среду.
- Разрешить слайды высохнуть в течение 2-3 ч при комнатной температуре.
- Захват изображений с использованием светлого поля микроскопа (автоматизированный прямой микроскоп, 50X и 200X).
- Увлажняет секции парафина.
- иммунофлюоресценции
- Увлажняет секции, как описано в разделе 3.2.1.
- Погрузитесь слайдов в цитрат натрия буфера (10 мМ цитрат натрия, 0,05% Tween 20, рН 6,0), а затем поддерживать их при температуре к югу от кипячения в течение 10 минут с использованием микроволновой печи.
- Охладить слайды в течение 20 мин при комнатной температуре, а затем промойте их с водопроводной водой.
- Инкубируйте слайды в 3%H 2 O 2 (в 1X PBS) в течение 15 мин, а затем промыть их проточной водой в течение 15 мин 11.
- Блок слайды с блокирующим буфером (10% нормальной козьей сыворотки в PBS) в течение 1 ч.
- Аспирируйте блокирующий раствор, а затем применить первичное антитело, разбавленное с 5% нормальной козьей сыворотки на слайдах.
- Инкубируйте слайды в течение ночи при температуре 4 ° С.
- Вымойте слайды три раза в 1x PBS в течение 5 минут каждый.
- Инкубируйте слайдов в флюорохром-конъюгированные вторичного антитела, разбавленного 5% нормальной козьей сывороткой в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
- Вымойте слайды три раза в 1x PBS в течение 5 минут каждый в темноте.
- Инкубируйте слайдов с использованием DAPI (1 мкг / мл) в течение 10 мин, а затем промыть их два раза в 1X PBS в течение 5 мин каждый.
- Поместите каплю монтажа среды на покровным после удаления остаточной воды. Осторожно поместите слайд (ячейка стороной вниз) на монтажной среде.
- Разрешить слайды высохнуть в течение 2-3ч в темноте при комнатной температуре.
- Визуализируйте слайды с помощью флуоресцентной микроскопии (Rhod: 594 нм, DAPI: 340 нм; 60X и 200X увеличение) 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Центробежная сила тяжести вызывает избыточную экспрессию хондрогенными маркеров дифференцировки в жировой ткани стволовых клеток.
Для того, чтобы определить степень центробежной силы тяжести, которая является подходящей для индукции дифференцировки хондрогенное, ИСС стимулировали различными степенями CG (0, 300, 600, 1200 и 2400 XG) в течение 15 мин. После стимуляции ИСС были повторно высевают на культуральные планшеты и культивировали в течение 24 ч. Как показано на рисунке 1А, экспрессия мРНК SOX9 была значительно увеличена при 2,400 мкг; это было примерно в 1,5 раза выше, при 2,400 XG, чем в контроле (ИСС не загружен CG). Для того, чтобы подтвердить, индуцирует ли CG хондрогенный дифференциацию, мы стимулировали ИСС от CG нагрузки или обработкой TGF- 1. В качестве отрицательного контроля, ИСС культивировали без какого-либо раздражения. Образцы собирали на 14-й день и QRT-ПЦР проводили. Как показано на Figure 1, COL2A1 мРНК, представитель хондрогенный маркера дифференцировки, был в ИСС усиливает свою активность , стимулированных CG по сравнению с контрольными клетками (нестимулированных ИСС). Уровень повышающей регуляции мРНК COL2A1 путем стимуляции CG был таким же, индуцированное обработкой TGF- 1. С другой стороны, COL10, маркер гипертрофированных хондроцитов, была подавлена с помощью стимуляции CG. ACAN мРНК, которая кодирует основную структурную составляющую суставного хряща, был повышающей регуляции примерно в 2 раза по стимуляции CG, в то время как COL1 не был обнаруживаемым повышенным по сравнению с контролем. Ни ACAN , ни COL1 не были в ИСС усиливает свою активность , обработанных TGF- 1.
Центробежная сила тяжести индуцирует экспрессию хондрогенезе связанных с внеклеточным матриксом в осадке культуры полученных из жировой ткани стволовые клетки.
депозитион ЕСМ, такие как гликозаминогликанов, является отличительным признаком фенотип хондрогенной дифференциации. Для того, чтобы обнаружить этот материал, мы окрашивали гранул культивируемые ИСС с сафранином O и Альциановый синего цвета на день 21. Как показано на рисунке 2А, ИСС , стимулированных CG осаждается больше гликозаминогликаны (красный для сафранином O и синий для Альциановый синий) по сравнению с контрольными при а уровень же, сданный на хранение ИСС обработанных TGF- 1. В этих экспериментах положительное окрашивание указывает на образование матрицы хрящей. Для дальнейшего подтверждения, мы контролировали экспрессию COL2A1 белка с помощью PE-конъюгированные анти-Col2a1 антитела. COL2A1 был избыточно экспрессируется в ИСС , стимулированных CG в несколько большей степени , чем в ИСС , обработанных TGF- 1 (рис 2В).
Хондрогенное образование агрегатов индуцируется под действием центробежной силы тяжести в Micromass культуры полученных из жировой ткани стволовые клетки.
13. Таким образом, мы сравнили конденсацию в Micromass между культурами управления ИСС и ИСС, стимулированных CG или TGF- 1. Как показано на рисунке 3, более крупные и более плотные скопления ИСС (белого цвета в точечном квадрате) были обнаружены в Micromass культурах из ИСС , стимулированных CG или TGF- 1 , чем в контрольных культурах.
SOX9 активируется под действием центробежной силы тяжести в жировой ткани стволовые клетки.
Sox9 является мастером регулятором хондрогенной дифференцировки 14, 15. Для того, чтобы определить , индуцирует ли CG на повышающую регуляцию Sox9 в ИСС, мы контролировали экспрессию мРНК Sox9 в ИСС , подвергшихся воздействию различных длительностей CG Stimulaции (2400 × г). Выражение SOX9 было исследовано при различных степенях CG, но это существенно не отличались среди условий CG с силами больше , чем 2400 × г (данные не показаны). Экспрессия мРНК Sox9 стали увеличиваться после 15 мин стимуляции CG, и он был пропитан через 30 мин (фиг.4А). Далее, чтобы определить, как долго CG-индуцированной Sox9 избыточная экспрессия может быть сохранена, мы собрали CG-стимулированной ИСС в указанных временных точках и контролировать экспрессию Sox9. Как показано на рисунке 4B, экспрессия белка Sox9 увеличивалось до 3 ч после стимуляции CG и оставалась на этом уровне в течение по крайней мере 12 часов.
Рисунок 1. Центробежная сила тяжести вызывает положительную регуляцию хондрогенными маркеров дифференцировки в жировой ткани стволовых клеток. A) Чтобы определить , какuitable центробежная сила тяжести, ИСС центрифугировали при различных CG (0, 300, 600, 1200 и 2400 мкг) в течение 15 мин. экспрессии Sox9 мРНК оценивали через 24 ч после стимуляции CG. Б) Для того, чтобы оценить экспрессию генов хондрогенезе связанных, Суммарную РНК экстрагировали из ИСС , которые были центрифугированных, обрабатывали TGF- 1 (10 нг / мл), или нестимулированных (контроли). РНК подвергали обратной транскрипции с целью синтеза кДНК, которую затем амплифицировали при помощи RT-PCR. Все эксперименты проводились по крайней мере, три раза. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение. ** Р <0,01 для ИСС, стимулированных CG по сравнению с контролем (нестимулированных ИСС).
Рисунок 2. Центробежный сила тяжести индуцирует хондрогенезе связанных с внеклеточным матриксом в виде гранул культур полученные из жировой ткани стволовые клетки. A) Протеогликан матрица форматаионов с помощью CG нагрузки. Б) CG-индуцированной избыточная экспрессия коллагена типа 2. Для CG нагрузки, ИСС центрифугировали при 2400 х г в течение 15 мин. Сверхэкспрессия хондрогенезе связанной с ЕСМ оценивали в сфероидальных гранул, состоящих из центрифугированных ИСС за счет использования сафранином O и Альциановый синего окрашивания. Избыточная экспрессия коллагена типа 2 была подтверждена с помощью иммунофлуоресценции с использованием антитела против коллагена типа 2 и Alexa Fluor 594-конъюгированные вторичные антитела (Rhod: 594 нм, DAPI: 340 нм). Для определения влияния ХГ на хондрогенезе, связанных с ECM сверхэкспрессии, ИСС обрабатывали TGF- 1 (10 нг / мл) в качестве положительного контроля. Отрицательный контроль был культура осадок не подвергается CG погрузки или обработки TGF- 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
![Рисунок 3]("/files/ftp_upload/54934/54934fig3.jpg")
Рисунок 3. хондрогенное образование агрегатов индуцируется под действием центробежной силы тяжести в Micromass культурах полученные из жировой ткани стволовые клетки. Для индукции дифференцировки хондрогенное, ИСС (2,5 × 10 5) стимулировали центрифугированием при 2400 х г или обработкой TGF- 1 (10 нг / мл). Нестимулированные ИСС использовали в качестве контролей. Для формирования micromasses, клетки (2,5 × 10 5/10 мкл) помещали в центр лунки в 24-луночный планшет. Через 2 ч инкубации свежей средой-CDM для средств управления и центрифугируют ИСС и МЧР, содержащих TGF-бета 1 (10 нг / мл) в течение ИСС, обработанных TGF- 1-добавляли в лунки, и образцы инкубировали в течение 14 дней. Хондроцитов конденсации оценивали по размеру агрегатов.
Рисунок 4. SOX9 является upregнерегулируемом под действием центробежной силы тяжести в жировой ткани стволовые клетки. А) Положительная регуляция мРНК Sox9 путем стимуляции CG для различных интервалов времени. Б) экспрессии Sox9 белка в CG-стимулированных ИСС в различные моменты времени. ИСС позволяли расти в виде монослоя в течение 24 ч после CG нагрузки. мРНК повышающая регуляция и экспрессия белка Sox9 были подтверждены с помощью ОТ-ПЦР и Вестерн-блоттинга, соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Стволовости состояние клеток является очень важным для CG-индуцированной избыточной экспрессии SOX9. В нашем исследовании, экспрессия SOX9 может быть вызвано CG в начале пассажей ИСС (2-3), но не позже пассажей ИСС. Сообщалось , что, во время культивирования, ИСС не содержат CD34 + клеток до 3 -х проходов 16. ИСС, как правило, теряют экспрессию CD34, так как клетки пассируют, что приводит к низкой эффективности лечения CG.
С помощью центробежной силы тяжести, гидростатическое давление может быть загружен на клетки во время стимуляции CG. Таким образом, объем среды может быть одним из факторов, влияющих на индукцию SOX9. Для поддержания даже гидростатического давления окружающей среды для каждого эксперимента, 1 мл среды используют на 1 × 10 5 клеток в пробирку объемом 15 мл. Кроме того, свинг-роторе использовался равномерно наносить CG к клеткам (путем формирования под прямым углом).
По сравнению с TGF- 1, CG показали более низкую способностьиндуцируют Sox9 и хондрогенный экспрессию маркера в ИСС. Это может быть недостатком этой методики. Для клинического применения, то следует дополнительно проверить , действительно ли CG-стимулированные ИСС регенерировать поврежденную хрящевую ткань до уровня нормальной функции в модели в естественных условиях.
В пробирке культуре с факторами роста, особенно TGF- 1, является наиболее эффективным методом индукции хондрогенное дифференцировки стволовых клеток 17. Этот метод, как известно, полезны для обогащения клеток и индукции дифференцировки хондрогенной. Однако раннее старение и неожиданная дифференциация родословная часто происходят во время культивирования в пробирке 18, 19. Более серьезным является высокий риск заражения от культур в пробирке. С другой стороны, наш метод не требует экстракорпоральное хондрогенной дифференцировки с факторами роста. Стволовые клетки можно трансплантировать в раtient сразу после выделения и следующего центрифугирования, что может гарантировать низкий риск загрязнения и укороченный время обработки. Микросреда вокруг стволовых клеток имеет решающее значение для хондрогенной индукции дифференцировки. Неожиданный дифференцировка родословная может быть результатом неправильного в лабораторных условиях окружающей среды. Как уже упоминалось в нашем методе, так как стволовые клетки центрифугированных могут быть пересажены в хрящ пациента (надлежащие условия для дифференциации хондрогенной) без дополнительного процесса дифференциации, неожиданная дифференциация родословная может быть уменьшена.
Здесь мы приводим протокол, который использует CG для индукции хондрогенный дифференциации ИСС. Наши результаты показывают, что CG индуцирует Sox9 повышающую регуляцию и хондрогенный дифференциации фенотипа в ИСС, в том числе COL2A1 избыточной экспрессии, более обширного осаждения ECM и хондрогенной образования агрегатов. На основании полученных результатов, ИСС воздействию CG являются хорошей заменой для гое МСК обрабатывали TGF- 1 и, следовательно, могут быть использованы в пересадках для восстановления хрящевой ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 60 mm Dish | TPP | 93060 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| ASC Culture Media Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM Low glucose | Life Technologies | 11885-084 | growth base media |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
| DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | chondrogenic differentiation base media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D2915 | 100 nM |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | 50 μg/mL |
| L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50 μg/mL |
| ITS | BD | 354352 | 1% |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL |
| Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Human adipose-derived stem cells (ASCs) | Catholic MASTER Cells | ||
References
- Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
- Erickson, G. R., et al. Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 290 (2), 763-769 (2002).
- Sah, R. L., et al. Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression. J Orthop Res. 7 (5), 619-636 (1989).
- Sakao, K., et al. Induction of chondrogenic phenotype in synovium-derived progenitor cells by intermittent hydrostatic pressure. Osteoarthritis Cartilage. 16 (7), 805-814 (2008).
- Li, Z., Yao, S. J., Alini, M., Stoddart, M. J. Chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells in fibrin-polyurethane composites is modulated by frequency and amplitude of dynamic compression and shear stress. Tissue Eng Part A. 16 (2), 575-584 (2010).
- Alves da Silva, M. L., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. J Tissue Eng Regen Med. 5 (9), 722-732 (2011).
- Maeda, S., et al. Changes in microstructure and gene expression of articular chondrocytes cultured in a tube under mechanical stress. Osteoarthritis Cartilage. 13 (2), 154-161 (2005).
- Yang, J., Hooper, W. C., Phillips, D. J., Tondella, M. L., Talkington, D. F. Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (5), 1142-1143 (2002).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. (6), (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Jang, Y., et al. UVB induces HIF-1alpha-dependent TSLP expression via the JNK and ERK pathways. J Invest Dermatol. 133 (11), 2601-2608 (2013).
- Wu, Y. L., et al. Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths. J Cell Sci. 119, Pt 13 2797-2806 (2006).
- Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
- Akiyama, H., Chaboissier, M. C., Martin, J. F., Schedl, A., de Crombrugghe, B. The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6. Genes Dev. 16 (21), 2813-2828 (2002).
- Lefebvre, V., Huang, W., Harley, V. R., Goodfellow, P. N., de Crombrugghe, B. SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha1(II) collagen gene. Mol Cell Biol. 17 (4), 2336-2346 (1997).
- Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (2), 142-150 (2015).
- Chen, J., et al. Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds. Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).
- Janzen, V., et al. Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a. Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).
- Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113, Pt 7 1161-1166 (2000).
