Introduction
عيوب في الغضروف المفصلي لا تلتئم بشكل طبيعي. ونتيجة لذلك، وقف وقد اقترح زرع الخلايا كنهج واعدة لإصلاح الغضروف ضعف. ومع ذلك، هذا الأسلوب يتطلب على حد سواء الحصول على عدد كاف من الخلايا الجذعية وتحريض هذه الخلايا على الخضوع التمايز المولدة للغضروف. نخاع العظم (BM) وقد استخدم على نطاق واسع كمصدر للخلايا الجذعية، لكن العزلة خلية من BM اثنين من عيوب رئيسية هي: الغزو وعدم كفاية العائد. بسبب سهولة اقتناء والأنسجة الدهنية مصدرا مفضلا للخلايا الجذعية. وأظهرت دراسات سابقة إمكانية عزل الخلايا الجذعية من الأنسجة الدهنية ويحفز التمايز المولدة للغضروف في هذه الخلايا باستخدام السيتوكينات، مثل TGF-β1 1 و 2. هذه الطرق فعالة لكنها باهظة الثمن.
باعتبارها أقل تكلفة البديل لالسيتوكينات، إجهاد يمكن استخدامها للحث على تمايز المولدة للغضروف. تحميل الميكانيكية يلعب دورا حاسما في الحفاظ على صحة الغضروف المفصلي 3، ويمكن أن تحدث الظواهر المولدة للغضروف في خلايا مختلفة. على سبيل المثال، الضغط الهيدروليكي يدفع الظواهر المولدة للغضروف في الخلايا الاولية المستمدة من الغشاء الزليلي عبر خطة عمل البحر المتوسط كيناز / JNK مسار 4، والضغط الميكانيكي يدفع تكون الغضروف في الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان (اللجان الدائمة) من خلال upregulating الجينات chondrocytic 5. وبالإضافة إلى ذلك، إجهاد القص يساهم في التعبير عن ذات الصلة تكون الغضروف المصفوفة خارج الخلية (ECM) في اللجان الدائمة الإنسان 6. خطورة الطرد المركزي (م)، وإجهاد تطبيقها بسهولة والتحكم التي تم إنشاؤها بواسطة الطرد المركزي، يمكن أن تحفز التعبير الجيني الفرق في الخلايا 7. على سبيل المثال، في خلايا سرطان الرئة الظهارية، وupregulated التعبير عن انترلوكين (IL) -1b بواسطة الطرد المركزي 8. تيherefore، باعتبارها إجهاد محرض تجريبيا، CG يمكن أن تستخدم للحث على التعبير الجيني chondrocytic في الخلايا الجذعية. ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت CG يمكن أن تحفز على تمايز الخلايا الجذعية المولدة للغضروف.
في هذه الدراسة، وجدنا أن CG يسببها upregulation من SOX9، المنظم الرئيسي لتكون الغضروف، في مخولا لصيانة طائرات الإنسان، مما أدى إلى overexpression من الجينات chondrocytic. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا مقارنة آثار CG على الغضروف مع تلك TGF-β1، وعامل النمو الأكثر شيوعا للحث في المختبر تكون الغضروف في الخلايا الجذعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذا البروتوكول الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة الكاثوليكية في كوريا (KC16EAME0162) وإجراء فقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة. تم الحصول على جميع أنسجة مع الموافقة المسبقة عن مكتوب.
1. الطرد المركزي الجاذبية تحميل وبيليه الثقافة
- زراعة الخلايا والحصاد
- مخولا لصيانة طائرات الثقافة (P2-P3، انظر قائمة من المواد) في Dulbecco لتعديل المتوسطة انخفاض مستوى السكر في النسر (DMEM-LG) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (P / S) عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO 2.
- عندما تصل الخلايا 80٪ التقاء، تجاهل المتوسطة وغسل الخلايا مع 5 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 ملم EDTA واحتضان لمدة 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO 2.
- اضغط على لوحة الثقافة بلطف، إضافة 4 مل من متوسطة جديدة، نقل الخلايا إلىأنبوب 15 مل المخروطية، وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 250 × ز لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- الطرد المركزي الجاذبية تحميل
- بعد الطرد المركزي (الخطوة 1.1.4)، وإزالة طاف دون الإخلال بيليه و resuspend بيليه في 10 مل من DMEM-LG مع FBS 10٪. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
- الفريق الاستشاري للتحميل، ونقل 2.5 × 10 5 الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل جديد وأجهزة الطرد المركزي في 2400 × ز لمدة 15 دقيقة.
- ثقافة بيليه
- مباشرة بعد الطرد المركزي، ونضح طاف وإضافة 500 ميكرولتر من يعرف متوسطة التمايز المولدة للغضروف (CDM، وارتفاع الجلوكوز DMEM تستكمل مع 1٪ FBS، 1٪ ITS + بريمكس، 100 نانومتر ديكساميثازون، 1X MEM غير الضرورية حل الأحماض الأمينية، 50 ميكروغرام / مل L-البرولين، و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين). إضافة 50 ميكروغرام / مل من الطازجة حمض الأسكوربيك L-2-الفوسفات في كل تغيير المتوسط. كما تحكم إيجابية، لحث differentiati مكون للغضروفعلى الخلايا uncentrifuged بإضافة آلية التنمية النظيفة التي تحتوي على 10 نانوغرام / مل TGF-β1.
- وضع أنابيب توج فضفاضة تحتوي على الكريات في وضعية الوقوف واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO 2.
- تغيير المتوسط كل يوم لمدة 3 أسابيع.
- ثقافة MICROMASS
- مباشرة بعد الطرد المركزي (الخطوة 1.2.2، 2400 × ز لمدة 15 دقيقة)، ونضح طاف و resuspend بيليه في 10 ميكرولتر من آلية التنمية النظيفة.
- لتشكيل MICROMASS، وضع الخلايا معلق في وسط بئر من 24 لوحة جيدا.
- بعد 2 ساعة، إضافة بعناية 1 مل من آلية التنمية النظيفة إلى البئر، pipetting لضد الجدار لوحة لتجنب تعطيل MICROMASS. كما تحكم إيجابية، نفذ ثقافة MICROMASS مع خلايا uncentrifuged بإضافة آلية التنمية النظيفة التي تحتوي على 10 نانوغرام / مل TGF-β1.
- احتضان MICROMASS عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO 2.
- تغيير إف المتوسطريها يوم لمدة 3 أسابيع.
2. عكسي الناسخ، البلمرة المتسلسل (RT-PCR) للكشف الترانسكربتي Upregulation من مكون للغضروف التمايز علامات
- في يوم 14، واستخدام ماصة لنقل الكريات كروي لأنبوب جديد 1.5 مل وغسلها في برنامج تلفزيوني 1X.
- استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الكريات باستخدام guanidinium ثيوسيانات الفينول كلوروفورم طريقة استخراج 9.
- توليف [كدنا من 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام الناسخ العكسي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (احتضان عند 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ثم تعطيل انزيم على 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق).
- أداء PCR مع الاشعال محددة للعلامات التمايز المولدة للغضروف 10.
3. تلطيخ للكشف عن overexpression من مكون للغضروف التمايز ماركر البروتينات
- الكريات خلية تضمين البارافين
- في يوم 21،استخدام ماصة للحصاد الكريات كروي وغسلها مع برنامج تلفزيوني 1X.
- إصلاح الكريات كروي عن طريق الغمر في 4٪ امتصاص العرق لمدة 24 ساعة.
تحذير: لامتصاص العرق عالية السمية. تجنب ملامسة العينين والجلد، أو الأغشية المخاطية. تقليل التعرض وتجنب استنشاق أثناء التحضير. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. - تجاهل تثبيتي، وشطف الكريات الخلايا مع الماء منزوع الأيونات (DW).
- وضع طبقة واحدة من الشاش على الكاسيت ونقل الكريات الثابتة باستخدام ماصة. تغطية بيليه عن طريق طي الشاش وإغلاق غطاء كاسيت.
- يذوى الكريات.
- تزج الكريات في 70٪ من الإيثانول (ETOH) لمدة 5 دقائق على RT.
- تزج الكريات في 80٪ ETOH لمدة 5 دقائق على RT.
- تزج الكريات في 95٪ ETOH لمدة 5 دقائق على RT.
- تزج الكريات في 100٪ ETOH لمدة 5 دقائق على RT. كرر مرتين.
- تزج الكريات في 100٪ الزيلين لمدة 15 دقيقة في RT. كرر التويم.
- تضمين الكريات خلية ثابتة في البارافين عند 56 درجة مئوية في القالب. يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ من الكريات في البارافين باستخدام نظم معالجة الأنسجة الآلي المتخصصة.
- قطع 5 أقسام ميكرون سميكة من الخلية بيليه جزءا لا يتجزأ من البارافين باستخدام مشراح الدوارة.
- تعويم المقاطع في 50٪ ETOH ومن ثم نقلها إلى حمام الماء 50 درجة مئوية باستخدام الشرائح.
- ضع أقسام عائمة على الشرائح.
- سفرانين يا وتلطيخ الأزرق الألسيان
- ترطيب أقسام البارافين.
- تزج الشرائح في الزيلين لمدة 15 دقيقة. كرر مرتين.
- تزج الشرائح في 100٪ ETOH لمدة 5 دقائق. كرر مرتين.
- تزج الشرائح في 90٪ ETOH لمدة 5 دقائق.
- تزج الشرائح في 80٪ ETOH لمدة 5 دقائق.
- تزج الشرائح في 70٪ ETOH لمدة 5 دقائق، ثم غسلها في برنامج تلفزيوني 1X.
- وصمة عار على أقسام ممهى مع 1٪ سفرانين يا حل و 3٪ الأزرق الألسيان ل30 دقيقة.
- تجاهل الحل تلطيخ وشطف المقاطع مع DW.
- وصمة عار على أقسام مع حل الهيماتوكسيلين / يوزين (مباين) لمدة 1 دقيقة.
- تجاهل الحل تلطيخ وشطف المقاطع مع DW.
- ضع قطرة من متوسطة متزايدة على ساترة بعد إزالة أي المياه المتبقية. وضع بعناية الشريحة (الجانب الخلية أسفل) على ساترة تحتوي على المتوسطة المتزايدة.
- السماح للشرائح حتى يجف لمدة 2-3 ساعة عند RT.
- التقاط الصور باستخدام المجهر مشرق الميدان (الآلي المجهر تستقيم، 50X و200X).
- ترطيب أقسام البارافين.
- المناعي فحص
- ترطيب أقسام كما هو موضح في القسم 3.2.1.
- تزج الشرائح في المخزن سيترات الصوديوم (10 ملي سيترات الصوديوم، 0.05٪ توين 20، ودرجة الحموضة 6.0)، ثم الحفاظ عليها عند درجة حرارة الغليان الفرعية لمدة 10 دقيقة باستخدام الميكروويف.
- تبريد الشرائح لمدة 20 دقيقة في RT ثم غسلها بماء الصنبور.
- احتضان الشرائح في 3٪H 2 O 2 (في برنامج تلفزيوني 1X) لمدة 15 دقيقة، ثم يغسل لهم ماء الصنبور لمدة 15 دقيقة 11.
- منع الشرائح مع عازلة تمنع (10٪ مصل الماعز العادي في برنامج تلفزيوني) لمدة 1 ساعة.
- نضح عرقلة الحل، ومن ثم تطبيق الأجسام المضادة الأولية المخفف مع 5٪ مصل الماعز العادي على الشرائح.
- احتضان الشرائح بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- غسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- احتضان الشرائح في الأجسام المضادة الثانوية-تألقي مترافق المخفف مع 5٪ مصل الماعز العادي لمدة 1 ساعة على RT في الظلام.
- غسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق كل في الظلام.
- احتضان الشرائح مع دابي (1 ميكروغرام / مل) لمدة 10 دقيقة، ثم يغسل لهم مرتين في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- ضع قطرة من متوسطة متزايدة على ساترة بعد إزالة أي المياه المتبقية. وضع بعناية الشريحة (الجانب الخلية أسفل) على تصاعد المتوسط.
- السماح للشرائح حتى يجف لمدة 2-3ساعة في الظلام في RT.
- تصور الشرائح باستخدام المجهر مضان (Rhod: 594 نانومتر، دابي: 340 نانومتر؛ 60X والتكبير 200X) 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
خطورة الطرد المركزي تحرض على overexpression من علامات التمايز المولدة للغضروف في الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة.
لتحديد درجة قوة الجاذبية الطرد المركزي التي هي مناسبة للحث على تمايز المولدة للغضروف، وحفز مخولا لصيانة طائرات مع درجات مختلفة من CG (0، 300، 600، 1200، و 2400 x ج) لمدة 15 دقيقة. بعد التحفيز، وكانت المصنفة إعادة لمخولا لصيانة طائرات على لوحات ثقافة ومثقف لمدة 24 ساعة. كما هو مبين في الشكل 1A، وزادت SOX9 مرنا التعبير بشكل ملحوظ في 2400 x ج. كان ما يقرب من 1.5 أضعاف أعلى في 2400 x ج مما كانت عليه في التحكم (مخولا لصيانة طائرات لا محملة م). لتأكيد ما إذا CG يدفع التمايز المولدة للغضروف، ونحن حفز مخولا لصيانة طائرات من قبل الفريق الاستشاري التحميل أو عن طريق العلاج TGF-β1. ونتيجة لسيطرة سلبية، كانت مخولا لصيانة طائرات مثقف دون أي تنبيه. تم حصاد العينات في يوم 14 و تم تنفيذ QRT-PCR. كما هو مبين في Figure 1، COL2A1 مرنا، والمولدة للغضروف التمايز علامة تمثيلية، وupregulated في مخولا لصيانة طائرات يحفزه CG قريب للسيطرة على الخلايا (ومخولا لصيانة طائرات unstimulated). وكان مستوى upregulation من COL2A1 مرنا عن طريق تحفيز CG مماثلة لتلك التي يسببها العلاج TGF-β1. من ناحية أخرى، COL10، علامة غضروفية التصنع، وdownregulated عن طريق تحفيز CG. ACAN مرنا، الذي يشفر مكون هيكلي رئيسي من الغضروف المفصلي، وupregulated ما يقرب من 2 أضعاف عن طريق تحفيز الفريق الاستشاري، في حين كان COL1 لا مرتفعة detectably بالنسبة للضوابط. لا ACAN ولا COL1 تم upregulated في مخولا لصيانة طائرات تعامل مع TGF-β1.
خطورة الطرد المركزي أن تتجسد في التعبير عن المصفوفة خارج الخلية ذات الصلة تكون الغضروف في الثقافة بيليه الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة.
الوديعة أيون من ECM، مثل غلكسمينوغلكن]، هو النمط الظاهري السمة المميزة للتمايز المولدة للغضروف. للكشف عن هذه المواد، ونحن الملون مخولا لصيانة طائرات بيليه مع مثقف سفرانين يا والأزرق الألسيان في يوم 21. كما هو مبين في الشكل 2A، مخولا لصيانة طائرات حفز مع الفريق الاستشاري أودعت أكثر غلكسمينوغلكن] (أحمر لسفرانين يا والأزرق للالألسيان الأزرق) من الضوابط، في مستوى مماثلة لتلك التي أودعتها مخولا لصيانة طائرات تعامل مع TGF-β1. في هذه التجارب، أشار تلطيخ إيجابي تشكيل مصفوفة الغضروف. لمزيد من التأكيد، راقبنا التعبير عن بروتين COL2A1 باستخدام الأجسام المضادة PE مترافق مكافحة COL2A1. وقد overexpressed COL2A1 في مخولا لصيانة طائرات حفز مع الفريق الاستشاري إلى حد أكبر قليلا مما كان عليه في مخولا لصيانة طائرات تعامل مع TGF-β1 (الشكل 2B).
هو فعل تشكيل الكلي مكون للغضروف عن طريق الجاذبية الطرد المركزي في ثقافة MICROMASS الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة.
ether.within الصفحات = "1"> تشكيل لتجميع مكون للغضروف (أو التكثيف) هو شرط أساسي للتمييز بين مكون للغضروف 13. ولذلك، فإننا مقارنة التكثيف في MICROMASS بين الثقافات من مخولا لصيانة طائرات مراقبة ومخولا لصيانة طائرات حفز مع الفريق الاستشاري أو TGF-β1. كما هو مبين في الشكل (3)، تم الكشف عن تجمعات أكبر وأكثر كثافة من مخولا لصيانة طائرات (البيض الملون في مربع منقط) في الثقافات MICROMASS مصنوعة من مخولا لصيانة طائرات حفز مع الفريق الاستشاري أو TGF-β1 من الثقافات في السيطرة.
وupregulated SOX9 عن طريق الجاذبية الطرد المركزي في الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة.
Sox9 هو منظم سيد التمايز المولدة للغضروف 14 و 15. لتحديد ما إذا CG الحث على upregulation من Sox9 في مخولا لصيانة طائرات، راقبنا التعبير عن SOX9 مرنا في مخولا لصيانة طائرات تتعرض لفترات مختلفة من CG stimulaنشوئها (2400 × ز). تم التحقيق التعبير SOX9 بدرجات مختلفة من CG، لكنها لم تختلف كثيرا بين الظروف CG مع قوات أكبر من 2400 × ز (لا تظهر البيانات). بدأ التعبير عن SOX9 مرنا لزيادة بعد 15 دقيقة من التحفيز CG، ومشبعة بعد 30 دقيقة (الشكل 4A). المقبل، لتحديد كيف يمكن أن يستمر طويلا overexpression Sox9 الناجم عن CG، ونحن تحصد مخولا لصيانة طائرات حفز CG-في نقطة زمنية المشار إليها ومراقبتها التعبير عن Sox9. كما هو مبين في الشكل 4B، وزيادة التعبير عن بروتين Sox9 حتى 3 ساعات بعد التحفيز CG وبقيت على هذا المستوى لمدة 12 ساعة على الأقل.
الشكل 1. خطورة الطرد المركزي أن تتجسد في upregulation من علامات التمايز المولدة للغضروف في الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة. أ) لتحديد كماuitable قوة الجاذبية الطرد المركزي، تم طرد مخولا لصيانة طائرات في CG مختلفة (0، 300، 600، 1200، و 2400 x ج) لمدة 15 دقيقة. تم تقييم التعبير SOX9 مرنا في 24 ساعة بعد التحفيز CG. ب) تقييم التعبير عن الجينات ذات الصلة تكون الغضروف، تم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من مخولا لصيانة طائرات التي تم طرد، وتعامل مع TGF-β1 (10 نانوغرام / مل)، أو unstimulated (الضوابط). تعرض الحمض النووي الريبي لعكس النسخ لتجميع كدنا]، الذي كان آنذاك وتضخيمها من قبل RT-PCR. تم إجراء جميع التجارب ثلاث مرات على الأقل. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. ** ف <0.01 لمخولا لصيانة طائرات حفز مع الفريق الاستشاري مقابل المراقبة (غير حفز مخولا لصيانة طائرات).
الشكل 2. خطورة الطرد المركزي يؤدي الى المصفوفة خارج الخلية ذات الصلة تكون الغضروف في الثقافات بيليه الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة. أ) شكل مصفوفة بروتيوغليكانأيون من قبل الفريق الاستشاري التحميل. ب) overexpression التي يسببها CG من نوع الكولاجين 2. لCG تحميل، تم طرد مخولا لصيانة طائرات في 2400 × ز لمدة 15 دقيقة. تم تقييم overexpression من ECM ذات الصلة تكون الغضروف في الكريات كروي يتكون من مخولا لصيانة طائرات طرد من خلال استخدام سفرانين يا وتلطيخ الأزرق الألسيان. وأكد overexpression من نوع الكولاجين 2 المناعي باستخدام الأجسام المضادة ضد نوع الكولاجين 2 واليكسا فلور 594 مترافق الضد الثانوية (Rhod: 594 نانومتر، دابي: 340 نانومتر). لتحديد تأثير CG على ذات الصلة تكون الغضروف ECM overexpression، تم علاج مخولا لصيانة طائرات مع TGF-β1 (10 نانوغرام / مل) كعنصر تحكم إيجابية. وكانت سيطرة سلبية ثقافة بيليه لم يتعرض الفريق الاستشاري التحميل أو العلاج TGF-β1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
![الشكل (3)]("/files/ftp_upload/54934/54934fig3.jpg")
هو فعل الشكل 3. مكون للغضروف تشكيل الكلي عن طريق الجاذبية الطرد المركزي في الثقافات MICROMASS الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة. للحث على تمايز المولدة للغضروف، وحفز مخولا لصيانة طائرات (2.5 × 10 5) عن طريق الطرد المركزي في 2400 × ز أو عن طريق العلاج مع TGF-β1 (10 نانوغرام / مل). واستخدمت مخولا لصيانة طائرات Unstimulated والضوابط. لتشكيل micromasses، وضعت الخلايا (2.5 × 10 10/05 ميكرولتر) في مركز بئر في 24 لوحة جيدا. بعد 2 ساعة من الحضانة، طازجة متوسطة آلية التنمية النظيفة للضوابط وطرد مخولا لصيانة طائرات وآلية التنمية النظيفة التي تحتوي على عامل النمو التحويلي β1 (10 نانوغرام / مل) لمخولا لصيانة طائرات تعامل مع TGF-β1-تم إضافتها إلى الآبار، وحضنت العينات لمدة 14 يوما. تم تقييم التكثيف خلية غضروفية حسب حجم المجاميع.
الشكل 4. SOX9 هو upregulated عن طريق الجاذبية الطرد المركزي في الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة. أ) Upregulation من SOX9 مرنا عن طريق تحفيز الفريق الاستشاري لفترات مختلفة من الزمن. ب) تعبير البروتين Sox9 في مخولا لصيانة طائرات حفز CG-في نقاط زمنية مختلفة. سمح مخولا لصيانة طائرات لتنمو كما أحادي الطبقة لمدة 24 ساعة بعد CG التحميل. وأكد مرنا upregulation وتعبير البروتين من Sox9 بواسطة RT-PCR والنشاف الغربية، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الدولة stemness الخلايا مهمة جدا ل overexpression الناجم عن CG-من SOX9. في دراستنا، يمكن أن يتسبب التعبير SOX9 التي كتبها CG في مخولا لصيانة طائرات المبكر مرور (2-3)، ولكن ليس في مخولا لصيانة طائرات في وقت لاحق-مرور. وقد أفيد أنه خلال زراعة، مخولا لصيانة طائرات تحتوي على CD34 + الخلايا حتى 3 مقاطع (16). مخولا لصيانة طائرات تميل الى فقدان التعبير عن CD34 كما و passaged الخلايا، مما أدى إلى استجابة منخفضة لCG.
مع قوة الجاذبية الطرد المركزي، الضغط الهيدروليكي يمكن تحميلها على الخلايا خلال التحفيز CG. لذلك، قد يكون حجم المتوسطة واحد من العوامل التي تؤثر على تحريض SOX9. للحفاظ على بيئة الضغط الهيدروستاتيكي حتى لكل تجربة، تم استخدام 1 مل من المتوسط في 1 × 10 5 خلايا في أنبوب 15 مل. وبالإضافة إلى ذلك، تم استخدام البديل الدوار دلو لتطبيق بالتساوي CG إلى الخلايا (التي تشكل زاوية قائمة).
مقارنة TGF-β1، أظهر الفريق الاستشاري قدرة أقل لحمل SOX9 والتعبير علامة مكون للغضروف في مخولا لصيانة طائرات. قد يكون هذا وجود قيود على هذه التقنية. لتطبيق السريرية، فإنه ينبغي التحقيق أيضا عما إذا كان مخولا لصيانة طائرات حفز CG-وتجديد الغضروف ضعف ما يصل الى مستوى وظيفة عادية في نموذج في الجسم الحي.
في الثقافة المختبر مع عوامل النمو، وخاصة TGF-β1، هو الأسلوب الأكثر فعالية للحث على تمايز الخلايا الجذعية المولدة للغضروف 17. ويعرف هذا الأسلوب لتكون مفيدة لتخصيب الخلايا المولدة للغضروف والحث التمايز. ومع ذلك، الشيخوخة المبكرة وغير متوقع التمايز النسب وغالبا ما تحدث في المختبر خلال الثقافة 18، 19. الأخطر من ذلك هو ارتفاع مخاطر التلوث من الثقافات في المختبر. من ناحية أخرى، لا يتطلب أسلوبنا في التمايز المولدة للغضروف في المختبر مع عوامل النمو. الخلايا الجذعية يمكن زرعها فى سنوياtient مباشرة بعد العزلة، وبعد الطرد المركزي، والذي قد يضمن خطر تلوث منخفض وتقصير وقت المعالجة. المكروية حول الخلايا الجذعية أمر بالغ الأهمية لتحريض التمايز المولدة للغضروف. قد ينتج غير متوقع النسب التمايز من غير سليمة في بيئة المختبر. كما ذكر في اسلوبنا، لأن الخلايا الجذعية طرد يمكن زرعها في غضروف المريض (البيئة المناسبة للتمايز المولدة للغضروف) دون عملية التمايز إضافية، قد انخفض غير متوقع النسب التمايز.
هنا، نقدم البروتوكول الذي يستخدم CG للحث على التمايز المولدة للغضروف من مخولا لصيانة طائرات. نتائجنا تظهر ان CG يدفع upregulation Sox9 والظواهر التمايز المولدة للغضروف في مخولا لصيانة طائرات، بما في ذلك overexpression COL2A1، ترسب ECM أكثر اتساعا، وتشكيل الكلي مكون للغضروف. وبناء على نتائجنا، ومخولا لصيانة طائرات تتعرض لCG هي بديل جيد للعشراللجان الدائمة البريد تعامل مع TGF-β1، وبالتالي يمكن استخدامها في عمليات زرع لتجديد الغضروف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 60 mm Dish | TPP | 93060 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| ASC Culture Media Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM Low glucose | Life Technologies | 11885-084 | growth base media |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
| DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | chondrogenic differentiation base media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D2915 | 100 nM |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | 50 μg/mL |
| L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50 μg/mL |
| ITS | BD | 354352 | 1% |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL |
| Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Human adipose-derived stem cells (ASCs) | Catholic MASTER Cells | ||
References
- Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
- Erickson, G. R., et al. Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 290 (2), 763-769 (2002).
- Sah, R. L., et al. Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression. J Orthop Res. 7 (5), 619-636 (1989).
- Sakao, K., et al. Induction of chondrogenic phenotype in synovium-derived progenitor cells by intermittent hydrostatic pressure. Osteoarthritis Cartilage. 16 (7), 805-814 (2008).
- Li, Z., Yao, S. J., Alini, M., Stoddart, M. J. Chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells in fibrin-polyurethane composites is modulated by frequency and amplitude of dynamic compression and shear stress. Tissue Eng Part A. 16 (2), 575-584 (2010).
- Alves da Silva, M. L., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. J Tissue Eng Regen Med. 5 (9), 722-732 (2011).
- Maeda, S., et al. Changes in microstructure and gene expression of articular chondrocytes cultured in a tube under mechanical stress. Osteoarthritis Cartilage. 13 (2), 154-161 (2005).
- Yang, J., Hooper, W. C., Phillips, D. J., Tondella, M. L., Talkington, D. F. Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (5), 1142-1143 (2002).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. (6), (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Jang, Y., et al. UVB induces HIF-1alpha-dependent TSLP expression via the JNK and ERK pathways. J Invest Dermatol. 133 (11), 2601-2608 (2013).
- Wu, Y. L., et al. Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths. J Cell Sci. 119, Pt 13 2797-2806 (2006).
- Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
- Akiyama, H., Chaboissier, M. C., Martin, J. F., Schedl, A., de Crombrugghe, B. The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6. Genes Dev. 16 (21), 2813-2828 (2002).
- Lefebvre, V., Huang, W., Harley, V. R., Goodfellow, P. N., de Crombrugghe, B. SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha1(II) collagen gene. Mol Cell Biol. 17 (4), 2336-2346 (1997).
- Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (2), 142-150 (2015).
- Chen, J., et al. Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds. Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).
- Janzen, V., et al. Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a. Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).
- Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113, Pt 7 1161-1166 (2000).
