Introduction
Difetti di cartilagine articolare non guariscono naturalmente. Di conseguenza, trapianto di cellule staminali è stata proposta come un approccio promettente per la riparazione della cartilagine compromessa. Tuttavia, questo metodo richiede sia l'acquisizione di un numero sufficiente di cellule staminali e l'induzione di queste cellule a subire differenziazione condrogenico. Il midollo osseo (BM) è stato ampiamente utilizzato come fonte di cellule staminali, ma l'isolamento delle cellule da BM ha due principali svantaggi: invasività e di rendimento insufficiente. A causa della sua facilità di acquisizione, tessuto adiposo è fonte preferibile di cellule staminali. Studi precedenti hanno dimostrato la fattibilità di isolare cellule staminali dal tessuto adiposo e indurre la differenziazione condrogenica in queste cellule con citochine, come TGF-β1 1, 2. Questi metodi sono efficaci ma costosi.
Come un più basso costo alle citochine, stress meccanico può essere utilizzato perindurre la differenziazione condrogenico. Carico meccanico gioca un ruolo fondamentale nel mantenimento della salute della cartilagine articolare 3, e può indurre fenotipi condrogeniche in varie cellule. Ad esempio, la pressione idrostatica induce fenotipi condrogeniche in cellule progenitrici derivate dal sinovio attraverso la via MAP chinasi / JNK 4, e la compressione meccanica induce condrogenesi nelle cellule staminali mesenchimali umane (MSC) per upregulating geni chondrocytic 5. Inoltre, shear stress contribuisce alla espressione della matrice extracellulare chondrogenesis legati (ECM) di MSC umani 6. Gravità centrifugo (CG), uno stress meccanico facilmente applicata e controllata generato per centrifugazione, può indurre l'espressione genica differenziale in cellule 7. Ad esempio, nelle cellule di carcinoma epiteliale polmonare, l'espressione di interleuchina (IL) -1 ter è upregulated per centrifugazione 8. Therefore, come sollecitazioni meccaniche sperimentalmente inducibile, CG può essere utilizzato per indurre l'espressione genica in cellule staminali chondrocytic. Tuttavia, non è chiaro se CG può indurre la differenziazione delle cellule staminali condrogenica.
In questo studio, abbiamo scoperto che CG ha indotto la upregulation di SOX9, un regolatore maestro di condrogenesi, in ASC umani, causando la sovraespressione di geni chondrocytic. Inoltre, abbiamo confrontato gli effetti di CG su chondrogenesis con quelli di TGF-β1, il fattore di crescita più comunemente utilizzati per indurre in vitro condrogenesi nelle cellule staminali.
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Protocol
Questo protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università Cattolica di Corea (KC16EAME0162) ed eseguito secondo le direttive NIH. Tutti i tessuti sono stati ottenuti con il consenso informato scritto.
1. centrifuga carico gravitazionale e la cultura Pellet
- coltura cellulare e la raccolta
- ASC Culture (P2-P3, vedere elenco dei materiali) in Modified medio-basso livello di glucosio Eagle Dulbecco (DMEM-LG) supplementato con siero 10% fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina (P / S) a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO 2.
- Quando le cellule raggiungono 80% di confluenza, scartare il mezzo e lavare le cellule con 5 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS).
- Aggiungere 1 ml di PBS contenente 1 mM EDTA e incubare per 2 minuti a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO 2.
- Toccare la piastra di coltura delicatamente, aggiungere 4 ml di terreno fresco, trasferire le cellule aun tubo da 15 ml conica e centrifugare le cellule a 250 xg per 2 minuti a temperatura ambiente (RT).
- carico gravitazionale centrifuga
- Dopo la centrifugazione (fase 1.1.4), rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet e risospendere il pellet in 10 ml di DMEM-LG con il 10% FBS. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- Per CG caricamento, trasferire 2,5 × 10 5 cellule in una nuova provetta conica da 15 ml e centrifugare a 2400 g per 15 min.
- cultura pellet
- Subito dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e aggiungere 500 ml di mezzo di differenziazione condrogenico definito (CDM, DMEM ad alto glucosio integrato con 1% FBS, 1% ITS + Premix, 100 nM desametasone, soluzione di aminoacidi 1x MEM non essenziali, 50 mcg / mL L-prolina, e l'1% di penicillina / streptomicina). Aggiungere 50 mg / mL di preparati di acido L-ascorbico 2-fosfato ad ogni cambio medio. Come controllo positivo, indurre differentiati condrogenichesu cellule non centrifugati con l'aggiunta di CDM contenente 10 ng / mL TGF-β1.
- Posizionare i tubi liberamente innevate contenenti il pellet in una posizione in piedi e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO 2.
- Modificare il medium a giorni alterni per 3 settimane.
- cultura Micromass
- Immediatamente dopo la centrifugazione (fase 1.2.2; 2.400 × g per 15 min), aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di CDM.
- Per formare un Micromass, posizionare le cellule risospese nel centro di un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti.
- Dopo 2 h, aggiungere con attenzione 1 mL di CDM al pozzo, pipettaggio contro la parete della piastra di non perturbare il Micromass. Come controllo positivo, eseguire una cultura Micromass con le cellule non centrifugati con l'aggiunta di CDM contenente 10 ng / mL TGF-β1.
- Incubare la Micromass a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO 2.
- Modificare l'ev medioery altro giorno per 3 settimane.
2. trascrittasi inversa-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) per rilevare trascrizionale upregulation di condrogenico differenziazione marcatori
- Il giorno 14, utilizzare una pipetta per trasferire i pellets sferoidali in una nuova provetta da 1,5 ml e lavarli in PBS 1x.
- Estrarre l'RNA totale da pellet che utilizzano il guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio metodo di estrazione 9.
- Sintetizzare cDNA da 2 mg di RNA totale mediante trascrittasi inversa secondo il protocollo del produttore (incubare a 42 ° C per 1 ora e quindi inattivare l'enzima a 70 ° C per 5 min).
- Eseguire la PCR con primer specifici per i marcatori di differenziazione condrogeniche 10.
3. La colorazione per rilevare la sovraespressione di condrogenico differenziazione Marker Proteine
- pellet cellulari paraffina-embedding
- Il giorno 21,utilizzare una pipetta per raccogliere le palline sferoide e lavarli con PBS 1x.
- Fissare il pellet sferoidali per immersione in paraformaldeide al 4% per 24 ore.
Attenzione: Paraformaldeide è altamente tossico. Evitare il contatto con gli occhi, la pelle o le mucose. Ridurre al minimo l'esposizione e evitare l'inalazione durante la preparazione. Indossare dispositivi di protezione adeguati. - Eliminare il fissativo e lavare il pellet di cellule con acqua deionizzata (DW).
- Mettere uno strato di garza sulla cassetta e trasferire i pellet fisse con una pipetta. Coprire il pellet piegando la garza e chiudere il coperchio della cassetta.
- Disidratare il pellet.
- Immergere il pellet in 70% di etanolo (EtOH) per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Immergere il pellet in 80% EtOH per 5 minuti a RT.
- Immergere il pellet in 95% EtOH per 5 minuti a RT.
- Immergere i pellets in 100% EtOH per 5 minuti a RT. Ripetere due volte.
- Immergere i pellets in 100% xilene per 15 minuti a RT. Ripetere twiCE.
- Incorporare i pellet cellulari fissati in paraffina a 56 ° C in uno stampo; il pellet possono essere incorporati in paraffina utilizzando sistemi di lavorazione dei tessuti specializzati automatizzati.
- Tagliare 5 sezioni micron di spessore dal pellet cellulare in paraffina utilizzando un microtomo rotativo.
- Float sezioni nel 50% EtOH e poi trasferirli in un bagno d'acqua a 50 ° C utilizzando una diapositiva.
- Posizionare le sezioni galleggianti su vetrini.
- Safranina O e Alcian colorazione blu
- Reidratare il sezioni di paraffina.
- Immergere i vetrini in xilene per 15 min. Ripetere due volte.
- Immergere i vetrini in 100% EtOH per 5 min. Ripetere due volte.
- Immergere i vetrini in 90% EtOH per 5 min.
- Immergere i vetrini in 80% EtOH per 5 min.
- Immergere i vetrini in 70% EtOH per 5 minuti, e poi lavare in PBS 1x.
- Macchiare le sezioni reidratati con soluzione di safranina O 1% e il 3% blu Alcian per30 minuti.
- Eliminare la soluzione colorante e lavare le sezioni con DW.
- Macchiare le sezioni con soluzione ematossilina / eosina (di contrasto) per 1 min.
- Eliminare la soluzione colorante e lavare le sezioni con DW.
- Mettere una goccia di mezzo di montaggio sul vetrino dopo aver rimosso l'acqua residua. posizionare con cura il vetrino (cellule rivolto verso il basso) sul vetrino che contiene il mezzo di montaggio.
- Lasciare i vetrini si asciughino per 2-3 ore a temperatura ambiente.
- Acquisire immagini utilizzando un microscopio in campo chiaro (microscopio verticale automatizzato, 50X e 200X).
- Reidratare il sezioni di paraffina.
- test di immunofluorescenza
- Reidratare sezioni come descritto nella sezione 3.2.1.
- Immergere i vetrini in tampone citrato di sodio (10 mM sodio citrato, 0,05% Tween 20, pH 6,0), e quindi di mantenere ad una temperatura sub-bollente per 10 minuti usando un forno a microonde.
- Raffreddare i vetrini per 20 minuti a temperatura ambiente e poi lavarle con acqua del rubinetto.
- Incubare i vetrini a 3%H 2 O 2 (in 1x PBS) per 15 minuti, e poi lavare con acqua corrente per 15 minuti 11.
- Bloccare i vetrini con tampone di bloccaggio (10% di siero normale di capra in PBS) per 1 ora.
- Aspirare la soluzione di saturazione, e quindi applicare un anticorpo primario diluito con 5% di siero normale di capra sulle diapositive.
- Incubare i vetrini notte a 4 ° C.
- Lavare i vetrini tre volte in 1x PBS per 5 minuti ciascuna.
- Incubare i vetrini in anticorpo secondario coniugato a un fluorocromo diluito con 5% di siero normale di capra per 1 ora a temperatura ambiente al buio.
- Lavare i vetrini tre volte in PBS 1x per 5 minuti ciascuna al buio.
- Incubare i vetrini con DAPI (1 mg / ml) per 10 minuti, e poi lavarli due volte in 1x PBS per 5 minuti ciascuna.
- Mettere una goccia di mezzo di montaggio sul vetrino dopo aver rimosso l'acqua residua. posizionare con cura il vetrino (cellule rivolto verso il basso) sul supporto di montaggio.
- Lasciare i vetrini si asciughino per 2-3h al buio a temperatura ambiente.
- Visualizza le diapositive utilizzando microscopia a fluorescenza (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; 60X e 200X ingrandimento) 12.
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Representative Results
gravità centrifuga induce la sovraespressione di marcatori di differenziazione condrogeniche in cellule staminali derivate da tessuto adiposo.
Per determinare il grado di forza di gravità centrifuga atta ad indurre la differenziazione condrogenico, ASC sono state stimolate con diversi gradi di CG (0, 300, 600, 1200, e 2400 xg) per 15 min. Dopo la stimolazione, le ASC sono stati ri-seminate su piastre di coltura e coltivate per 24 ore. Come mostrato nella Figura 1A, espressione SOX9 mRNA era significativamente aumentata a 2.400 xg; era circa 1,5 volte superiore a 2.400 xg rispetto al controllo (ASC non caricati con CG). Per confermare se CG induce la differenziazione condrogenico, abbiamo stimolato ASC da CG di carico o da un trattamento TGF-β1. Come controllo negativo, ASC sono stati coltivati senza alcun stimolo. I campioni sono stati raccolti il giorno 14 ed è stata effettuata qRT-PCR. Come mostrato in FIGURA 1, COL2A1 mRNA, un marker di differenziazione condrogenico rappresentante, è stato upregulated in ASCs stimolati da CG rispetto alle cellule di controllo (ASC non stimolate). Il livello upregulation di COL2A1 mRNA dalla stimolazione CG era simile a quella indotta dal trattamento TGF-β1. D'altra parte, COL10, un marker di condrociti ipertrofici, era downregulated dalla stimolazione CG. ACAN mRNA, che codifica per un importante componente strutturale della cartilagine articolare, è upregulated di circa 2 volte dalla stimolazione CG, mentre COL1 non era rilevabile elevata rispetto ai controlli. Né ACAN né COL1 sono stati upregulated in ASC trattati con TGF-β1.
gravità centrifuga induce l'espressione di una matrice extracellulare condrogenesi legati nella cultura pellet di cellule staminali derivate da tessuto adiposo.
Depositareione di ECM, quali glicosaminoglicano, è un fenotipo caratteristica di differenziazione condrogenico. Per rilevare questo materiale, abbiamo macchiato ASC pellet-coltura con safranina O e blu Alcian il giorno 21. Come mostrato nella Figura 2A, ASC stimolati con CG depositate più glicosaminoglicani (rosso per safranina O e blu per il blu Alcian) rispetto ai controlli, in un livello simile a quello depositato da ASC trattati con TGF-β1. In questi esperimenti, colorazione positiva indicata la formazione di una matrice cartilaginea. Per ulteriore conferma, abbiamo monitorato l'espressione della proteina COL2A1 usando l'anticorpo anti-COL2A1 PE-coniugato. COL2A1 stato overexpressed in ASCs stimolati con CG in misura leggermente maggiore rispetto a ASCs trattati con TGF-β1 (Figura 2B).
formazione degli aggregati condrogenico è indotta per gravità centrifuga in una cultura Micromass di cellule staminali derivate da tessuto adiposo.
13. Pertanto, abbiamo confrontato la condensazione nei Micromass tra le culture di ASC di controllo e ASC stimolati con CG o TGF-β1. Come mostrato nella Figura 3, aggregazioni più grandi e più densi di ASC (colore bianco nella piazza tratteggiata) sono stati rilevati nelle culture Micromass realizzati in ASC stimolati con CG o TGF-β1 che in colture di controllo.
SOX9 è upregulated per gravità centrifuga nelle cellule staminali derivate da tessuto adiposo.
Sox9 è un regolatore maestro di differenziazione condrogenico 14, 15. Per determinare se CG induce la sovraregolazione di Sox9 in ASC, abbiamo monitorato l'espressione di mRNA in SOX9 ASC esposti a varie durate di CG stimolizione (2.400 × g). Espressione SOX9 è stato studiato a vari gradi di CG, ma non differiva significativamente tra le condizioni di CG con le forze superiori a 2.400 × g (dati non riportati). Espressione dei SOX9 mRNA inizia ad aumentare dopo 15 min di stimolazione CG, ed è stato saturato dopo 30 min (Figura 4A). Quindi, per determinare quanto tempo sovraespressione Sox9 CG-indotta può essere mantenuta, abbiamo raccolto ASC CG-stimolati nei punti temporali indicati e vigilato espressione di Sox9. Come mostrato in figura 4B, l'espressione della proteina Sox9 aumentata fino a 3 ore dopo la stimolazione CG e rimane a tale livello per almeno 12 h.
Figura 1. gravità centrifuga induce la sovraregolazione di marcatori di differenziazione condrogeniche in cellule staminali derivate da tessuto adiposo. A) determinare comeuitable forza di gravità centrifuga, ASC sono stati centrifugati a diversa CG (0, 300, 600, 1200, e 2400 xg) per 15 min. espressione di mRNA SOX9 è stata valutata a 24 ore dopo la stimolazione CG. B) Per valutare l'espressione di geni Condrogenesi correlati, l'RNA totale è stato estratto da ASC che erano stati centrifugati, trattati con TGF-β1 (10 ng / ml), o non stimolate (controlli). L'RNA è stato sottoposto a trascrizione inversa per sintetizzare cDNA, che è stato poi amplificato mediante RT-PCR. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti almeno tre volte. barre di errore rappresentano la deviazione standard. ** P <0,01 per ASC stimolati con CG rispetto al controllo (-non stimolati ASC).
Figura 2. gravità centrifuga induce una matrice extracellulare condrogenesi legati a culture pellet di cellule staminali derivate da tessuto adiposo. A) formato matrice Proteoglycanione da CG di carico. B) sovraespressione CG indotta da collagene di tipo 2. Per CG carico, ASC sono stati centrifugati a 2400 g per 15 min. La sovraespressione di ECM chondrogenesis-correlata è stata valutata in granuli sferoidali, comprensivi di ASC centrifugati attraverso l'utilizzo di safranina O e Alcian colorazione blu. Sovraespressione di collagene di tipo 2 è stata confermata mediante immunofluorescenza utilizzando un anticorpo contro il collagene di tipo 2 e un Alexa Fluor 594 coniugato anticorpo secondario (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm). Per determinare l'effetto di CG su chondrogenesis legati ECM sovraespressione, ASC sono stati trattati con TGF-β1 (10 ng / mL) come controllo positivo. Il controllo negativo era una cultura pellet non sottoposto a CG carico o trattamento TGF-β1. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
![Figura 3]("/files/ftp_upload/54934/54934fig3.jpg")
Figura 3. condrogenico formazione di aggregati è indotta dalla gravità centrifuga in colture Micromass di cellule staminali derivate da tessuto adiposo. Per indurre la differenziazione condrogenico, ASC (2,5 × 10 5) sono state stimolate per centrifugazione a 2.400 × g o da un trattamento con TGF-β1 (10 ng / mL). ASC non stimolati sono stati utilizzati come controlli. Per formare micromasses, cellule (2,5 × 10 del 5/10 mL) sono stati posti al centro di pozzetti in una piastra da 24 pozzetti. Dopo 2 ore di incubazione, fresco di medio-CDM per i controlli e centrifugato ASC e CDM contenenti TGF-β1 (10 ng / ml) per ASC trattati con TGF-β1-è stato aggiunto ai pozzetti ed i campioni sono stati incubati per 14 giorni. Condrociti condensazione è stata valutata dalla dimensione degli aggregati.
Figura 4. SOX9 è upregulated per gravità centrifuga nelle cellule staminali derivate da tessuto adiposo. A) upregulation di SOX9 mRNA dalla stimolazione CG per diversi intervalli di tempo. B) l'espressione della proteina Sox9 in ASC CG-stimolati in diversi momenti. ASC è stato permesso di crescere come monostrato per 24 ore dopo CG carico. mRNA upregulation e l'espressione della proteina di Sox9 sono stati confermati mediante RT-PCR e Western blotting, rispettivamente.
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Discussion
Lo stato stemness delle cellule è molto importante per la sovraespressione CG-indotta SOX9. Nel nostro studio, espressione SOX9 potrebbe essere indotta da CG ASC precoce passaggio (2-3), ma non in ASC dopo-passaggio. E 'stato riportato che, durante la coltivazione, ASC contengono cellule CD34 + fino a 3 passaggi 16. ASC tendono a perdere l'espressione di CD34 come le cellule sono diversi passaggi, con conseguente bassa risposta al CG.
Con forza di gravità centrifuga, pressione idrostatica può essere caricato su cellule durante la stimolazione CG. Pertanto, il volume del mezzo può essere uno dei fattori che influenzano l'induzione di SOX9. Per mantenere un ambiente a pressione idrostatica anche per ogni esperimento, 1 ml di terreno è stato utilizzato per 1 × 10 5 cellule in una provetta da 15 ml. Inoltre, un rotore basculante è stato usato per applicare in modo uniforme CG alle celle (formando un angolo retto).
Rispetto al TGF-β1, CG ha mostrato una capacità inferiore perindurre SOX9 e di espressione marcatore condrogenico in ASC. Questa può essere una limitazione di questa tecnica. Per una applicazione clinica, dovrebbe essere ulteriormente esaminato se ASC CG-stimolate rigenerare cartilagine compromessa fino al livello della funzione normale in un modello in vivo.
In coltura in vitro con fattori di crescita, in particolare il TGF-β1, è il metodo più efficace per indurre la differenziazione delle cellule staminali condrogenica 17. Questo metodo è noto per essere utile per l'arricchimento delle cellule e l'induzione condrogenico differenziazione. Tuttavia, la senescenza precoce e la differenziazione lignaggio inaspettato spesso si verificano durante la coltura in vitro 18, 19. Più grave è l'elevato rischio di contaminazione in colture in vitro. D'altra parte, il metodo non richiede in differenziamento condrogenico vitro con fattori di crescita. Le cellule staminali possono essere trapiantate in un patient subito dopo l'isolamento e dopo centrifugazione, che può garantire un basso rischio di contaminazione e di un tempo di elaborazione abbreviato. Il microambiente intorno alle cellule staminali è fondamentale per l'induzione condrogenico differenziazione. Inaspettato differenziazione lignaggio può derivare da una non corretta in ambiente vitro. Come accennato nel nostro metodo, perché le cellule staminali possono essere trapiantate centrifugati nella cartilagine di un paziente (l'ambiente adeguato per la differenziazione condrogenico) senza un processo di differenziazione ulteriore, inaspettato differenziazione lignaggio può essere diminuita.
Qui, vi presentiamo un protocollo che utilizza CG per indurre la differenziazione condrogenico di ASC. I nostri risultati mostrano che CG induce Sox9 upregulation e fenotipi differenziazione condrogeniche in ASC, tra cui l'iperespressione COL2A1, più estesa deposizione di ECM, e la formazione di aggregati condrogenico. Sulla base dei nostri risultati, le ASC esposti a CG sono un buon sostituto per esimoe MSC trattati con TGF-β1 e possono quindi essere utilizzati nei trapianti per la rigenerazione della cartilagine.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 60 mm Dish | TPP | 93060 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| ASC Culture Media Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM Low glucose | Life Technologies | 11885-084 | growth base media |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
| DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | chondrogenic differentiation base media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D2915 | 100 nM |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | 50 μg/mL |
| L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50 μg/mL |
| ITS | BD | 354352 | 1% |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL |
| Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Human adipose-derived stem cells (ASCs) | Catholic MASTER Cells | ||
References
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