Summary
犬の脳は大人の神経新生を研究する貴重なモデルです。ここで紹介する主要な脳組織から大人犬の海馬神経前駆細胞を単離および拡張するためのプロトコルです。
Protocol
ニューサウスウェールズ州、オーストラリアの法律によれば、 死後の脳組織は、研究とは無関係の理由のために安楽死させた成犬から取得しました。
培養培地の調製
- 100mlの蒸留水にゼラチン粉末を0.1gを添加し、溶解するまで37℃で攪拌し、0.1％のゼラチン溶液を調製します。 15分間のUV照射により溶液を滅菌します。このメディアは、その後1ヶ月まで4℃で保存することができます。
- DMEMの500ミリリットル（4.5グラム/ LのD-グルコース）にF-12の167ミリリットルを追加することで、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）と栄養素混合F12の1の比率：3を準備します。 （最終濃度1％のための）ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を6.7ミリリットルを追加します。このメディアは、最大1ヶ月間、4℃で暗所に保存することができます。
- DMEM（4.5グラム/ LのD-グルコース）、440ミリリットルを組み合わせることによって血清培地を500mlを調製5 mlのL-アラニル-L-グルタミンジペプチド（200ミリモル）、ペニシリン/ストレプトマイシン5mlの胎児bovin 50mlのE血清（FBS）。このメディアは、最大1ヶ月間、4℃で暗所に保存することができます。
- 完全増殖培地が幹細胞の神経から成る（NSC）基礎培地および増殖神経補足-A（NS-A）、2％FBS、2 / mlのヘパリン、20 ngの/ mlの上皮成長因子（EGF）および10ng / mLの塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）。このメディアは、脳の解剖の直前に、新鮮な、そして水浴中で37℃まで暖かくしてください。
2.脳の抽出
- ポビドンヨードを使用して、犬の頭の背側表面を滅菌することにより6時間の死後内の抽出を開始します。
- メスを使用して、基礎となる咬筋を露出するように、頭蓋の全体背面全体に、矢状正中線に沿って縦切開を行います。このカットの長さは、犬種や年齢によって異なります。
- 頭蓋の吻側および尾側の国境では、追加の5作る - 両側に10センチメートル垂直カットを、渡します皮膚が完全に反映させることができるようにするために、それぞれの目と耳の後ろる。
- メスを用いて、頭蓋骨の矢状稜への愛着から咬筋を分離し、頭蓋から任意の残りの結合組織をこすり。
- 振動骨を使用すると、円周線で頭蓋骨のキャップをカットしました。プローブまたはメスを用いて硬膜と、残りの添付ファイルを切断してから、慎重に脳の背側表面を露出させるために頭蓋骨のキャップを外します。
注意：骨の厚さは、頭蓋骨内の異なる領域で変化するので注意があまりにも深く浸透し、下層の脳に損傷を与えないように注意が必要。 - 上部頸椎の間にメスを挿入することにより、脊髄を切断。
- 優しく脳を持ち上げて片手で、慎重に頭蓋窩から脳を解放し、その腹側に位置する接続神経や血管を切断するためにメスを使用しています。静かにBを持ち上げます頭蓋骨の外とDPBSの容器に雨。
注意：犬の脳の大嗅球は、前頭蓋窩の中に深く延びてもよいです。脳を除去する際にこれらの構造を保存するように注意を払う必要があります。
3.海馬解剖
- 150ミリメートルペトリ皿の上に任意の血液を除去し、下に背側に配置するダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で脳をすすぎます。
- ゆっくりと湿った脳ナイフとブレードの全長を利用した単一のスライスを使用して、ミッド矢状面を通って長手方向に脳を二等分します。これは、組織に損傷を与える可能性がある、追加の下方圧力を適用するか、ソーイングモーションを使用しないでください。
- 各半球の内側の面を上に配置し、メスと細かいピンセットを用いて、海馬を解剖し、35mm組織培養皿に移します。
神経前駆細胞の単離4
- トンをミンチ約1mm 3の小片に手術用メスの刃を使用して、問題のサンプル。
- 、15mlチューブに組織を移す0.1％トリプシンEDTAを2mlを加え、37℃の水浴中で7分間インキュベートします。
- チューブに血清培地を4mlを添加することにより酵素反応を停止させます。 7分間100×gで遠心分離することによって、懸濁液をペレット化し、上清を除去します。
- DPBS300μlの中でペレットを再懸濁し、機械的に軽く滑らかなホモジネートが形成されるまで、千μlのピペットチップを使用して、上下にピペッティングにより解離しました。
- チューブに血清培地の14ミリリットルを追加し、40μmのセルストレーナーを介して細胞懸濁液を渡します。 、7分間100×gで遠心分離することによって、懸濁液をペレット上清を除去し、完全増殖培地中に再懸濁します。
5.ニューロスフェアの文化
- 分離で得られた細胞懸濁液から、トリパンブルー色素排除およびHEMOを使用して生細胞の数を数えますサイトメーター。
- 6ウェルプレートのコーティングされていないウェルに1×10 5細胞/ cm 2で完全増殖培地と種子中の細胞懸濁液を希釈します。
- 37℃、5％CO 2及び14のための> 95％の湿度でインキュベート- 28日、7日ごとに成長培地の50％を置き換えます。定期的にニューロスフェアの直径を測定します。直径100μmのを超えて成長させた場合、細胞死および自発的分化は、神経球内で発生する可能性があります。
6.ニューロスフェアパサージュ
- 浮遊培養として継代に、ニューロスフェアは、直径が約100μmに達すると、単一の管にメディアを含むすべての神経球を兼ね備えています。 7分間100×gで遠心分離することによってペレット化し、上清を除去します。
- 0.1％トリプシンEDTA 1mlにペレットを再懸濁し、37℃の水浴中で7分間インキュベートします。穏やかdissociatiを確実にするために、200μlのピペットチップを使用して、下の100倍をピペットニューロスフェアの上。
- 7分間、100×gでチューブを遠心分離し、血清培地を5mlを加えることにより酵素反応を停止させます。
- 、上清を除去し1mlの完全増殖培地を細胞ペレットを再懸濁し、トリパンブルー色素排除および血球計を用いて生存細胞の数を数えます。
- 6ウェルプレートのコーティングされていないウェルに1×10 5細胞/ cm 2で完全増殖培地と種子中の細胞懸濁液を希釈します。 7日ごとに成長培地の50％を置き換える、28日- 14を37℃、5％CO 2、> 95％の湿度でインキュベートします。
7.接着培養神経前駆細胞の
- 接着培養のためのニューロスフェアを処理する前に1時間37℃のインキュベーターで組織培養皿及び硬化の表面を覆うように、0.1％ゼラチン溶液の十分な量を追加します。
- 浮動ニューロスフェア培養物から、単一のチューブの中にすべてのメディアを組み合わせます。 neurペレット100×gで遠心分離によってospheres 7分間、上清を除去します。
- 0.1％トリプシンEDTA 1mlにペレットを再懸濁し、37℃の水浴中で7分間インキュベートします。穏やかに200μlのピペットチップを使用して、下の100倍をピペット。
- 7分間100×gで酵素反応および遠心分離機を停止する血清培地の5ミリリットルを追加します。上清を捨て、完全増殖培地1ミリリットル中に細胞ペレットを再懸濁し、トリパンブルー色素排除し、血球計数器を用いて生細胞の数を数えます。
- 完全増殖培地中の細胞懸濁液を希釈し、組織培養フラスコからゼラチンを除去し、1×10 4細胞/ cm 2で細胞を播種。
- 37℃、5％CO 2、> 95％の湿度で、細胞をインキュベートします。培養物が約80％コンフルエンス（後約7日）に達するまで、3日ごとに新鮮な、温め、完全増殖培地で培地を交換してください。
8. Neurアルコロニー形成アッセイ
- 神経コロニー形成細胞（NCFC）アッセイ培地成分を組み合わせる：NCFC無血清培地、増殖NS-A、およびコラーゲン溶液（3 mg / mlで）。 2 / mlのヘパリン、20 ngの/ mlのEGF、および10ng / mLのbFGFでこのメディアを補完します。
- 海馬組織解離に続いて、水浴中で37℃に予熱し、アッセイ培地を形成する神経コロニー中で細胞を再懸濁します。 35mmの培養皿に1.1×10 5細胞/ mlのクローン密度で細胞を播種。
- 37℃、5％CO 2、> 95％の湿度でこの半固体のコラーゲンマトリックス中で細胞をインキュベートします。 28日間培養し、7日ごとに成長培地の50％を置き換えます。
神経前駆細胞の分化9.
- 差異のために、細胞を処理する前に24時間37℃のインキュベーター中で組織培養皿及び硬化の表面を覆うように5μg/ cm 2のラミニン溶液の十分な量を加えまする。
注：ラミニン溶液を除去し、播種直前にDPBSで二回コーティングされた表面をすすぎます。 - 継代すると、DMEM-F12で1×10 4細胞/ cm 2で細胞懸濁液をシード（3：1）の上に20 ngの/ mlのEGFおよび40 ngの/ mlのbFGFを添加した培地（予め温めた37℃まで）ラミニンは、培養皿をコーティングしました。
- 37℃、5％CO 2、> 95％の湿度で、細胞をインキュベートし、細胞を3日間増殖することを可能にします。
- 接着性神経前駆細胞を区別するために、3日後（3：1）分化培地は、DMEM-F12を含有する培地を交換媒体は、10ng / mLの脳由来神経栄養因子（BDNF）を補充し°C、37に予め温めました。
- 分化の間に3日毎に培地の50％を置き換えます。 28日 - 分化は、約21をかけて徐々に発生します。
注意：細胞が分化し始めたら、一つだけtiにおけるメディアの50％を置き換えます空気への暴露のような私は、細胞の健康に有害な影響を有することができます。
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Representative Results
in vitroで神経前駆アッセイ、神経発生および神経前駆細胞集団の使用によって特徴づけられ、大人の犬の海馬の背腹軸間で比較しました。文化の28日までに100ミクロンの直径に達し、分離の14日以内のニューロスフェアを浮動形成され孤立した海馬組織由来の神経前駆細胞。背側と腹側の分離株由来のニューロスフェアは、平均サイズに差は認められなかったし、単一細胞への酵素的解離以下、ニューロスフェア培養をフローティングとして継代することができました。両方の海馬領域からの二次浮遊ニューロスフェアは、通路から5日以内に形成することができました。 0.1％のゼラチンコーティングした培養フラスコに1×10 4細胞/ cm 2で播種した場合に、神経前駆細胞はまた、付着性単層（ 図1A）を増殖することができました。形態学的な違いはbetwee認められませんでしたnは背側と腹側海馬神経前駆細胞との両方の接着培養は、いずれかの通過タイム（ 図1B）に減速して観察することなく、10以上の集団倍加を受けることができました。接着培養におけるネスチンとSox2の神経幹細胞の遺伝子発現は、海馬の背腹軸（ 図2）全体で有意差はなかったです。これらの細胞の神経前駆体の同一性を確認する遺伝子およびタンパク質発現のより広範な特徴付けは、我々の公開されたデータ7に報告されています。
適応神経コロニー形成アッセイ4,6を用いて、我々は背全体の神経前駆細胞集団およびイヌ海馬の腹の部分領域における潜在的な差異を定量化するために、神経前駆細胞の頻度を評価しました。細胞は、 図3A（細胞融合を妨げる半固体のコラーゲンマトリックス中でクローン密度で播種し、28日間培養しました。 ANOVA、F = 96.8; P = 0.001; 図3B ）。
分化条件下で、接着イヌ神経前駆細胞は、より長く、より複雑なプロセスを開発し、全体の形態における進行の変化を示しました。神経細胞のタンパク質発現のために（βIIIチューブリン）およびグリア（グリア線維性酸性タンパク質; GFAP）マーカーはまた、分化（ 図4）以下に増加しました。有意差は、背側と腹側の分離株の間で積極的に標識された細胞の数で観察されませんでした。私たちの以前に公開されたデータは、アップレギュレーションそれらに関連する遺伝子の神経のダウンレギュレーションと一緒に実証し、これらのタンパク質の発現の変化を裏付けます 28日間の分化期間7にわたって前駆体遺伝子。
図1：背と腹側海馬の領域から分離された大人の犬の海馬神経前駆細胞のインビトロ拡張で大人犬の海馬神経前駆細胞は、（A）フローティングニューロスフェアとして、または接着単層（B）のように展開されている（C）のように。接着単層これらの神経前駆細胞は、速度を倍増の大幅な下落することなく、10回以上の通過を受ける可能性があります。 N = 5。スケール=50μmです。公開された図7から変更された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図2：増殖する成体イヌ海馬神経前駆細胞における遺伝子発現神経幹細胞の遺伝子の発現（A）ネスチン及び（B）Sox2のが付着増殖培養条件下で成体イヌ海馬神経前駆細胞において確認されました。これらの遺伝子の発現は、背側と腹側海馬由来細胞の両方で同等でした。成体イヌ線維芽細胞は、相対的な遺伝子発現の差を比較するために、制御線として使用しました。 N = 5。エラーバー= SEM。公開された図7から変更された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：神経コロニー形成アッセイ （A）半固体のコラーゲンマトリックス中にクローン密度で播種成体イヌ神経前駆細胞は、培養の28日以内にフォーム神経球（B）背側海馬由来の神経前駆細胞から誘導されるものよりも単位面積当たりの神経球の有意に高い数値を生成します腹側海馬。 N = 5。エラーバー= SEM;スケール=50μmです。公開された図7から変更された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：差別大人犬の海馬神経前駆細胞の免疫細胞化学 28日間BDNFで培養し、背側と腹側海馬の両方から大人犬の神経前駆細胞は、成熟した神経細胞（βIIIチューブリンPOに分化しますsitive）およびグリア（GFAP陽性）細胞タイプ。 N = 5。スケール=50μmです。公開された図7から変更された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明するプロトコルは、細胞生存率を最大にするための好ましい培養条件を維持するように最適化されています。抽出、単離および拡張中に撮影速度とケアが非常に重要です。接着単層の拡大を確立するための重要なステップは、一次ニューロスフェアの有効解離です。通路に続いて、十分に解離したニューロスフェアは、二次浮遊ニューロスフェアを生成することができます。培地交換時には、これらの神経球を取り出し、解離し、接着単層通過のために再播種することができます。後の解離細胞の生存率が80％未満であった場合は、これは、解離時に過剰なピペッティングを示すことができます。神経前駆細胞は、特にそれらの分化の対応では、生理学的範囲の外のpHの変化、および大気への曝露に敏感です。突然の広範囲な細胞死の観察は、これらの要因に起因し得ます。メディアちゃんの間に結果的に、重要なステップGESは、メディアが新たなたびに行わなければ、ボリュームの50％を交換するためのものです。マイトジェン因子EGFおよびbFGFは、in vitro 22,23 で無血清条件下での海馬神経前駆体の生存と増殖を支持しながら、最後に、これらのマイトジェンに対する細胞応答は、細胞の発達年齢と分裂促進濃度24,25に大きく依存しています。したがって、これらのコンポーネントに最小限の実験変動を確保することは、一貫した、再現性の細胞培養物を生成するために重要です。
最大の生存性のために、細胞を6時間死後内培養のために播種する必要があります。しかし、抽出された脳は、一時的に4℃でPBS中に保存してもよいです。この変更は、細胞収率の26,27における最小の減少と最大24時間遅れで表示されるように分離を可能にすることができます。培地の成長因子の補充はまた、増殖を増強するか、differeを促進するために修飾することができます特定の神経細胞型のntiation。分化条件下で、プロ神経因子BDNF 30は 、そのような要因に関連して使用されてもよい（100ng / mlの時）、インスリン様成長因子1は、 インビトロ 28,29 における齧歯類の神経幹細胞の支持効果を有することが示されています（0.1μMで）インターロイキン7（500 ngの/ mlで）またはレチノイン酸のようなニューロンのサブタイプまたはグリア分化31,32の偏りを誘導しました。
浮動ニューロスフェアとして、または接着単層として神経前駆細胞を拡大するかどうかの判断は、主に、所望の下流のアプリケーションや文化の特性に依存します。神経球培養系は、単純かつ高度に再現可能であるが、それは、細胞の均一な集団を生成する能力が制限されます。担当者ながら、各球体内での複雑な微小環境は、不均一な集団33を奨励し 、アポトーシスと自発的な分化を促進することができます神経前駆細胞集団34の定量化を混乱することができ、神経球の融合をorted。また、神経球通過のために必要な繰り返しの機械的解離はまた、有害なストレス、老化、あるいは細胞死につながる可能性があります。代替解離酵素の使用は、例えば、パパインのように、得られた細胞生存率16に影響を与え得ます。逆に、接着単層培養系は、環境マイトジェンに対するより均一な露出で、細胞の種類や、より対称的な部門で大きな均一性を奨励しています。このシステムは、主要な幹細胞マーカー35,36の発現に基づいて細胞のニッチの独立した集団を産生することが示されています。このシステムは、細胞接着を促進するために、予めコーティングされた培養容器の使用を必要とします。それは、培養神経前駆体25,37の分化プロファイルに大きな影響を与えることがあるよう培養基材の選択は慎重に、考慮すべきです。
HERE我々は、新鮮な死後の組織から大人犬の海馬神経前駆細胞の単離、拡大および分化のための効果的なプロトコルを提示します。大人の犬の神経前駆体は、文献18に過小表現されます。それらの単離および拡張のための完全なプロトコル、さらに少ないので、17で。私たちのプロトコルは、この貴重な動物モデルの認知度を高め、研究のこのささやかな数の重要な追加を表すために働くことができます。重要なのは、私たちのユニークな方法を使用して、大人の犬の海馬神経前駆細胞が正常に10以上の集団倍加を拡張することができます。直径150μmの、第五世代の17を超えて増殖を停止した-大人の犬の海馬の神経前駆体を用いて同様の研究は、100で継代より大きなニューロスフェアは、と報告しました。我々のプロトコルで述べたように、過度のニューロスフェアの成長が連続継代にわたってリットルを有していてもよい、自発的分化とアポトーシスを促進することができますこれにedは増殖能を低下させました。我々はまた、古典的なニューロスフェア拡張システム17-21の代替として、この細胞集団の接着単層拡大のためのプロトコルを提供します。この代替システムは、細胞環境を介してユーザより多くの制御を提供し、大幅に表現型の均質化と向かう神経分化35,38のための潜在的に、これらの細胞のための下流のアプリケーションの範囲を広げます。
培養された成体イヌ海馬神経前駆細胞は、細胞と神経生物学研究分野の幅広い用途を有します。犬の脳は、既存のげっ歯類モデルよりも人間の脳に近い相同性を有しています。このように、成体イヌの神経前駆細胞が重要な、未だunderstudied、リソースを表します。これらの細胞は、ヒトの成体の神経発生の背後にあるメカニズムに、そのTARG再生治療の開発のためのさらなる洞察を得るために使用することができますら、このプロセス。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 μl filtered pipette tip | Axygen | TF1000 | |
| 150 mm Petri dish | BD Biosciences | 351058 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 200 μl filtered pipette tip | Axygen | TF200 | |
| 24 well culture plate | Greiner Bio One | 662160 | |
| 35 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353001 | |
| 40 µm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 6 well culture plate | BD Biosciences | 351146 | |
| B-27 Supplement (50x) serum free | Life Technologies | 17504044 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | 13256029 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Millipore | GF029 | |
| Collagen solution | Stem Cell Technologies | 04902 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| DMEM (4.5 g/L, D-glucose) 500 ml | Life Technologies | 11960044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | BD Biosciences | 354001 | |
| F-12 nutrient mixture (Ham) (1x) Liquid | Life Technologies | 31765035 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 16141079 | |
| Gelatin from Porcine Skin Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide (GlutaMAX) | Life Technologies | 35050061 | |
| Heparin sodium salt from (porcine) | Sigma-Aldrich | H314950KU | |
| Laminin (mouse) | Life Technologies | 23017015 | |
| NCFC serum free medium (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5720 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| Proliferation NS-A (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 05773 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit Cat: 05740, and NS-A Prolieration Kit (Rat) Cat: 05771 from Stem Cell Technologies. |
| NSC basal medium (Rat; NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5770 | Also available in the Neurocult NS-A Prolieration Kit (Rat) from Stem Cell Technologies. Cat: 05771 |
| Penicillin/Streptomycin (5,000 U/ml) | Life Technologies | 15070063 | |
| Povidone-iodine | Munipharma | Betadine | |
| Trypan blue (0.4%) | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| Class II biological safety cabinet | ThermoFisher Scientific | Safe 2020 1.2 | |
| Brain knife (disposable) | Macroknife | ||
| Cell culture incubator | ThermoFisher Scientific | HERAcell 150i | |
| Centrifuge | Hettich | Universal 320R | |
| Dumont #5 Forceps | Dumont | ||
| Easypet Electric pipette | Eppindorf | ||
| Hemocytometer | Boeco | Bright-Line Improved Neubauer | |
| Manual pipettes | Eppindorf research | ||
| Oscillating bone saw | |||
| Scalpel blades (No.21) | Paramount | ||
| Scissors | Delta | ||
| Water bath | Grant | JB Aqua 18 plus |
References
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