Summary
Le cerveau canin est un modèle précieux pour étudier la neurogenèse adulte. Présenté ici sont des protocoles d'isolement et de l'expansion des cellules adultes canines hippocampiques précurseurs neurales à partir de tissus du cerveau primaire.
Protocol
Conformément à la Nouvelle - Galles du Sud, la loi l' Australie, le tissu mortem du cerveau poste a été acquis auprès de chiens adultes euthanasiés pour des raisons non liées à l'étude.
1. Préparation du milieu de culture
- Préparer une solution de gélatine à 0,1% par addition de 0,1 g de poudre de gélatine dans 100 ml d'eau distillée et on agite à 37 ° C jusqu'à dissolution. Stériliser la solution par irradiation UV pendant 15 min. Ce support peut alors être stocké à 4 ° C pendant jusqu'à 1 mois.
- Préparer un rapport de 3: 1 de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) et le mélange nutritif F12 par addition de 167 ml de F-12 à 500 ml de DMEM (4,5 g / L de D-glucose). Ajouter 6,7 ml d'une solution de pénicilline / streptomycine (pour une concentration finale de 1%). Ce média peut être stockée dans l'obscurité à 4 ° C pendant jusqu'à 1 mois.
- Préparer 500 ml de milieu sérique en combinant 440 ml de DMEM (4,5 g / L de D-glucose), 5 ml de L-alanyl-L-glutamine dipeptide (200 mM), 5 ml de pénicilline / streptomycine et 50 ml de bovin fœtale sérum (FBS). Ce média peut être stockée dans l'obscurité à 4 ° C pendant jusqu'à 1 mois.
- milieu de croissance complet est constitué de cellules souches neurales (NSC) Basal Medium et la prolifération neuronale Supplement-A (NS-A), 2% de FBS, 2 pg / ml d'héparine, 20 ng / ml de facteur de croissance épidermique (EGF) et 10 ng / ml facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF). Faire de ce milieu frais, immédiatement avant dissection du cerveau, et chaud à 37 ° C dans un bain d'eau.
2. Extraction du cerveau
- Commencez l' extraction dans les 6 heures post - mortem par la stérilisation de la surface dorsale de la tête du chien en utilisant povidone-iode.
- À l'aide d'un scalpel, une incision longitudinale le long de la ligne médiane sagittal à travers la surface dorsale entière du crâne, pour exposer les masséters sous-jacents. La longueur de cette coupe dépendra de l'espèce et l'âge du chien.
- Aux frontières rostrale et caudale du crâne, faire encore 5 - 10 cm coupes perpendiculaires des deux côtés, passering derrière les yeux et les oreilles, respectivement, pour permettre à la peau d'être pleinement pris en compte.
- À l'aide d'un scalpel, séparer les masséters de leur attachement à la crête sagittale du crâne et de racler tout tissu conjonctif restant dans la boîte crânienne.
- L'utilisation d'un os oscillante de scie le bouchon du crâne dans une ligne circonférentielle. En utilisant une sonde ou d'un scalpel de rompre toutes les pièces jointes restantes avec la dure-mère, puis retirez soigneusement la calotte crânienne pour exposer la surface dorsale du cerveau.
Attention: L'épaisseur de l'os varie à différentes régions dans le crâne, donc il faut être prudent de ne pas pénétrer trop profondément et endommager le cerveau sous - jacent. - Sectionner la moelle épinière par l'insertion d'un scalpel entre les vertèbres cervicales supérieures.
- Avec une main pour soulever délicatement le cerveau, utiliser un scalpel pour libérer soigneusement le cerveau de la fosse crânienne et de rompre les nerfs de liaison et les vaisseaux sanguins situés sur sa face ventrale. Soulevez doucement le bla pluie sur le crâne et dans un récipient de DPBS.
Attention: Les gros bulbes olfactifs du cerveau canin peuvent pénétrer profondément dans la fosse crânienne antérieure. Des précautions doivent être prises lors de l'élimination du cerveau de manière à préserver ces structures.
3. hippocampique Dissection
- Rincer le cerveau dans un tampon phosphate solution saline de Dulbecco (DPBS) pour éliminer toute trace de sang et placez-le côté dorsal vers le bas sur un plat de 150 mm de Pétri.
- bisect lentement le cerveau longitudinalement à travers le plan sagittal médian à l'aide d'un couteau de cerveau humide et une seule tranche qui utilise toute la longueur de la lame. Ne pas appliquer une pression supplémentaire à la baisse, ou utiliser un mouvement de scie, car cela pourrait endommager le tissu.
- Placer chaque médiale de l'hémisphère surface jusqu'à, disséquer l'hippocampe en utilisant un scalpel et une pince fine, et de le transférer à une boîte de culture tissulaire de 35 mm.
4. Isolement de cellules neurales précurseurs
- Émincer le téchantillons d'émission à l' aide d' une lame de scalpel dans environ 1 mm 3 pièces.
- Transférer le tissu dans un tube de 15 ml, ajouter 2 ml de trypsine à 0,1% d'EDTA, et laisser incuber pendant 7 minutes dans un bain-marie à 37 ° C.
- Mettre un terme à la réaction enzymatique par addition de 4 ml de milieu de sérum dans le tube. Pellet la suspension par centrifugation à 100 xg pendant 7 minutes et retirer le surnageant.
- Resuspendues le culot dans 300 ul de DPBS, et dissociées mécaniquement par pipetage de haut en bas, en utilisant une pointe de pipette de 1000 pi, jusqu'à l'obtention d'homogénat lisses.
- Ajouter 14 ml de milieu de sérum dans le tube et passer la suspension de cellules à travers un tamis cellulaire de 40 pm. Sédimenter la suspension par centrifugation à 100 g pendant 7 minutes, éliminer le surnageant et remettre en suspension dans un milieu de croissance complet.
5. Neurosphère Culture
- De la suspension cellulaire obtenue à l'isolement, compter le nombre de cellules viables en utilisant l'exclusion Trypan de colorant bleu et un hémocytomètre.
- Diluer la suspension de cellules dans un milieu de croissance complet et de graines à 1 x 10 5 cellules / cm 2 dans des puits non revêtus d'une plaque à 6 puits.
- Incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 et> 95% d' humidité pendant 14 - 28 jours, à remplacer 50% du milieu de croissance tous les 7 jours. Mesurer le diamètre des neurosphères régulièrement. Si on les laisse croître au-delà de 100 um de diamètre, la mort cellulaire et la différenciation spontanée peut se produire à l'intérieur des neurosphères.
6. Neurosphère Passage
- Pour passage comme une culture flottante, lorsque les neurosphères atteignent environ 100 m de diamètre, combiner tous les médias Neurosphère contenant en un seul tube. Pellet par centrifugation à 100 xg pendant 7 minutes et retirer le surnageant.
- Remettre en suspension le culot dans 1 ml de trypsine à 0,1% d'EDTA et laisser incuber pendant 7 minutes dans un bain-marie à 37 ° C. pipette doucement monter et descendre 100 fois, en utilisant une pointe de pipette 200 pi, pour assurer dissociatisur des neurosphères.
- Mettre un terme à la réaction enzymatique en ajoutant 5 ml de milieu de sérum dans le tube et centrifuger à 100 g pendant 7 min.
- Retirer le surnageant, resuspendre le culot cellulaire dans 1 ml de milieu de croissance complet et compter le nombre de cellules viables en utilisant un colorant bleu Trypan exclusion et un hémocytomètre.
- Diluer la suspension de cellules dans un milieu de croissance complet et de graines à 1 x 10 5 cellules / cm 2 dans des puits non revêtus d'une plaque à 6 puits. Incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 et> 95% d' humidité pendant 14 - 28 jours, en remplaçant 50% des milieux de croissance tous les 7 jours.
7. Adhérent Culture de cellules neurales Précurseurs
- Ajouter un volume suffisant de solution de gélatine à 0,1% pour couvrir la surface d'une boîte de culture tissulaire et le durcissement dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 h avant le traitement des neurosphères pour la culture adhérente.
- De la culture de neurosphères flottante, combiner tous les médias en un seul tube. Pellet neurospheres par centrifugation à 100 xg pendant 7 min et retirer le surnageant.
- Remettre en suspension le culot dans 1 ml de trypsine à 0,1% d'EDTA et laisser incuber pendant 7 minutes dans un bain-marie à 37 ° C. pipette doucement monter et descendre 100 fois, en utilisant une pointe de pipette de 200 pi.
- Ajouter 5 ml de milieu de sérum pour stopper la réaction enzymatique et centrifuger à 100 g pendant 7 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de milieu de croissance complet et compter le nombre de cellules viables en utilisant un colorant bleu Trypan exclusion et un hémocytomètre.
- Diluer la suspension de cellules dans un milieu de croissance complet, retirer la gélatine à partir des flacons de culture de tissus et ensemencer les cellules à 1 x 10 4 cellules / cm 2.
- Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO 2 et> 95% d' humidité. Remplacer les médias avec les milieux de croissance frais, réchauffé, complète tous les trois jours jusqu'à ce que la culture atteint environ 80% de confluence (après environ 7 jours).
8. Neural Colony Forming Assay
- Combinez Neural formant des colonies cellulaires composants de médias (NCFC) Dosage: milieu sérique NCFC libre, prolifération NS-A, et une solution de collagène (3 mg / ml). Supplément ce média avec 2 pg / ml d'héparine, 20 ng / ml d'EGF, et 10 ng / ml de bFGF.
- Après la dissociation du tissu hippocampique remettre en suspension les cellules dans la colonie de neurones formant un milieu d'essai, préchauffée à 37 ° C dans un bain d'eau. Ensemencer les cellules à une densité clonale de 1,1 x 10 5 cellules / ml dans une boîte de culture de 35 mm.
- Incuber les cellules de cette matrice de collagène semi-solide à 37 ° C, 5% de CO 2 et> 95% d' humidité. La culture pendant 28 jours, en remplaçant 50% du milieu de croissance tous les 7 jours.
9. Différenciation des cellules Neural Précurseurs
- Ajouter un volume suffisant de 5 ug / cm2 solution de laminine pour couvrir la surface d'une boîte de culture tissulaire et le durcissement dans un incubateur à 37 ° C pendant 24 h avant le traitement des cellules pour la différenciationtion.
Remarque: Retirez la solution de laminine et rincer la surface revêtue à deux reprises en DPBS immédiatement avant l'ensemencement. - Lorsque repiquage, ensemencer la suspension cellulaire à 1 x 10 4 cellules / cm 2 dans DMEM-F12 (3: 1) les médias (préchauffé à 37 ° C) additionné de 20 ng / ml d' EGF et 40 ng / ml de bFGF sur la laminine enduit plat de culture.
- Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO 2 et> 95% d' humidité et permettent aux cellules de proliférer pendant 3 jours.
- Pour différencier les cellules précurseurs neurales adhérentes, après 3 jours remplacent les médias avec les médias de différenciation contenant DMEM-F12 (3: 1) les médias pré-chauffé à 37 ° C, additionné de 10 ng / cerveau ml facteur neurotrophique dérivé (BDNF).
- Au cours de la différenciation de remplacer 50% du milieu tous les 3 jours. Différenciation se produit progressivement sur environ 21-28 jours.
Attention: Une fois que les cellules ont commencé à se différencier, remplacer seulement 50% des médias à une timoi comme l'exposition à l'air peut avoir un effet néfaste sur la santé des cellules.
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Representative Results
Grâce à l'utilisation de précurseurs neuronaux in vitro, des dosages in neurogenèse et des populations de cellules précurseurs neurales ont été caractérisées et comparées à travers l'axe dorso - ventral de l'adulte hippocampe canine. cellules précurseurs neurales dérivées de tissu hippocampique isolé formé neurosphères flottant dans les 14 jours d'isolement, atteignant un diamètre de 100 um par 28 jours de culture. Neurosphères dérivées des nageoires dorsale et ventrale isolats présentaient pas de différence de taille moyenne, et suite à la dissociation enzymatique en cellules individuelles, peuvent être soumises à des passages sous forme de cultures de neurosphères flottant. neurosphères flottantes secondaires des deux régions hippocampiques ont pu former dans les 5 jours de passage. Quand ensemencées à 1 x 10 4 cellules / cm 2 sur 0,1% de gélatine revêtues des flacons de culture, des cellules précurseurs neurales ont également été capables de proliférer en monocouches adhérentes (figure 1A). Aucune différence morphologique n'a été observé between dorsale et les cellules ventrales précurseurs neurales hippocampiques et les deux cultures adhérentes ont pu subir plus de 10 doublements de population sans observés ont ralenti au passage du temps (figure 1B). Nestin et Sox2 expression génique des cellules souches neurales dans la culture adhérente n'a pas été significativement différente à travers l'axe dorso - ventral hippocampique (figure 2). Plus vaste caractérisation des gènes et l' expression des protéines, ce qui confirme le précurseur identité neurale de ces cellules, est rapporté dans nos données publiées 7.
L' utilisation d' un Neural Colony Forming dosage adapté 4,6 nous avons évalué neuronal précurseur fréquence cellulaire afin de quantifier les différences potentielles dans les populations de cellules précurseurs neurales à travers la partie dorsale et sous - régions ventrales de l'hippocampe canine. Les cellules ont été ensemencées à une densité clonale dans un état semi-solide une matrice de collagène qui empêche la fusion cellulaire, et cultivées pendant 28 jours (figure 3A F = 96,8, p = 0,001; figure 3B ).
Dans des conditions de différenciation, les cellules adhérentes précurseurs neurales canine ont montré des altérations progressives dans la morphologie générale, le développement plus long et des processus plus élaborés. L' expression des protéines pour neuronal (BIII-tubuline) et gliale (protéine acide fibrillaire gliale; GFAP) marqueurs a également augmenté suivant la différenciation (figure 4). Aucune différence significative observée dans le nombre de cellules marquées positivement entre les nageoires dorsale et ventrale isolats. Nos données publiées précédemment corrobore ces changements d'expression de protéines, ce qui démontre la régulation de leurs gènes associés ainsi que la régulation des neurones les gènes précurseurs pendant la période de différenciation 7 à 28 jours.
Figure 1:. En expansion in vitro de cellules adultes Canine hippocampique Neural Précurseurs adultes canine cellules précurseurs neurales hippocampiques isolées de la dorsale et les régions hippocampiques ventrales sont développés comme (A) neurosphères flottantes ou (B) une monocouche adhérente (C) En tant. monocouche adhérente ces cellules précurseurs neurales pourraient subir le passage de plus de 10 fois sans baisse significative de la vitesse de doublement. n = 5; échelle = 50 pm. Modifié de chiffre publié 7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 2:. Gene Expression dans les cellules proliférantes Adulte Canine hippocampique Neural Précurseurs Expression des gènes de cellules souches neurales (A) Nestin et (B) Sox2 a été confirmé dans les cellules adultes canines hippocampiques neurales précurseurs dans des conditions de culture prolifératives adhérentes. L'expression de ces gènes a été équivalente dans les deux dorsales et des cellules de l'hippocampe ventral dérivé. fibroblastes canines adultes ont été utilisés comme une ligne de commande pour comparer les différences dans l'expression relative des gènes. n = 5; barres d'erreur = SEM. Modifié de chiffre publié 7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Assay Neural Formant Colonie (A)Adultes des cellules canines neurales précurseurs, ensemencées à une densité clonale dans une matrice de collagène semi-solide, forme neurosphères dans les 28 jours de culture. (B) des cellules précurseurs neurales dérivées de l'hippocampe dorsal génèrent beaucoup plus grand nombre de neurosphères par unité de surface que celles dérivées de l'hippocampe ventral. n = 5; barres d'erreur = SEM; échelle = 50 pm. Modifié de chiffre publié 7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Immunocytochimie de cellules différenciées adultes Canine hippocampique Neural Précurseurs Lorsqu'elle est cultivée en BDNF pendant 28 jours, adultes canine précurseurs neuraux à la fois la partie dorsale et de l' hippocampe ventral se différencient en neurones matures (po BIII-tubulinesitif) et gliales (types de cellules positive) GFAP. n = 5; échelle = 50 pm. Modifié de chiffre publié 7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les protocoles décrits ici sont optimisés pour maintenir des conditions de culture favorables pour maximiser la viabilité cellulaire. La vitesse et les soins pris lors de l'extraction, l'isolement et l'expansion est d'une importance critique. Une étape cruciale pour établir l'expansion de monocouche adhérente est la dissociation effective des neurosphères primaires. Après passage, insuffisamment dissociées neurosphères peuvent générer des neurosphères secondaires flottants. Pendant le changement des médias, ces neurosphères peuvent être enlevés, dissociés et réensemencées pour adhérente passage monocouche. Inversement, si la viabilité des cellules post-dissociation est inférieure à 80%, cela peut être une indication de pipetage excessive pendant la dissociation. cellules précurseurs neurales, et en particulier leurs homologues différenciés, sont sensibles aux changements de pH en dehors de la gamme physiologique, et l'exposition à l'air. L'observation de la mort cellulaire généralisée soudaine peut être attribuable à ces facteurs. Par conséquent, une étape critique au cours des médias changements est pour les médias à être frais à chaque fois, et pour seulement 50% du volume à remplacer. Enfin, alors que les facteurs mitogenes EGF et bFGF , la survie et la prolifération des neurones hippocampiques précurseurs dans des conditions exemptes de sérum in vitro 22,23, la réponse cellulaire à ces mitogenes est fortement dépendant de l'âge du développement cellulaire et de la concentration mitogene 24,25. Par conséquent, en assurant un minimum de variation expérimentale de ces composants est crucial pour la génération, les cultures cellulaires et reproductible.
Pour une viabilité maximale, les cellules doivent être ensemencées pour la culture dans les 6 heures post mortem. Toutefois, le cerveau extrait peut être stocké temporairement dans du PBS à 4 ° C. Cette modification peut permettre l' isolement d'être retardé jusqu'à 24 heures avec une réduction minimale du rendement des cellules 26,27. le facteur de croissance complémentation des milieux de culture peut également être modifiée pour améliorer la prolifération ou pour favoriser la différentiation de types spécifiques de cellules neurales. Insulin-like growth factor 1 (à 100 ng / ml) a été établi pour avoir un effet favorable sur les cellules souches de rongeurs neuronale in vitro , 28,29, tandis que dans la différenciation des conditions facteur pro-neuronale BDNF 30 peut être utilisé conjointement avec des facteurs tels comme interleukine 7 (à 500 ng / ml) ou de l' acide rétinoïque (à 0,1 M) pour induire une polarisation vers le sous - type ou de la différenciation neuronale de cellules gliales 31,32.
La décision d'étendre les cellules précurseurs neurales comme neurosphères flottant ou comme une monocouche adhérente dépend en grande partie sur les applications en aval désirées et les caractéristiques de la culture. Bien que le système de culture de neurosphères est simpliste et hautement reproductibles, il est limité dans sa capacité à générer des populations homogènes de cellules. Le microenvironnement complexe dans chaque sphère peut favoriser l' apoptose et la différenciation spontanée, encourager une population hétérogène 33, tandis que repla fusion des neurosphères signalés auparavant qui peut confondre la quantification des populations de cellules précurseurs neurales 34. En outre, la dissociation mécanique répétée requise pour Neurosphère passage peut aussi conduire à un stress néfaste, sénescence ou même la mort cellulaire. L'utilisation d'autres enzymes de dissociation, telle que la papaïne, peut affecter la viabilité cellulaire résultante 16. A l'inverse, le système de culture en monocouche adhérente, avec une exposition plus uniforme aux mitogenes environnementales, favorise une plus grande homogénéité dans le type et la division cellulaire plus symétrique. Ce système a été montré pour produire une population indépendante du créneau de cellules, sur la base de l'expression de marqueurs principaux de cellules souches 35,36. Ce système nécessite l'utilisation de récipients de culture pré-enduits pour promouvoir l'adhésion cellulaire. Le choix du substrat de culture doit être soigneusement pris en considération, car elle peut avoir des effets significatifs sur le profil de la différenciation des précurseurs neuronaux de culture 25,37.
Havant que nous présentons des protocoles efficaces pour l'isolement, l' expansion et la différenciation des cellules adultes canines hippocampiques précurseurs neurales à partir de tissus post-mortem frais. Adultes précurseurs neuronaux canine sont sous-représentées dans la littérature 18; avec des protocoles complets pour leur isolement et d' expansion, encore moins 17. Nos protocoles peuvent alors servir à mieux faire connaître ce modèle animal précieux et représentent un ajout important à ce petit nombre d'études. D'importance, en utilisant notre méthode unique, les précurseurs neuronaux hippocampiques canines adultes peuvent être développés avec succès plus de 10 doublements de population. Une étude similaire en utilisant un précurseur neuronal hippocampique canine adulte a rapporté que les grandes neurosphères, à des passages à 100 - 150 m de diamètre, ont cessé la prolifération au - delà de la cinquième génération 17. Comme indiqué dans notre protocole, la croissance Neurosphère excessive peut encourager la différenciation spontanée et l'apoptose, dont plus de passage en série peut avoir led à ce qui a réduit la capacité proliférative. Nous fournissons également un protocole pour l' expansion monocouche adhérente de cette population cellulaire, comme une alternative au système d'extension de neurosphères classique 17-21. Ce système alternatif offre à l'utilisateur plus de contrôle sur l'environnement cellulaire, et élargit considérablement la gamme des applications en aval de ces cellules, avec un potentiel d'homogénéisation phénotypique et la différenciation neuronale dirigée 35,38.
cellules adultes Cultured canine hippocampiques précurseurs neurales ont des applications dans un large éventail de domaines de recherche cellulaire et neurobiologiques. Le cerveau canin possède une homologie plus proche du cerveau humain que les modèles rongeurs existants. En tant que tel, les cellules précurseurs neurales adultes canine représentent un élément important, encore understudied ressource. Ces cellules peuvent être utilisées pour mieux comprendre les mécanismes derrière la neurogenèse adulte chez l'homme, et pour le développement de thérapies régénératrices qui target ce processus.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 μl filtered pipette tip | Axygen | TF1000 | |
| 150 mm Petri dish | BD Biosciences | 351058 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 200 μl filtered pipette tip | Axygen | TF200 | |
| 24 well culture plate | Greiner Bio One | 662160 | |
| 35 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353001 | |
| 40 µm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 6 well culture plate | BD Biosciences | 351146 | |
| B-27 Supplement (50x) serum free | Life Technologies | 17504044 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | 13256029 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Millipore | GF029 | |
| Collagen solution | Stem Cell Technologies | 04902 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| DMEM (4.5 g/L, D-glucose) 500 ml | Life Technologies | 11960044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | BD Biosciences | 354001 | |
| F-12 nutrient mixture (Ham) (1x) Liquid | Life Technologies | 31765035 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 16141079 | |
| Gelatin from Porcine Skin Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide (GlutaMAX) | Life Technologies | 35050061 | |
| Heparin sodium salt from (porcine) | Sigma-Aldrich | H314950KU | |
| Laminin (mouse) | Life Technologies | 23017015 | |
| NCFC serum free medium (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5720 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| Proliferation NS-A (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 05773 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit Cat: 05740, and NS-A Prolieration Kit (Rat) Cat: 05771 from Stem Cell Technologies. |
| NSC basal medium (Rat; NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5770 | Also available in the Neurocult NS-A Prolieration Kit (Rat) from Stem Cell Technologies. Cat: 05771 |
| Penicillin/Streptomycin (5,000 U/ml) | Life Technologies | 15070063 | |
| Povidone-iodine | Munipharma | Betadine | |
| Trypan blue (0.4%) | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| Class II biological safety cabinet | ThermoFisher Scientific | Safe 2020 1.2 | |
| Brain knife (disposable) | Macroknife | ||
| Cell culture incubator | ThermoFisher Scientific | HERAcell 150i | |
| Centrifuge | Hettich | Universal 320R | |
| Dumont #5 Forceps | Dumont | ||
| Easypet Electric pipette | Eppindorf | ||
| Hemocytometer | Boeco | Bright-Line Improved Neubauer | |
| Manual pipettes | Eppindorf research | ||
| Oscillating bone saw | |||
| Scalpel blades (No.21) | Paramount | ||
| Scissors | Delta | ||
| Water bath | Grant | JB Aqua 18 plus |
References
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