Summary
De hond hersenen is een waardevol model waarin volwassen neurogenese bestuderen. hier gepresenteerde zijn protocollen voor het isoleren en het uitbreiden van volwassen honden hippocampus neurale voorlopercellen uit primaire hersenweefsel.
Protocol
In overeenstemming met New South Wales, Australië wet, werd post-mortem hersenweefsel verkregen van volwassen honden gedood om redenen die niets met het onderzoek.
1. Voorbereiding van Cultuur Medium
- Bereid een 0,1% gelatine-oplossing door toevoeging van 0,1 g gelatine poeder aan 100 ml gedestilleerd water en roeren bij 37 ° C totdat opgelost. Steriliseer de oplossing door UV-bestraling gedurende 15 minuten. Dit medium kan vervolgens tot 1 maand opgeslagen bij 4 ° C.
- Bereid een 3: 1 verhouding van Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) en voedingsmengsel F12 door toevoeging van 167 ml F-12 aan 500 ml DMEM (4,5 g / l D-glucose). Voeg 6,7 ml van penicilline / streptomycine-oplossing (voor een 1% eindconcentratie). Dit medium kan maximaal 1 maand bewaard in het donker bij 4 ° C.
- Bereid 500 ml serum medium door het combineren 440 ml DMEM (4,5 g / l D-glucose), 5 ml van L-alanyl-L-glutamine dipeptide (200 mM), 5 ml penicilline / streptomycine en 50 ml foetaal Bovine serum (FBS). Dit medium kan maximaal 1 maand bewaard in het donker bij 4 ° C.
- Compleet groeimedium bestaat uit neurale stamcel (NSC) basismedium en proliferatie Neural Supplement-A (NS-A), 2% FBS, 2 ug / ml heparine, 20 ng / ml epidermale groeifactor (EGF) en 10 ng / ml basische fibroblastgroeifactor (bFGF). Deze media vers onmiddellijk vóór hersenen dissectie en warm tot 37 ° C in een waterbad.
2. Brain Extraction
- Begin extractie binnen 6 uur na het slachten door het steriliseren van het dorsale oppervlak van het hoofd van de hond met behulp van povidonjood.
- Met behulp van een scalpel een longitudinale incisie langs de middellijn sagittale, over het gehele dorsale oppervlak van de schedel, de onderliggende kauwspieren bloot. De lengte van deze verlaging is afhankelijk van de soort en de leeftijd van de hond.
- Bij de rostrale en caudale grenzen van de schedel, maakt nog eens 5 - 10 cm loodrecht snijdt aan beide kanten, passerening achter de ogen en oren respectievelijk, zodat de huid volledig wordt gereflecteerd.
- Met behulp van een scalpel, scheiden de kauwspieren van hun gehechtheid aan de sagittale top van de schedel en schraap alle resterende bindweefsel van de schedel.
- Met behulp van een oscillerende bot zaagsnede de dop van de schedel in een rondlopende lijn. Met behulp van een probe of scalpel verbreken resterende bijlagen met de dura en verwijder voorzichtig de schedel dop op het dorsale oppervlak van de hersenen bloot.
Voorzichtig: De dikte van het bot varieert in verschillende gebieden in de schedel, zodat voorzichtigheid is geboden om niet te diep binnendringen en schade aan de onderliggende hersenen. - Sever het ruggenmerg door het met een scalpel tussen de bovenste halswervels.
- Met één hand de hersenen til Gebruik een scalpel zorgvuldig vrij de hersenen uit de craniale fossa en verbreken de verbindende zenuwen en bloedvaten op de buikzijde. Til de bregen uit de schedel en in een container van DPBS.
Let op: De grote olfactorische bollen van de hond hersenen kan diep uit te breiden in de voorste schedelgroeve. Voorzichtigheid is geboden bij het verwijderen van de hersenen om deze structuren te behouden.
3. hippocampus Dissection
- Spoel de hersenen in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) op alle bloed te verwijderen en plaats het dorsale zijde naar beneden op een 150 mm petrischaal.
- halveren langzaam de hersenen longitudinaal door de sagittale middenvlak met een natte hersenen mes en een segment dat de volledige lengte van het blad gebruikt. Geen extra neerwaartse druk niet van toepassing, of gebruik een zagende beweging, omdat dit het weefsel kan beschadigen.
- Het plaatsen van elk halfrond mediale oppervlakte up, ontleden uit de hippocampus met behulp van een scalpel en fijne tang, en overbrengen naar een 35 mm weefselkweek schotel.
4. Isolatie van neurale precursoren
- Hak de tkwestie monsters met behulp van een scalpel in ongeveer 1 mm 3 stuks.
- Breng het weefsel in een 15 ml buis, voeg 2 ml 0,1% trypsine EDTA en incubeer gedurende 7 min in een waterbad bij 37 ° C.
- Stop de enzymreactie door toevoeging van 4 ml serum medium aan de buis. Pellet de schorsing door centrifugeren bij 100 xg gedurende 7 minuten en verwijder het supernatant.
- Geresuspendeerd de pellet in 300 gl DPBS en mechanisch gedissocieerd door zachtjes en neer te pipetteren met behulp van een 1000 pi pipetpunt, tot een gladde homogenaat vormen.
- Voeg 14 ml van serum media aan de buis en laat de celsuspensie door een 40 um cel zeef. Pellet de schorsing door centrifugeren bij 100 xg gedurende 7 min, de bovenstaande vloeistof, en resuspendeer in compleet groeimedium.
5. neurosfeercultuur
- Van de celsuspensie verkregen bij isolatie, tel het aantal levensvatbare cellen met behulp van trypan blauw kleurstof uitsluiting en een hemocytometer.
- Verdun de celsuspensie volledig groeimedium en zaad van 1 x 10 5 cellen / cm2 in wells zonder deklaag van een plaat met 6 putjes.
- Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 en> 95% vochtigheid gedurende 14-28 dagen vervangen 50% van de groeimedia elke 7 dagen. Meet de diameter van de neurosferen regelmatig. Indien toegestaan te groeien dan 100 urn diameter, kan celdood en spontane differentiatie plaatsvinden binnen de neurosferen.
6. Neurosfeer Passage
- Om passage zwevend cultuur, wanneer de neurosferen verwachting ongeveer 100 urn in diameter, combineren alle neurosphere bevattende media in een enkele buis. Pellet door centrifugatie bij 100 xg gedurende 7 min en de bovenstaande vloeistof.
- Resuspendeer de pellet in 1 ml 0,1% trypsine EDTA en incubeer gedurende 7 min in een waterbad bij 37 ° C. Voorzichtig pipet op en neer 100 keer, met behulp van een 200 ul pipet tip om ervoor te zorgen dissociatiop de neurosferen.
- Stop de enzymreactie door toevoeging van 5 ml serum medium aan de buis en centrifugeer bij 100 xg gedurende 7 min.
- Verwijder het supernatant, resuspendeer de celpellet in 1 ml compleet kweekmedium en tel het aantal levensvatbare cellen met behulp van trypan blauw kleurstof uitsluiting en een hemocytometer.
- Verdun de celsuspensie volledig groeimedium en zaad van 1 x 10 5 cellen / cm2 in wells zonder deklaag van een plaat met 6 putjes. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 en> 95% vochtigheid gedurende 14-28 dagen vervangen 50% van de groeimedia elke 7 dagen.
7. hechtende Cultuur van neurale precursoren
- Voeg een voldoende hoeveelheid van 0,1% gelatine-oplossing op het oppervlak van een weefselkweekplaat en genezen in een incubator betrekking op 37 ° C gedurende 1 uur vóór de verwerking voor neurosferen hechtende kweek.
- Van de drijvende neurosfeercultuur combineren alle media in een enkele buis. Pellet de neurospheres door centrifugatie bij 100 xg gedurende 7 min en de bovenstaande vloeistof.
- Resuspendeer de pellet in 1 ml 0,1% trypsine EDTA en incubeer gedurende 7 min in een waterbad bij 37 ° C. Voorzichtig pipet op en neer 100 keer, met behulp van een 200 ul pipetpunt.
- Voeg 5 ml serum media om de enzymreactie en centrifugeer bij 100 xg gedurende 7 min stoppen. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 1 ml compleet groeimedium en tel het aantal levensvatbare cellen met behulp van trypan blauwe kleurstof uitsluiting en een hemocytometer.
- Verdun de celsuspensie volledig groeimedium verwijderen van de gelatine weefselkweek kolven en zaden de cellen bij 1 x 10 4 cellen / cm2.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO 2 en> 95% vochtigheid. Vervang het medium met vers, verwarmd, compleet kweekmedium per drie dagen tot de kweek ongeveer 80% confluentie (na ongeveer 7 dagen) bereikt.
8. Neural Colony Forming Assay
- Combineer neurale Colony Forming Cell (NCFC) Test media componenten: NCFC serumvrij medium, Proliferatie NS-A en collageen oplossing (3 mg / ml). Deze media aangevuld met 2 ug / ml heparine, 20 ng / ml EGF en 10 ng / ml bFGF.
- Na hippocampus weefsel dissociatie Resuspendeer de cellen in neuraal kolonievormende testmedium, voorverwarmd tot 37 ° C in een waterbad. Zaad van de cellen bij een klonale dichtheid van 1,1 x 10 5 cellen / ml in een 35 mm cultuur schotel.
- Incubeer de cellen zich halfvaste collageenmatrix bij 37 ° C, 5% CO 2 en> 95% vochtigheid. Cultuur gedurende 28 dagen, 50% vervanging van de groeimedia elke 7 dagen.
9. Differentiatie van neurale precursoren
- Voeg een voldoende hoeveelheid van 5 ug / cm2 laminine oplossing op het oppervlak van een weefselkweekplaat en genezen in een incubator betrekking op 37 ° C gedurende 24 uur vóór de verwerking van de cellen differentiatie.
Opmerking: Verwijder de laminine en spoel het beklede oppervlak tweemaal in DPBS onmiddellijk voorafgaand aan het enten. - Bij passage, zaad de celsuspensie bij 1 x 10 4 cellen / cm2 in DMEM-F12 (3: 1) media (voorverwarmd tot 37 ° C) aangevuld met 20 ng / ml EGF en 40 ng / ml bFGF op de laminine gecoate cultuur schotel.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO 2 en> 95% vochtigheid en laat cellen prolifereren gedurende 3 dagen.
- De hechtende neurale precursoren differentiëren na 3 dagen de media differentiatie medium met DMEM-F12 replace (3: 1) media voorverwarmd tot 37 ° C, aangevuld met 10 ng / ml hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF).
- Tijdens differentiatie vervangen 50% van het medium om de 3 dagen. Differentiatie gebeurt geleidelijk over ongeveer 21-28 dagen.
Voorzichtig: Wanneer de cellen eenmaal zijn begonnen te differentiëren, vervang alleen 50% van het materiaal op een time blootstelling aan lucht kan een nadelig effect op de gezondheid van de cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Door het gebruik van in vitro assays neurale precursor, neurogenese en neurale precursor celpopulaties werden gekarakteriseerd en vergeleken over de dorsoventrale as van de volwassen honden hippocampus. Neurale voorlopercellen afkomstig van geïsoleerde hippocampus weefsel gevormde zwevende neurosferen binnen 14 dagen na isolatie, tot een diameter van 100 urn door 28 dagen kweek. Neurosferen verkregen uit dorsale en ventrale isolaten vertoonden geen verschil in gemiddelde grootte en na enzymatische dissociatie in enkele cellen, kan worden gepasseerd zwevend neurosfeerculturen. Secundaire zwevende neurospheres van zowel hippocampus regio's in staat waren om binnen 5 dagen na passage te vormen. Na enting van 1 x 10 4 cellen / cm2 op 0,1% gelatine beklede cultuurflessen, neurale precursorcellen konden ook als hechtende monolagen (Figuur 1A) prolifereren. Geen morfologische verschillen waargenomen between dorsale en ventrale hippocampus neurale voorloper cellen en beide hechtende culturen waren in staat om meer dan 10 populatie verdubbelingen te ondergaan zonder enige vertraging waargenomen in passage-tijd (Figuur 1B). Nestin en Sox2 neurale stamcel genexpressie in hechtende kweek was niet significant verschillend in de hippocampus dorsoventrale as (figuur 2). Uitgebreidere karakterisatie van gen- en eiwitexpressie bevestigt de neurale precursor identiteit van deze cellen, wordt gerapporteerd in onze gepubliceerde gegevens 7.
Met een geschikte neurale kolonievormende assay 4,6 onderzochten we neurale voorlopercel frequentie om mogelijke verschillen in neurale precursor celpopulaties in de dorsale en ventrale deelgebieden van de hond hippocampus kwantificeren. Cellen werden gezaaid bij klonale dichtheid in een halfvaste collageenmatrix die celfusie uitsluit, en gedurende 28 dagen (Figuur 3A F = 96,8; p = 0,001; Figuur 3B ).
Onder differentiatie omstandigheden, aanhangend honden neurale voorlopercellen toonden progressieve veranderingen in de bruto morfologie, langer en meer uitgewerkte processen ontwikkelen. Eiwitexpressie voor neuronale (βIII-tubuline) en glia (glia fibrillair zuur eiwit; GFAP) markers toegenomen na hun vorming (Figuur 4). Geen significant verschil waargenomen in het aantal positief gemerkte cellen tussen de dorsale en ventrale isolaten. Onze eerder gepubliceerde gegevens bevestigt deze veranderingen eiwit expressie, wat aantoont up-regulatie van hun bijbehorende genen samen met down-regulatie van neurale voorloper genen over de 28 dagen differentiatie periode van 7.
Figuur 1:. In vitro expansie van volwassen Canine hippocampus neurale precursoren Volwassen honden hippocampus neurale precursoren geïsoleerd uit de dorsale en ventrale hippocampus regio's worden uitgebreid als (A) drijvende neurospheres of (B) een hechtende monolaag (C) Als een. hechtende monolaag deze neurale voorloper cellen kunnen passage meer dan 10 keer te ondergaan zonder een significante daling van de verdubbeling van de snelheid. n = 5; schaal = 50 pm. Gewijzigd ten opzichte van gepubliceerde cijfer 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
/ftp_upload/54953/54953fig2.jpg "/>
Figuur 2:. Gene Expression prolifererende Adult Canine hippocampus neurale voorloper cellen Expressie van neurale stamcel genen (A) Nestin en (B) Sox2 werd bevestigd bij volwassen honden hippocampus neurale precursorcellen onder hechtende proliferatieve kweekomstandigheden. Expressie van deze genen was gelijk in zowel de dorsale en ventrale hippocampus afgeleide cellen. Volwassen honden fibroblasten werden als een stuurleiding verschillen in relatieve genexpressie vergelijken. n = 5; foutbalken = SEM. Gewijzigd ten opzichte van gepubliceerde cijfer 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Neurale kolonievormende assay (A)Volwassen honden neurale precursorcellen, geënt op klonale dichtheid in een halfvaste collageenmatrix, vorm neurosferen binnen 28 dagen kweek. (B) neurale voorlopercellen afkomstig van de dorsale hippocampus genereren aanzienlijk groter aantal neurosferen per oppervlakte-eenheid dan die welke door de ventrale hippocampus. n = 5; foutbalken = SEM; schaal = 50 pm. Gewijzigd ten opzichte van gepubliceerde cijfer 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Immunocytochemie van gedifferentieerde volwassen honden hippocampus neurale precursoren Wanneer gekweekt in BDNF gedurende 28 dagen, volwassen honden neurale precursoren van zowel de dorsale en ventrale hippocampus differentiëren tot rijpe neuronen (tubuline βIII-positive) en glia (GFAP positief) celtypen. n = 5; schaal = 50 pm. Gewijzigd ten opzichte van gepubliceerde cijfer 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven protocollen worden geoptimaliseerd gunstige kweekomstandigheden voor het maximaliseren cellevensvatbaarheid behouden. De snelheid en zorgvuldigheid tijdens de extractie, isolatie en expansie van cruciaal belang. Een cruciale stap voor de vaststelling van hechtende monolaag uitbreiding is de effectieve scheiding van de primaire neurospheres. Na passage, onvoldoende gescheiden neurosferen kunnen secundaire drijvende neurospheres genereren. Tijdens de media veranderen, kunnen deze neurospheres worden verwijderd, gescheiden en opnieuw uitgezet voor hechtende monolaag passage. Omgekeerd, als na dissociatie cellevensvatbaarheid is dan 80%, kan dit wijzen op overmatige pipetteren tijdens dissociatie. Neurale precursorcellen, met name hun gedifferentieerde tegenhangers, zijn gevoelig voor veranderingen in de pH buiten het fysiologische bereik, en blootstelling aan lucht. De waarneming van plotselinge wijdverbreide celdood toegeschreven aan deze factoren. Bijgevolg is een cruciale stap in de media chanGES is voor de media fris elke keer worden gemaakt, en slechts 50% van het volume te vervangen. Tenslotte, terwijl mitogene factoren EGF en bFGF ondersteunen de overleving en proliferatie van hippocampale neuronale precursors onder serumvrije omstandigheden in vitro 22,23, de cellulaire reactie op deze mitogenen is sterk afhankelijk van de cel ontwikkelingsleeftijd en mitogene concentratie 24,25. Derhalve voor minimale experimentele variatie die doorslaggevend is voor het genereren consistente, reproduceerbare celkweken.
Voor maximale levensvatbaarheid, moeten de cellen worden gezaaid voor de cultuur binnen 6 uur post mortem. Echter, de geëxtraheerde hersenen tijdelijk opgeslagen in PBS bij 4 ° C. Deze wijziging kan zorgen voor isolatie worden uitgesteld tot 24 uur met een minimale afname in cel opbrengst 26,27. Groeifactor aanvulling van het kweekmedium kan worden gemodificeerd om proliferatie versterken of het stimuleren differentiation specifieke neurale celtypen. Insulineachtige groeifactor 1 (100 ng / ml) is aangetoond dat een ondersteunend effect op knaagdieren neurale stamcellen in vitro 28,29, terwijl onder omstandigheden differentiatie pro-neuronale factor BDNF 30 kan worden gebruikt in combinatie met factoren interleukine 7 (bij 500 ng / ml) of retinoïnezuur (bij 0,1 uM) een voorkeur voor neuronale subtype of gliale differentiatie 31,32 induceren.
De beslissing over het al dan neurale voorlopercellen uit te breiden als drijvende neurospheres of als een hechtende monolaag hangt grotendeels af van de gewenste downstream-toepassingen en cultuur kenmerken. Terwijl de neurosfeercultuur systeem simplistisch en zeer reproduceerbare, is het beperkt in zijn vermogen om homogene populaties van cellen te maken. Het complex micro-omgeving binnen elke bol kunnen bevorderen apoptose en spontane differentiatie, het stimuleren van een heterogene populatie 33, terwijl reported fusie van neurospheres dat kwantificering van neurale precursor celpopulaties 34 kunnen verwarren. Bovendien kan de herhaalde mechanische dissociatie vereist neurosphere passage leiden tot schadelijke stress, senescentie of zelfs celdood. Het gebruik van alternatieve dissociatie enzym zoals papaïne, kan de resulterende cellevensvatbaarheid 16 beïnvloeden. Omgekeerd, de hechtende monolaag cultuur-systeem, met een meer uniforme blootstelling aan omgevingstabaksrook mitogenen, stimuleert een grotere homogeniteit in celtype en meer symmetrische divisie. Dit systeem is aangetoond dat een niche onafhankelijk celpopulatie op basis van de expressie van belangrijke stamcel markers 35,36 produceren. Dit systeem vereist het gebruik van pre-gecoate kweekvaten om cellulaire therapietrouw te bevorderen. De keuze van de cultuur ondergrond moet zorgvuldig worden overwogen, aangezien het significante effecten op de differentiatie profiel van de gekweekte neurale precursors 25,37 kan hebben.
Here presenteren we effectief protocollen voor de isolatie, uitbreiding en differentiatie van volwassen honden hippocampus neurale voorlopercellen uit verse post mortem weefsel. Volwassen honden neurale precursors zijn ondervertegenwoordigd in de literatuur 18; met volledige protocollen voor de isolatie en expansie, zelfs minder 17. Onze protocollen kan dan dienen om het bewustzijn van deze waardevolle diermodel te verhogen en vormen een belangrijke aanvulling op deze bescheiden aantal studies. Van belang, met behulp van onze unieke methode, volwassen honden hippocampus neurale precursors kan worden uitgebreid met succes meer dan 10 populatie verdubbelingen. Een soortgelijke studie met behulp van volwassen honden hippocampus neurale voorloper gemeld dat grotere neurospheres, gepasseerd bij 100-150 micrometer in doorsnede, opgehouden proliferatie verder dan de vijfde generatie 17. Zoals vermeld in ons protocol, kan overmatige groei neurosphere spontane differentiatie en apoptosis te moedigen, die meer dan seriële passage l kunnen hebbened deze verminderde proliferatieve capaciteit. Wij ook een protocol voor hechtende monolaag uitbreiding van deze celpopulatie, als alternatief voor de klassieke neurosfeer expansiesysteem 17-21. Dit alternatieve systeem biedt de gebruiker meer controle over de cellulaire omgeving en aanzienlijk verbreedt de stroomafwaartse toepassingen voor deze cellen die een belangrijke fenotypische homogenisatie en gerichte neuronale differentiatie 35,38.
Gekweekte volwassen honden hippocampus neurale voorloper cellen hebben toepassingen in een breed scala van cellulaire en neurobiologisch onderzoek velden. De hond hersenen bezit een dichter homologie met de menselijke hersenen dan bestaande diermodellen. Als zodanig, volwassen honden neurale voorloper cellen vormen een belangrijke, maar weinig bestudeerd, bron. Deze cellen kunnen worden gebruikt om verder inzicht in de mechanismen achter volwassenen neurogenese in de mens, en voor de ontwikkeling van regeneratieve therapieën die target dit proces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 μl filtered pipette tip | Axygen | TF1000 | |
| 150 mm Petri dish | BD Biosciences | 351058 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 200 μl filtered pipette tip | Axygen | TF200 | |
| 24 well culture plate | Greiner Bio One | 662160 | |
| 35 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353001 | |
| 40 µm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 6 well culture plate | BD Biosciences | 351146 | |
| B-27 Supplement (50x) serum free | Life Technologies | 17504044 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | 13256029 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Millipore | GF029 | |
| Collagen solution | Stem Cell Technologies | 04902 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| DMEM (4.5 g/L, D-glucose) 500 ml | Life Technologies | 11960044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | BD Biosciences | 354001 | |
| F-12 nutrient mixture (Ham) (1x) Liquid | Life Technologies | 31765035 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 16141079 | |
| Gelatin from Porcine Skin Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide (GlutaMAX) | Life Technologies | 35050061 | |
| Heparin sodium salt from (porcine) | Sigma-Aldrich | H314950KU | |
| Laminin (mouse) | Life Technologies | 23017015 | |
| NCFC serum free medium (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5720 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| Proliferation NS-A (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 05773 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit Cat: 05740, and NS-A Prolieration Kit (Rat) Cat: 05771 from Stem Cell Technologies. |
| NSC basal medium (Rat; NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5770 | Also available in the Neurocult NS-A Prolieration Kit (Rat) from Stem Cell Technologies. Cat: 05771 |
| Penicillin/Streptomycin (5,000 U/ml) | Life Technologies | 15070063 | |
| Povidone-iodine | Munipharma | Betadine | |
| Trypan blue (0.4%) | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| Class II biological safety cabinet | ThermoFisher Scientific | Safe 2020 1.2 | |
| Brain knife (disposable) | Macroknife | ||
| Cell culture incubator | ThermoFisher Scientific | HERAcell 150i | |
| Centrifuge | Hettich | Universal 320R | |
| Dumont #5 Forceps | Dumont | ||
| Easypet Electric pipette | Eppindorf | ||
| Hemocytometer | Boeco | Bright-Line Improved Neubauer | |
| Manual pipettes | Eppindorf research | ||
| Oscillating bone saw | |||
| Scalpel blades (No.21) | Paramount | ||
| Scissors | Delta | ||
| Water bath | Grant | JB Aqua 18 plus |
References
- Kheirbek, M. A., Hen, R. Dorsal vs ventral hippocampal neurogenesis: implications for cognition and mood. Neuropharmacol. 36 (1), 373 (2011).
- Tanti, A., Rainer, Q., Minier, F., Surget, A., Belzung, C. Differential environmental regulation of neurogenesis along the septo-temporal axis of the hippocampus. Neuropharmacol. 63 (3), 374-384 (2012).
- Eriksson, P. S., et al.
- Bull, N. D., Bartlett, P. F. The adult mouse hippocampal progenitor is neurogenic but not a stem cell. J Neurosci. 25 (47), 10815-10821 (2005).
- Kempermann, G., et al. Why and how physical activity promotes experience-induced brain plasticity. Front Neurosci. 4 (189), 1-9 (2010).
- Golmohammadi, M. G., et al. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26 (4), 979-987 (2008).
- Lowe, A., et al. Neurogenesis and precursor cell differences in the dorsal and ventral adult canine hippocampus. Neurosc. Lett. 593, 107-113 (2015).
- Sasaki, M., et al. MRI identification of dorsal hippocampus homologue in human brain. Neuroreport. 15 (14), 2173-2176 (2004).
- Powell, E. W., Hines, G. The Hippocampus. , Springer. 41-59 (1975).
- Jung, M. -A., et al. Canine hippocampal formation composited into three-dimensional structure using MPRAGE. J Vet Med Sci. 72 (7), 853-860 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Ray, J., Raymon, H. K., Gage, F. H. Generation and culturing of precursor cells and neuroblasts from embryonic and adult central nervous system. Methods Enzymol. 254, 20-37 (1995).
- Oliver-Dela Cruz, J., Ayuso-Sacido, A. Neural stem cells from mammalian brain: isolation protocols and maintenance conditions. INTECH Open Access Publisher. , (2012).
- Pacey, L., Stead, S., Gleave, J., Tomczyk, K., Doering, L. Neural stem cell culture: neurosphere generation, microscopical analysis and cryopreservation. Nat Protoc. , (2006).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), e2393 (2010).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225 (2014).
- Lim, J. -H., Koh, S., Olby, N. J., Piedrahita, J., Mariani, C. L. Isolation and characterization of neural progenitor cells from adult canine brains. Am J Vet Res. 73 (12), 1963-1968 (2012).
- Herranz, C., et al. Spontaneously Arising Canine Glioma as a Potential Model for Human Glioma. J Comp Pathol. 154 (2), 169-179 (2016).
- Walton, R. M., Parmentier, T., Wolfe, J. H. Postnatal neural precursor cell regions in the rostral subventricular zone, hippocampal subgranular zone and cerebellum of the dog (Canis lupus familiaris). Histochem Cell Biol. 139 (3), 415-429 (2013).
- Walton, R. M., Wolfe, J. H. Abnormalities in neural progenitor cells in a dog model of lysosomal storage disease. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (8), 760-769 (2007).
- Milward, E. A., et al. Isolation and transplantation of multipotential populations of epidermal growth factor-responsive, neural progenitor cells from the canine brain. J Neurosci Res. 50 (5), 862-871 (1997).
- Ray, J., Peterson, D. A., Schinstine, M., Gage, F. H. Proliferation, differentiation, and long-term culture of primary hippocampal neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. 90 (8), 3602-3606 (1993).
- Palmer, T., Ray, J., Gage, F. FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain. Mol Cell Neurosci. 6 (5), 474-486 (1995).
- Zhu, G., Mehler, M., Mabie, P., Kessler, J. Developmental changes in progenitor cell responsiveness to cytokines. J. Neurosci. Res. 56 (2), 131-145 (1999).
- Whittemore, S. R., Morassutti, D. J., Walters, W. M., Liu, R. -H., Magnuson, D. S. Mitogen and substrate differentially affect the lineage restriction of adult rat subventricular zone neural precursor cell populations. Exp. Cell. Res. 252 (1), 75-95 (1999).
- Kennedy, P. Postmortem survival characteristics of rat glial cells in culture. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 50 (6), 798-800 (1987).
- Viel, J. J., McManus, D. Q., Cady, C., Evans, M. S., Brewer, G. J. Temperature and time interval for culture of postmortem neurons from adult rat cortex. J. Neurosci. Res. 64 (4), 311-321 (2001).
- Huat, T. J., et al. IGF-1 enhances cell proliferation and survival during early differentiation of mesenchymal stem cells to neural progenitor-like cells. BMC Neurosci. 15 (91), 1-13 (2014).
- Supeno, N. E., et al. IGF-1 acts as controlling switch for long-term proliferation and maintenance of EGF/FGF-responsive striatal neural stem cells. Int. J. Med. Sci. 10 (5), 522-531 (2013).
- Ahmed, S., Reynolds, B. A., Weiss, S. BDNF enhances the differentiation but not the survival of CNS stem cell-derived neuronal precursors. J Neurosci. 15 (8), 5765-5778 (1995).
- Wohl, C. A., Weiss, S. Retinoic acid enhances neuronal proliferation and astroglial differentiation in cultures of CNS stem cell-derived precursors. J Neurobiol. 37 (2), 281-290 (1998).
- Araujo, D. M., Cotman, C. W. Trophic effects of interleukin-4,-7 and-8 on hippocampal neuronal cultures: potential involvement of glial-derived factors. Brain Res. 600 (1), 49-55 (1993).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3 (10), 801-806 (2006).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3 (9), 283 (2005).
- Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, Suppl 1 112-120 (2006).
- Ma, W., et al. Cell-extracellular matrix interactions regulate neural differentiation of human embryonic stem cells. BMC Dev Biol. 8 (90), 1-13 (2008).
- Goffredo, D., et al. Setting the conditions for efficient, robust and reproducible generation of functionally active neurons from adult subventricular zone-derived neural stem cells. Cell Death Differ. 15 (12), 1847-1856 (2008).
