Summary
Собачий мозг является ценным модель, в которой для изучения нейрогенез. Здесь представлены протоколы для выделения и расширения взрослых собачьих клеток гиппокампа нервные прекурсоров из первичной ткани головного мозга.
Protocol
В соответствии с Новый Южный Уэльс, Австралия закона, сообщение ткани патологоанатомическое мозг был приобретен у взрослых собак эвтаназии по причинам , не связанным с изучением.
1. Приготовление культуральной среды
- Готовят 0,1% раствор желатина добавлением 0,1 г желатина порошка в 100 мл дистиллированной воды и перемешивание при 37 ° С до растворения. Стерилизацию раствора с помощью УФ-облучения в течение 15 мин. Этот носитель затем можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 1 месяца.
- Приготовьте соотношении 3: 1 из среды Игла в модификации Дульбекко (DMEM) и питательной смеси F12 путем добавления 167 мл F-12 до 500 мл DMEM (4,5 г / л D-глюкозы). Добавить 6,7 мл раствора пенициллин / стрептомицин (для конечной концентрации 1%). Эти носители могут быть сохранены в темноте при 4 ° С в течение до 1 месяца.
- Приготовьте 500 мл сыворотки сред путем объединения 440 мл DMEM (4,5 г / л D-глюкозы), 5 мл L-аланил-L-глутамин-дипептид (200 мМ), 5 мл пенициллина / стрептомицина и 50 мл фетальной Бовине сыворотки (ФБС). Эти носители могут быть сохранены в темноте при 4 ° С в течение до 1 месяца.
- Полная среда роста состоит из нейрональных стволовых Cell (НСК) базальной среды и пролиферации нейронные Дополнение-А (NS-А), 2% FBS, 2 мкг / мл гепарина, 20 нг / мл эпидермального фактора роста (ЭФР) и 10 нг / мл основной фактор роста фибробластов (bFGF). Сделать этот носитель свежий, непосредственно перед вскрытием мозга, и нагревают до 37 ° С в водяной бане.
2. Мозг Добыча
- Начать добычу в течение 6 ч после вскрытия путем стерилизации спинной поверхности головы собаки с использованием повидон-йод.
- Используя скальпель, сделайте продольный разрез вдоль сагиттальной средней линии, по всей спинной поверхности черепа, чтобы разоблачить основные мышцы массетерной. Длина этого разреза будет зависеть от вида и возраста собаки.
- В ростральной и каудальной границы черепе, сделать дополнительные 5 - 10 см, перпендикулярные разрезы с обеих сторон, проходятИНГ позади глаз и ушей соответственно, позволяют коже быть в полной мере отражены.
- Используя скальпель, отделяют жевательные мышцы от их прикрепления к сагиттальной гребень черепа и скрести все оставшиеся соединительной ткани из черепной коробки.
- Использование колебательный кости распиливания крышку черепа в окружной линии. С помощью зонда или скальпель разорвать любые оставшиеся вложения с ТМО, а затем осторожно снимите крышку черепа, чтобы выставить спинной поверхности мозга.
Внимание: Толщина кости варьирует в различных регионах в черепе, поэтому необходимо соблюдать осторожность , чтобы не проникать слишком глубоко и повредить основной мозг. - Отрежьте спинной мозг, вставив скальпель между верхних шейных позвонков.
- С одной стороны, осторожно поднимите мозг, использовать скальпель, чтобы аккуратно освободить мозг от черепной ямки и разъединить соединительные нервы и кровеносные сосуды, расположенные на вентральной стороне. Аккуратно поднимите бдождь из черепа и в контейнер ДЗФР.
Внимание: Большие обонятельные луковицы собачьего мозга может проходить глубоко в передней черепной ямки. Необходимо соблюдать осторожность при удалении мозг так, чтобы сохранить эти структуры.
3. гиппокампа Вскрытие
- Промыть мозг в фосфатно-буферном солевом растворе Дульбекко (DPBS), чтобы удалить кровь, и поместите его спинной стороной вниз на 150 мм чашках Петри.
- Медленно рассекают мозг в продольном направлении через середину сагиттальной плоскости используя влажный нож мозга и единственный кусок, который использует всю длину лезвия. Не применять дополнительное понижательное давление, или использовать движение распиливания, так как это может привести к повреждению тканей.
- Размещение каждое полушарие медиальной поверхности вверх, рассекают из гиппокамп с помощью скальпеля и тонких щипцов, и перенести его на 35 мм блюдо культуры ткани в.
4. Выделение нейронных клеток-предшественников
- Фарш тОбразцы вопросу , используя лезвие скальпеля в приблизительно 1 мм 3 шт.
- Передача ткани в 15 мл пробирку, добавляют 2 мл 0,1% трипсина ЭДТА, и инкубируют в течение 7 мин на водяной бане при 37 ° С.
- Остановить ферментативную реакцию добавлением 4 мл сыворотки носителя в трубке. Гранул суспензии путем центрифугирования при 100 мкг в течение 7 мин и удалить супернатант.
- Ресуспендируют осадок в 300 мкл ДЗФР, и механически диссоциированы осторожно пипеткой вверх и вниз, используя 1000 мкл пипетки, пока гладкие формы гомогенатов.
- Добавьте 14 мл сыворотки носителя в пробирку и проходят клеточной суспензии через сито 40 клеток мкм. Гранул суспензии путем центрифугирования при 100 х г в течение 7 мин, удалить супернатант, и ресуспендируют в полной среде роста.
5. нейросфера Культура
- Из полученной клеточной суспензии в изоляции, подсчитать количество жизнеспособных клеток с использованием исключения трипанового синего красителя и гемоцитометре.
- Развести суспензии клеток в полной среде роста и семян в количестве 1 × 10 5 клеток / см 2 в непокрытые лунки 6 - луночного планшета с.
- Инкубировать при 37 ° C, 5% CO 2 и> 95% влажности в течение 14 - 28 дней, заменить 50% из питательной среды каждые 7 дней. Регулярно измеряйте диаметр нейросферах. Если позволено выйти за пределы 100 мкм в диаметре, гибель клеток и спонтанной дифференцировки может происходить в пределах нейросферах.
6. нейросфера Прохождение
- Для прохождения в качестве плавучего культуры, когда нейросферы достигает примерно 100 мкм в диаметре, объединить все нейросфера, содержащий носитель в одну пробирку. Гранул путем центрифугирования при 100 мкг в течение 7 мин и удалить супернатант.
- Ресуспендируют осадок в 1 мл 0,1% трипсина ЭДТА и инкубировать в течение 7 мин на водяной бане при 37 ° С. Аккуратно пипеткой вверх и вниз 100 раз, используя 200 мкл пипетки, чтобы обеспечить dissociatiна из нейросферах.
- Прекратить ферментативной реакции путем добавления 5 мл сыворотки носителя в пробирку и центрифугируют при 100 х г в течение 7 мин.
- Удалить супернатант, ресуспендируют осадок клеток в 1 мл полной среды роста и подсчитывают количество жизнеспособных клеток с использованием исключения синий краситель трипанового и гемоцитометра.
- Развести суспензии клеток в полной среде роста и семян в количестве 1 × 10 5 клеток / см 2 в непокрытые лунки 6 - луночного планшета с. Инкубировать при 37 ° C, 5% CO 2 и> 95% влажности в течение 14 - 28 дней, заменяя 50% из питательной среды каждые 7 дней.
7. Приверженец культура Neural клеток-предшественников
- Добавьте достаточный объем 0,1% раствора желатина, чтобы покрыть поверхность тканевой культуры, тарелкой и отверждения в термостате при температуре 37 ° С в течение 1 ч до обработки нейросферы для культуры прикрепленных.
- С плавающей нейросфера культуры, объединить все средства массовой информации в одну трубу. Гранул Neurospheres центрифугированием при 100 мкг в течение 7 мин и удаляют супернатант.
- Ресуспендируют осадок в 1 мл 0,1% трипсина ЭДТА и инкубировать в течение 7 мин на водяной бане при 37 ° С. Аккуратно пипеткой вверх и вниз 100 раз, используя 200 мкл кончиком пипетки.
- Добавьте 5 мл сыворотки СМИ, чтобы остановить реакцию фермента и центрифуге при 100 мкг в течение 7 мин. Жидкость над осадком сливают и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл полной среды роста и подсчитывают количество жизнеспособных клеток с использованием исключения синий краситель трипанового и гемоцитометра.
- Развести суспензии клеток в полной среде роста, удалить желатин из колб культуры тканей и семян клеток при 1 × 10 4 клеток / см 2.
- Инкубируйте клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 и> 95% влажности. Замените носитель со свежими, утепленные, полный питательной среды каждые три дня, пока культура не достигнет примерно 80% слияния (приблизительно через 7 дней).
8. Neurаль колониеобразующих Анализ
- Объединить Neural формирующих колонию мобильных компонентов (NCFC) среде для анализа: NCFC бессывороточной среде, пролиферации NS-A, и раствор коллагена (3 мг / мл). Дополнение этот носитель с 2 мкг / мл гепарина, 20 нг / мл EGF, и 10 нг / мл bFGF.
- После диссоциации ткани гиппокампа ресуспендирования клеток в нервной колониеобразующих среды для анализа, предварительно нагретый до 37 ° С в водяной бане. Семенной клетки при клональной плотностью 1,1 × 10 5 клеток / мл в чашку для культивирования 35 мм.
- Инкубируйте клетки в этом полутвердой коллагеновой матрице при температуре 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 и> 95% влажности. Культура в течение 28 дней, заменяя 50% питательной среды каждые 7 дней.
9. дифференцировка нервных клеток-предшественников
- Добавьте достаточный объем 5 мкг / см 2 раствора ламинин , чтобы покрыть поверхность тканевой культуры , тарелкой и излечение в термостате при температуре 37 ° С в течение 24 ч перед обработкой клеток в течение отличительноеции.
Примечание: Удалите раствор ламинина и промойте поверхность с покрытием дважды в ДЗФР непосредственно перед посевом. - Когда пассажей, семена суспензии клеток в 1 х 10 4 клеток / см 2 в среде DMEM-F12 (3: 1) средства массовой информации (предварительно нагретый до 37 ° С) , дополненной 20 нг / мл EGF , и 40 нг / мл bFGF на ламинин покрытием культуры блюдо.
- Инкубируйте клетки при 37 ° С, 5% СО 2 и> 95% влажности и позволяют клеткам пролиферировать в течение 3 -х дней.
- Для того, чтобы дифференцировать адгезивных клеток-предшественников нервных, после 3-х дней заменить носитель с дифференциацией средах, содержащих DMEM-F12 (3: 1) средства массовой информации предварительно нагретом до 37 ° С, дополненной 10 нг / мл мозга нейротрофического фактора (BDNF).
- Во время дифференцировки заменить 50% СМИ каждые 3 дня. Дифференциация происходит постепенно, в течение примерно 21 - 28 дней.
Внимание: После того, как клетки начинают дифференцироваться, только заменить 50% средств массовой информации на одном тименя как воздействие воздуха может оказывать вредное воздействие на здоровье клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью лабораторных нейронных предшественников количественных анализов, нейрогенеза и популяции нейрональных предшественников клеток характеризовались и сравнивались по дорсовентральной оси взрослого собачьего гиппокампе. Клетки-предшественники Нервные, полученные из изолированной гиппокампа ткани, сформированной с плавающей нейросферы в течение 14 дней изоляции, достигая диаметра 100 мкм до 28 дней культивирования. Нейросферах, полученные из спинного и брюшного изолятов не показали никакой разницы в средний размер, и после ферментативной диссоциации на отдельные клетки, могут быть пассировать в качестве плавучих нейросфера культур. Вторичные плавающие нейросферы из обоих гиппокампа регионов удалось сформировать в течение 5 дней с момента прохождения. Когда высевают 1 × 10 4 клеток / см 2 на 0,1% желатином покрытием колбы культуры, нервные клетки - предшественники также были в состоянии размножаться , как прилипшие монослоя (рис 1А). Нет морфологических различий не наблюдалось betweeп спинной и брюшные клетки гиппокампа нервные предшественники и оба прилипшие культуры смогли пройти более 10 удвоений популяции без каких - либо наблюдаемое замедление прохождения времени (рис 1В). Экспрессии генов нервных стволовых клеток Nestin и Sox2 в прикрепленной культуре существенно не отличалась по гиппокампа дорсовентральной оси (Рисунок 2). Более обширная характеристика гена и экспрессию белка, подтверждающие нейронную идентичность предшественника этих клеток, сообщается в наших опубликованных данных 7.
Использование адаптированной Neural колониеобразующих анализа 4,6 мы оценивали нейронную частоту предшественника клеток для того , чтобы количественно оценить потенциальные различия в нейронных популяций клеток - предшественников через спинных и брюшных субрегионов собачьего гиппокампе. Клетки высевали при плотности клонального в полутвердой матрице коллагена, исключающей слияния клеток, и культивировали в течение 28 дней (Фигура 3А F = 96,8, p = 0,001; рис 3B ).
В условиях дифференциации, прилипшие собачьи клетки-предшественники нервных показали прогрессивные изменения в макроскопической морфологии, развивая более и более сложные процессы. Экспрессию белка для нейронов (βIII-тубулина) и глиальных (глиальных фибриллярный кислый белок; GFAP) маркеры также возросло после дифференцировки (рисунок 4). Никаких существенных различий не наблюдалось в количестве положительно меченых клеток между дорсальной и вентральной изолятов. Наша ранее опубликованных данных подкрепляет эти изменения экспрессии белка, демонстрируя повышающей регуляции их ассоциированных генов наряду с понижающей регуляции нервной гены - предшественники в течение 28 - дневного периода дифференциации 7.
Рисунок 1:. Собачьи клетки гиппокампа нейронные предшественники In Vitro Расширение для взрослых собак гиппокампа Neural клеток - предшественников взрослых , выделенные из спинного и брюшного гиппокампа регионах расширяются , как (А) плавающих нейросферах или (B) сцепленным монослоя (С) в качестве. приверженцем монослоя эти нервные клетки-предшественники могли пройти проход в 10 раз без существенного снижения скорости удвоения. п = 5; масштаб = 50 мкм. Модифицированный из опубликованной рисунке 7. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
/ftp_upload/54953/54953fig2.jpg "/>
Рисунок 2:. Экспрессия генов в пролиферирующих взрослых собак гиппокампа нейронные клеток - предшественников экспрессии генов нервных стволовых клеток (А) нестин и (В) Sox2 было подтверждено у взрослых собачьих клеток гиппокампа нервных предшественников при адгезивных пролиферативных условиях культивирования. Экспрессия этих генов была эквивалентна в обоих спинных и брюшных гиппокампа клеток, полученных. Взрослые собачьи фибробласты были использованы в качестве контрольной линии, чтобы сравнить различия в относительной экспрессии гена. п = 5; Столбики ошибок = SEM. Модифицированный из опубликованной рисунке 7. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3:. Нейронные колониеобразующих Анализ (А)Взрослые собачьи нервные клетки - предшественники, отобранный при клональной плотности в полутвердой коллагеновой матрицы, образуют нейросферы в течение 28 дней культивирования. (В) клетки нейронные предшественники , полученные из дорсального гиппокампа генерируют значительно большее количество нейросферах на единицу площади , чем те , которые получены из вентральный гиппокамп. п = 5; ошибка полоски = SEM; масштаб = 50 мкм. Модифицированный из опубликованной рисунке 7. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 4: Иммуноцитохимическая дифференцированной для взрослых собак гиппокампа Neural клеток - предшественников При культивировании в BDNF в течение 28 дней, взрослые собачьей нейронные предшественники из обоих спинных и брюшных гиппокампе дифференцируются в зрелые нейрональные (βIII-тубулина роsitive) и глиальные (типы положительный) клеток GFAP. п = 5; масштаб = 50 мкм. Модифицированный из опубликованной рисунке 7. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протоколы, описанные здесь, оптимизированы для поддержания благоприятных условий культивирования для максимизации жизнеспособности клеток. Скорость и тщательность во время экстракции, выделения и расширения имеет решающее значение. Важным шагом для установления клейкий расширения монослоя является эффективным диссоциации первичных нейросферах. После прохода, недостаточно диссоциированы нейросферы может генерировать вторичные плавающие нейросферы. Во время замены среды, эти нейросферы могут быть удалены, диссоциируют и пересевали для адгезивного монослоя прохода. И наоборот, если жизнеспособность после диссоциации клеток ниже 80%, то это может свидетельствовать о чрезмерной пипеткой во время диссоциации. Нервные клетки-предшественники, и, в частности, их дифференцированной аналоги, чувствительны к изменениям рН вне физиологического диапазона, а также воздействием воздуха. Наблюдение внезапной распространенной гибели клеток может быть связано с этими факторами. Следовательно, важным шагом во время медиа-чанGES для средств массовой информации, чтобы быть свежим каждый раз, и только 50% от объема, подлежащего замене. И, наконец, в то время как Митогенные факторы ЭФР и bFGF поддерживает выживание и пролиферацию гиппокампа нервных предшественников под бессывороточной условиях в пробирке 22,23, клеточный ответ на эти митогены сильно зависит от клеточного возраста с развитием и митогенной концентрации 24,25. Таким образом, обеспечивая минимальное экспериментальное изменение в этих компонентах имеет решающее значение для выработки согласованных, воспроизводимых клеточных культур.
Для обеспечения максимальной жизнеспособности клетки должны быть посеяны культуры в течение 6 часов после смерти. Тем не менее, извлеченный мозг, могут быть временно сохранены в PBS при 4 ° С. Эта модификация может предусматривать изоляцию , чтобы быть с задержкой до 24 часов с минимальным снижением выхода клеток 26,27. Фактор роста добавок культуральной среды также могут быть модифицированы для усиления пролиферации или стимулировать differentiation специфических нейронных типов клеток. Инсулиноподобный фактор роста 1 (при 100 нг / мл) , было показано, что воздействие на поддерживающую грызун нервные стволовые клетки в пробирке 28,29, в то время как при дифференцировании условия про-нейрональный фактор BDNF , 30 может быть использован в сочетании с такими факторами, как интерлейкин 7 (при 500 нг / мл) или ретиноевой кислоты (0,1 мкМ) , чтобы вызвать сдвиг в сторону нейронального подтипа или глиальной дифференцировки 31,32.
Решение о том, чтобы расширить нервные клетки-предшественники в качестве плавающих нейросферах или как приверженец монослоя во многом зависит от желаемых последующих применений и характеристик культуры. В то время как система нейросфера культура является упрощенным и высокой воспроизводимостью, он ограничен в своей способности генерировать однородные популяции клеток. Комплекс микросреда в каждой сфере может способствовать апоптозу и спонтанной дифференцировке, поощрение гетерогенную популяцию 33, в то время как представительorted слияние нейросферах , которые могут запутать количественной оценки популяций клеток - предшественников нейронная 34. Кроме того, повторная механическая диссоциация требуется для нейросфера прохода может также привести к пагубным стресс, старение или даже гибели клетки. Использование альтернативных диссоциации фермента, такого как папаин, может повлиять на результирующую жизнеспособность 16 клеток. И наоборот, адепт системы культуры монослоя, с более равномерным воздействием окружающей среды митогены, способствует большей однородности в типе клеток и более симметричного деления. Эта система продуцирует нишу независимого популяцию клеток, основанный на экспрессии ключевых маркеров стволовых клеток 35,36. Эта система требует использования предварительно покрытых культуральных сосудов содействовать клеточное присоединение. Выбор культуры субстрата должны быть тщательно продуманы, так как это может оказать значительное влияние на профиле дифференцировки культивированных нервных предшественников 25,37.
ЧАСпрежде чем мы представляем эффективные протоколы для изоляции, расширение и дифференциации взрослых собачьих гиппокампа нервных клеток - предшественников из свежей посмертного ткани. Взрослые собачьи нейронные предшественники недостаточно представлены в литературе 18; с полными протоколами для их изоляции и расширения, тем более 17 лет . Наши протоколы могут затем служить для повышения осведомленности об этой ценной животной модели и представляют собой существенное дополнение к этому скромному количеству исследований. Важное значение, с помощью нашего уникального метода, взрослые собачьи гиппокампа нервные предшественники могут быть успешно расширен более 10 удвоений популяции. Аналогичное исследование с использованием взрослых собачьего гиппокампа нейронную предшественник сообщил , что более крупные нейросферы, пассированные при 100 - 150 мкм в диаметре, прекратили распространение за пределы пятого поколения 17. Как было отмечено в нашем протоколе, чрезмерный рост нейросфера может стимулировать спонтанную дифференцировку и апоптоз, который через последовательный проход может иметь ле изд этому снижается пролиферативную способность. Мы также предлагаем протокол для адгезивного расширения монослоя этой популяции клеток, в качестве альтернативы системы расширения классической нейросфера 17-21. Эта альтернативная система дает пользователю больше контроля над клеточной среде, а также значительно расширяет диапазон вниз по течению приложений для этих клеток, с потенциалом для фенотипического гомогенизации и направленной дифференцировки нейронов 35,38.
Выращенный взрослых собачьи клетки гиппокампа нервные предшественники имеют применения в широком диапазоне клеточных и нейробиологическими областях исследований. Собачий мозг обладает более тесной гомологию с человеческим мозгом, чем существующие модели на грызунах. Таким образом, взрослые собачьи клетки-предшественники нервных представляют собой важный, еще недостаточно изученным, ресурс. Эти клетки могут быть использованы для получения дальнейшее понимание механизмов позади взрослого нейрогенеза у человека, так и для развития регенеративной терапии, что Таргэтот процесс и др.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 μl filtered pipette tip | Axygen | TF1000 | |
| 150 mm Petri dish | BD Biosciences | 351058 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 200 μl filtered pipette tip | Axygen | TF200 | |
| 24 well culture plate | Greiner Bio One | 662160 | |
| 35 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353001 | |
| 40 µm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 6 well culture plate | BD Biosciences | 351146 | |
| B-27 Supplement (50x) serum free | Life Technologies | 17504044 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | 13256029 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Millipore | GF029 | |
| Collagen solution | Stem Cell Technologies | 04902 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| DMEM (4.5 g/L, D-glucose) 500 ml | Life Technologies | 11960044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | BD Biosciences | 354001 | |
| F-12 nutrient mixture (Ham) (1x) Liquid | Life Technologies | 31765035 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 16141079 | |
| Gelatin from Porcine Skin Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide (GlutaMAX) | Life Technologies | 35050061 | |
| Heparin sodium salt from (porcine) | Sigma-Aldrich | H314950KU | |
| Laminin (mouse) | Life Technologies | 23017015 | |
| NCFC serum free medium (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5720 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| Proliferation NS-A (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 05773 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit Cat: 05740, and NS-A Prolieration Kit (Rat) Cat: 05771 from Stem Cell Technologies. |
| NSC basal medium (Rat; NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5770 | Also available in the Neurocult NS-A Prolieration Kit (Rat) from Stem Cell Technologies. Cat: 05771 |
| Penicillin/Streptomycin (5,000 U/ml) | Life Technologies | 15070063 | |
| Povidone-iodine | Munipharma | Betadine | |
| Trypan blue (0.4%) | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| Class II biological safety cabinet | ThermoFisher Scientific | Safe 2020 1.2 | |
| Brain knife (disposable) | Macroknife | ||
| Cell culture incubator | ThermoFisher Scientific | HERAcell 150i | |
| Centrifuge | Hettich | Universal 320R | |
| Dumont #5 Forceps | Dumont | ||
| Easypet Electric pipette | Eppindorf | ||
| Hemocytometer | Boeco | Bright-Line Improved Neubauer | |
| Manual pipettes | Eppindorf research | ||
| Oscillating bone saw | |||
| Scalpel blades (No.21) | Paramount | ||
| Scissors | Delta | ||
| Water bath | Grant | JB Aqua 18 plus |
References
- Kheirbek, M. A., Hen, R. Dorsal vs ventral hippocampal neurogenesis: implications for cognition and mood. Neuropharmacol. 36 (1), 373 (2011).
- Tanti, A., Rainer, Q., Minier, F., Surget, A., Belzung, C. Differential environmental regulation of neurogenesis along the septo-temporal axis of the hippocampus. Neuropharmacol. 63 (3), 374-384 (2012).
- Eriksson, P. S., et al.
- Bull, N. D., Bartlett, P. F. The adult mouse hippocampal progenitor is neurogenic but not a stem cell. J Neurosci. 25 (47), 10815-10821 (2005).
- Kempermann, G., et al. Why and how physical activity promotes experience-induced brain plasticity. Front Neurosci. 4 (189), 1-9 (2010).
- Golmohammadi, M. G., et al. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26 (4), 979-987 (2008).
- Lowe, A., et al. Neurogenesis and precursor cell differences in the dorsal and ventral adult canine hippocampus. Neurosc. Lett. 593, 107-113 (2015).
- Sasaki, M., et al. MRI identification of dorsal hippocampus homologue in human brain. Neuroreport. 15 (14), 2173-2176 (2004).
- Powell, E. W., Hines, G. The Hippocampus. , Springer. 41-59 (1975).
- Jung, M. -A., et al. Canine hippocampal formation composited into three-dimensional structure using MPRAGE. J Vet Med Sci. 72 (7), 853-860 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Ray, J., Raymon, H. K., Gage, F. H. Generation and culturing of precursor cells and neuroblasts from embryonic and adult central nervous system. Methods Enzymol. 254, 20-37 (1995).
- Oliver-Dela Cruz, J., Ayuso-Sacido, A. Neural stem cells from mammalian brain: isolation protocols and maintenance conditions. INTECH Open Access Publisher. , (2012).
- Pacey, L., Stead, S., Gleave, J., Tomczyk, K., Doering, L. Neural stem cell culture: neurosphere generation, microscopical analysis and cryopreservation. Nat Protoc. , (2006).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), e2393 (2010).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225 (2014).
- Lim, J. -H., Koh, S., Olby, N. J., Piedrahita, J., Mariani, C. L. Isolation and characterization of neural progenitor cells from adult canine brains. Am J Vet Res. 73 (12), 1963-1968 (2012).
- Herranz, C., et al. Spontaneously Arising Canine Glioma as a Potential Model for Human Glioma. J Comp Pathol. 154 (2), 169-179 (2016).
- Walton, R. M., Parmentier, T., Wolfe, J. H. Postnatal neural precursor cell regions in the rostral subventricular zone, hippocampal subgranular zone and cerebellum of the dog (Canis lupus familiaris). Histochem Cell Biol. 139 (3), 415-429 (2013).
- Walton, R. M., Wolfe, J. H. Abnormalities in neural progenitor cells in a dog model of lysosomal storage disease. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (8), 760-769 (2007).
- Milward, E. A., et al. Isolation and transplantation of multipotential populations of epidermal growth factor-responsive, neural progenitor cells from the canine brain. J Neurosci Res. 50 (5), 862-871 (1997).
- Ray, J., Peterson, D. A., Schinstine, M., Gage, F. H. Proliferation, differentiation, and long-term culture of primary hippocampal neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. 90 (8), 3602-3606 (1993).
- Palmer, T., Ray, J., Gage, F. FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain. Mol Cell Neurosci. 6 (5), 474-486 (1995).
- Zhu, G., Mehler, M., Mabie, P., Kessler, J. Developmental changes in progenitor cell responsiveness to cytokines. J. Neurosci. Res. 56 (2), 131-145 (1999).
- Whittemore, S. R., Morassutti, D. J., Walters, W. M., Liu, R. -H., Magnuson, D. S. Mitogen and substrate differentially affect the lineage restriction of adult rat subventricular zone neural precursor cell populations. Exp. Cell. Res. 252 (1), 75-95 (1999).
- Kennedy, P. Postmortem survival characteristics of rat glial cells in culture. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 50 (6), 798-800 (1987).
- Viel, J. J., McManus, D. Q., Cady, C., Evans, M. S., Brewer, G. J. Temperature and time interval for culture of postmortem neurons from adult rat cortex. J. Neurosci. Res. 64 (4), 311-321 (2001).
- Huat, T. J., et al. IGF-1 enhances cell proliferation and survival during early differentiation of mesenchymal stem cells to neural progenitor-like cells. BMC Neurosci. 15 (91), 1-13 (2014).
- Supeno, N. E., et al. IGF-1 acts as controlling switch for long-term proliferation and maintenance of EGF/FGF-responsive striatal neural stem cells. Int. J. Med. Sci. 10 (5), 522-531 (2013).
- Ahmed, S., Reynolds, B. A., Weiss, S. BDNF enhances the differentiation but not the survival of CNS stem cell-derived neuronal precursors. J Neurosci. 15 (8), 5765-5778 (1995).
- Wohl, C. A., Weiss, S. Retinoic acid enhances neuronal proliferation and astroglial differentiation in cultures of CNS stem cell-derived precursors. J Neurobiol. 37 (2), 281-290 (1998).
- Araujo, D. M., Cotman, C. W. Trophic effects of interleukin-4,-7 and-8 on hippocampal neuronal cultures: potential involvement of glial-derived factors. Brain Res. 600 (1), 49-55 (1993).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3 (10), 801-806 (2006).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3 (9), 283 (2005).
- Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, Suppl 1 112-120 (2006).
- Ma, W., et al. Cell-extracellular matrix interactions regulate neural differentiation of human embryonic stem cells. BMC Dev Biol. 8 (90), 1-13 (2008).
- Goffredo, D., et al. Setting the conditions for efficient, robust and reproducible generation of functionally active neurons from adult subventricular zone-derived neural stem cells. Cell Death Differ. 15 (12), 1847-1856 (2008).
