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Developmental Biology

अलगाव और वयस्क कुत्ते हिप्पोकैम्पस तंत्रिका व्यापारियों का विस्तार

Published: November 29, 2016 doi: 10.3791/54953
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Regenerative Neuroscience Group, University of Sydney, 2Wellcome Trust Centre for Neuroimaging, Institute of Neurology, University College London

Summary

कुत्ते मस्तिष्क एक मूल्यवान मॉडल में जो वयस्क न्यूरोजेनेसिस अध्ययन करने के लिए है। यहाँ प्रस्तुत अलग-थलग करने और प्राथमिक मस्तिष्क के ऊतकों से वयस्क कुत्ते हिप्पोकैम्पस तंत्रिका कोशिकाओं अग्रदूत के विस्तार के लिए प्रोटोकॉल रहे हैं।

Protocol

न्यू साउथ वेल्स, ऑस्ट्रेलिया कानून, के अनुसार पोस्टमार्टम मस्तिष्क के ऊतकों अध्ययन करने के लिए असंबंधित कारणों के लिए euthanized वयस्क कुत्तों से अधिग्रहण कर लिया था।

1. मध्यम संस्कृति की तैयारी

  1. आसुत जल के 100 मिलीलीटर के लिए जिलेटिन पाउडर के 0.1 ग्राम जोड़ने और 37 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन जब तक भंग करके एक 0.1% जिलेटिन समाधान तैयार है। 15 मिनट के लिए पराबैंगनी विकिरण के द्वारा समाधान जीवाणुरहित। यह मीडिया तो 1 महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  2. DMEM के 500 मिलीलीटर (4.5 छ / एल डी ग्लूकोज) को एफ -12 की 167 मिलीलीटर जोड़कर Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) और पोषक तत्व मिश्रण F12 का अनुपात 1: 3 तैयार करें। पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान (1% अंतिम एकाग्रता के लिए) के 6.7 मिलीलीटर जोड़ें। यह मीडिया 1 महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में रखा जा सकता है।
  3. DMEM (4.5 छ / एल डी ग्लूकोज), के 440 मिलीलीटर के संयोजन से सीरम मीडिया के 500 मिलीलीटर की तैयारी 5 मिलीलीटर एल alanyl-एल glutamine dipeptide (200 मिमी), पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 5 मिलीलीटर और भ्रूण bovin की 50 मिलीलीटरई सीरम (FBS)। यह मीडिया 1 महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में रखा जा सकता है।
  4. पूरा मध्यम विकास स्टेम सेल तंत्रिका के होते हैं (एनएससी) बेसल मध्यम और प्रसार तंत्रिका अनुपूरक-ए (एन एस ए), 2% FBS, 2 माइक्रोग्राम / एमएल हेपरिन, 20 एनजी / एमएल epidermal वृद्धि कारक (EGF) और 10 एनजी / एमएल बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF)। इस मीडिया, ताजा तुरंत मस्तिष्क विच्छेदन के लिए पहले, और 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म पानी के स्नान में बनाओ।

2. मस्तिष्क निष्कर्षण

  1. Povidone आयोडीन का उपयोग कर कुत्ते के सिर के पृष्ठीय सतह स्टरलाइज़ से 6 घंटा पोस्टमार्टम के भीतर निकासी शुरू करो।
  2. एक छुरी का उपयोग करना, एक अनुदैर्ध्य चीरा बाण midline के साथ, कपाल की पूरी पृष्ठीय सतह भर में, अंतर्निहित masseter मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए बनाते हैं। इस कटौती की लंबाई प्रजातियों और कुत्ते की उम्र पर निर्भर करेगा।
  3. कपाल का व्याख्यान चबूतरे वाला और दुम सीमाओं में अतिरिक्त 5 बनाने के लिए - दोनों पक्षों पर 10 सेमी सीधा कटौती, पारितक्रमशः आँखें और कान के पीछे हैैं, त्वचा पूरी तरह से परिलक्षित होने की अनुमति देने के लिए।
  4. एक छुरी का प्रयोग, खोपड़ी के बाण शिखा के लिए उनके लगाव से masseter मांसपेशियों को अलग और कपाल से किसी भी शेष संयोजी ऊतक परिमार्जन।
  5. एक oscillating हड्डी का प्रयोग एक परिधीय लाइन में खोपड़ी की टोपी में कटौती देखा। मस्तिष्क के पृष्ठीय सतह बेनकाब करने के लिए एक जांच का उपयोग या ड्यूरा के साथ किसी भी शेष संलग्नक तोड़ छुरी, और फिर ध्यान से खोपड़ी टोपी को हटा दें।
    सावधानी: हड्डी की मोटाई खोपड़ी में अलग-अलग क्षेत्रों में बदलता है, इसलिए सावधानी भी गहरी पैठ और अंतर्निहित मस्तिष्क को नुकसान नहीं करने के लिए प्रयोग किया जाना चाहिए।
  6. ऊपरी ग्रीवा कशेरुकाओं के बीच एक छुरी डालने से रीढ़ की हड्डी तोड़।
  7. एक हाथ धीरे मस्तिष्क लिफ्ट करने के साथ, एक छुरी का उपयोग सावधानी से कपाल Fossae से मस्तिष्क को मुक्त करने और जोड़ने वाली नसों और अपने उदर पक्ष पर स्थित रक्त वाहिकाओं को तोड़ने के लिए। धीरे ख उठाखोपड़ी के बाहर और DPBS के एक कंटेनर में बारिश।
    सावधानी: कुत्ते के मस्तिष्क की बड़ी घ्राण बल्ब पूर्वकाल कपाल खात में गहरी बढ़ा सकता है। केयर जब मस्तिष्क को हटाने के लिए लिया जाना चाहिए ताकि इन संरचनाओं की रक्षा करने के लिए।

3. हिप्पोकैम्पस विच्छेदन

  1. किसी भी रक्त को हटाने और एक 150 मिमी पेट्री डिश पर जगह नीचे पृष्ठीय पक्ष को Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (DPBS) में मस्तिष्क कुल्ला।
  2. धीरे-धीरे एक गीला मस्तिष्क चाकू और एक भी टुकड़ा है कि ब्लेड की पूरी लंबाई का इस्तेमाल का उपयोग करते हुए मध्य बाण विमान के माध्यम से longitudinally मस्तिष्क दोटूक। अतिरिक्त नीचे दबाव लागू होते हैं, या एक काटने का कार्य गति का उपयोग के रूप में इस ऊतकों को नुकसान पहुंचा सकता है मत करो।
  3. रखकर प्रत्येक गोलार्द्ध औसत दर्जे सतह, हिप्पोकैम्पस एक छुरी और ठीक संदंश का उपयोग काटना, और एक 35 मिमी टिशू कल्चर पकवान को हस्तांतरण।

4. तंत्रिका अग्रदूत साबित कोशिकाओं के अलगाव

  1. टी कीमालगभग 1 मिमी 3 टुकड़ों में एक छुरी ब्लेड का उपयोग कर इस मुद्दे नमूने हैं।
  2. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में ऊतक स्थानांतरण, 0.1% trypsin EDTA के 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में 7 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. ट्यूब के लिए सीरम मीडिया के 4 मिलीलीटर जोड़कर एंजाइम की प्रतिक्रिया को रोकें। 7 मिनट के लिए 100 XG पर centrifugation द्वारा निलंबन गोली और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  4. DPBS के 300 μl में गोली resuspended, और यंत्रवत् धीरे से ऊपर और नीचे pipetting, एक चिकनी homogenate रूपों तक एक 1000 μl विंदुक टिप का उपयोग करके अलग।
  5. ट्यूब के लिए सीरम मीडिया के 14 मिलीलीटर जोड़ें और एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन से गुजरती हैं। 7 मिनट के लिए 100 XG पर centrifugation द्वारा निलंबन गोली, सतह पर तैरनेवाला हटाने, और पूरा मध्यम विकास में resuspend।

5. neurosphere संस्कृति

  1. अलगाव पर प्राप्त सेल निलंबन से, Trypan नीले रंग की डाई बहिष्कार और एक HEMO का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गिनतीकोशिकामापी।
  2. 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं / 2 सेमी एक 6 अच्छी तरह से थाली की uncoated कुओं में से पूरा मध्यम विकास और बीज में सेल निलंबन पतला।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और> 95% से 14 के लिए नमी पर सेते - 28 दिन, हर 7 दिनों विकास मीडिया के 50% की जगह। neurospheres के व्यास नियमित रूप से उपाय। अगर व्यास में 100 माइक्रोन से परे बढ़ने की अनुमति दी, कोशिका मृत्यु और सहज भेदभाव neurospheres के भीतर हो सकता है।

6. neurosphere पारित

  1. एक अस्थायी संस्कृति, जब neurospheres लगभग 100 मीटर व्यास में पहुँचने के रूप में पारित होने के लिए, एक एकल ट्यूब में सभी neurosphere युक्त मीडिया गठबंधन। 7 मिनट के लिए 100 XG पर centrifugation द्वारा गोली और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  2. 0.1% trypsin EDTA के 1 मिलीलीटर में गोली Resuspend और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में 7 मिनट के लिए सेते हैं। धीरे विंदुक ऊपर और नीचे में 100 बार, एक 200 μl विंदुक टिप का उपयोग, dissociati सुनिश्चित करने के लिएneurospheres की पर।
  3. 7 मिनट के लिए 100 XG पर ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज के लिए सीरम मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़कर एंजाइम की प्रतिक्रिया को रोकें।
  4. सतह पर तैरनेवाला निकालें, 1 मिलीलीटर में सेल गोली पूरा मध्यम विकास resuspend और Trypan नीले रंग की डाई बहिष्कार और एक hemocytometer का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या गिनती।
  5. 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं / 2 सेमी एक 6 अच्छी तरह से थाली की uncoated कुओं में से पूरा मध्यम विकास और बीज में सेल निलंबन पतला। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और 14 के लिए> 95% आर्द्रता पर सेते - 28 दिन, विकास मीडिया के 50% की जगह हर 7 दिनों के लिए।

तंत्रिका अग्रदूत साबित कोशिकाओं के 7. पक्षपाती संस्कृति

  1. 0.1% जिलेटिन समाधान की पर्याप्त मात्रा पक्षपाती संस्कृति के लिए neurospheres प्रसंस्करण करने से पहले 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में एक टिशू कल्चर पकवान और इलाज की सतह को कवर करने के लिए जोड़ें।
  2. चल neurosphere संस्कृति से, एक एकल ट्यूब में सभी मीडिया गठबंधन। Neur गोली7 मिनट के लिए और सतह पर तैरनेवाला हटाने 100 XG पर centrifugation द्वारा ospheres।
  3. 0.1% trypsin EDTA के 1 मिलीलीटर में गोली Resuspend और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में 7 मिनट के लिए सेते हैं। धीरे विंदुक ऊपर और नीचे में 100 बार, एक 200 μl विंदुक टिप का उपयोग।
  4. सीरम मीडिया के 5 मिलीलीटर 7 मिनट के लिए 100 XG पर एंजाइम की प्रतिक्रिया और सेंट्रीफ्यूज को रोकने के लिए जोड़ें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 1 मिलीलीटर पूरा मध्यम विकास में सेल गोली resuspend और Trypan नीले रंग की डाई बहिष्कार और एक hemocytometer का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या गिनती।
  5. पूरा मध्यम विकास में सेल निलंबन पतला, टिशू कल्चर बोतल से जिलेटिन हटाने और 1 एक्स 10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी पर कोशिकाओं बीज।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और> 95% आर्द्रता पर कोशिकाओं को सेते हैं। जब तक संस्कृति लगभग 80% संगम (बाद लगभग 7 दिन) तक पहुँच जाता है हर तीन दिन ताजा, गरम, पूर्ण विकास मीडिया के साथ मीडिया बदलें।

8. Neurअल कॉलोनी बनाने परख

  1. गठबंधन तंत्रिका कॉलोनी बनाने सेल (NCFC) परख मीडिया घटकों: NCFC सीरम मुक्त मध्यम, प्रसार NS-ए, और कोलेजन समाधान (3 मिलीग्राम / एमएल)। 2 माइक्रोग्राम / एमएल हेपरिन, 20 एनजी / एमएल EGF, और 10 एनजी / एमएल bFGF के साथ इस मीडिया अनुपूरक।
  2. तंत्रिका कोशिकाओं कॉलोनी में परख मध्यम गठन के बाद हिप्पोकैम्पस ऊतक हदबंदी Resuspend, एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म। एक 35 मिमी संस्कृति डिश में 1.1 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल के एक प्रतिरूप घनत्व में कोशिकाओं बीज।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और> 95% आर्द्रता पर इस अर्द्ध ठोस कोलेजन मैट्रिक्स में कोशिकाओं को सेते हैं। 28 दिनों के लिए संस्कृति, विकास मीडिया के 50% की जगह हर 7 दिनों के लिए।

9. तंत्रिका अग्रदूत साबित कोशिकाओं के भेदभाव

  1. 5 माइक्रोग्राम / 2 सेमी laminin समाधान की पर्याप्त मात्रा differentia के लिए कोशिकाओं प्रक्रिया से पहले 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में एक टिशू कल्चर पकवान और इलाज की सतह को कवर करने के लिए जोड़ेtion।
    नोट: laminin समाधान निकालें और लेपित सतह DPBS में दो बार कुल्ला तुरंत बोने से पहले।
  2. जब passaging, DMEM-F12 में 1 एक्स 10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी पर सेल निलंबन के बीज (3: 1) मीडिया (पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस तक) 20 एनजी / एमएल EGF और 40 एनजी / एमएल bFGF पर साथ पूरक laminin लेपित संस्कृति पकवान।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और> 95% आर्द्रता में कोशिकाओं को सेते हैं और कोशिकाओं 3 दिन के लिए पैदा करने के लिए अनुमति देते हैं।
  4. पक्षपाती तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं को अलग करने के लिए, 3 दिन DMEM-F12 युक्त भेदभाव मीडिया के साथ मीडिया की जगह के बाद (3: 1) मीडिया 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म, 10 एनजी / एमएल मस्तिष्क व्युत्पन्न neurotrophic कारक (BDNF) के साथ पूरक।
  5. भेदभाव के दौरान हर 3 दिन मीडिया के 50% की जगह। 28 दिन - भेदभाव लगभग 21 से अधिक धीरे-धीरे होता है।
    सावधानी: एक बार जब कोशिकाओं को अलग करने के लिए शुरू कर दिया है, केवल एक ही ती पर मीडिया का 50% की जगहमुझे हवा के लिए जोखिम के रूप में कोशिकाओं के स्वास्थ्य पर हानिकारक प्रभाव हो सकता है।

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Representative Results

इन विट्रो तंत्रिका अग्रदूत assays, न्यूरोजेनेसिस और तंत्रिका अग्रदूत सेल आबादी के उपयोग के माध्यम से विशेषता है और वयस्क कुत्ते हिप्पोकैम्पस के dorsoventral अक्ष भर में तुलना की गई। तंत्रिका कोशिकाओं अग्रदूत अलग हिप्पोकैम्पस के ऊतकों से निकाली गई अलगाव के 14 दिनों के भीतर चल गठन neurospheres, संस्कृति के दिन 100 28 से माइक्रोन की एक व्यास तक पहुंच गया। पृष्ठीय और उदर वियोजन से निकाली गई Neurospheres मतलब आकार में कोई अंतर नहीं दिखाया है, और एकल कक्षों में एंजाइमी हदबंदी के बाद, चल neurosphere संस्कृतियों के रूप में passaged किया जा सकता है। दोनों हिप्पोकैम्पस क्षेत्रों से माध्यमिक चल neurospheres पारित होने से 5 दिनों के भीतर बनाने में सक्षम थे। जब 1 एक्स 10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी पर वरीयता प्राप्त 0.1% जिलेटिन लेपित संस्कृति बोतल पर, तंत्रिका कोशिकाओं अग्रदूत के रूप में भी पक्षपाती monolayers (चित्रा 1 ए) पैदा करने में सक्षम थे। कोई रूपात्मक मतभेद betwee मनाया गयाn पृष्ठीय और उदर हिप्पोकैम्पस तंत्रिका कोशिकाओं अग्रदूत और दोनों पक्षपाती संस्कृतियों किसी भी पारित होने के समय (चित्रा 1 बी) में धीमा मनाया बिना 10 से अधिक जनसंख्या दोहरीकरण से गुजरना करने में सक्षम थे। Nestin और Sox2 पक्षपाती संस्कृति में तंत्रिका स्टेम सेल जीन अभिव्यक्ति हिप्पोकैम्पस dorsoventral अक्ष भर में काफी अलग (चित्रा 2) नहीं था। जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति के अधिक व्यापक लक्षण वर्णन, इन कोशिकाओं के तंत्रिका अग्रदूत पहचान की पुष्टि, हमारे प्रकाशित डेटा 7 में सूचना दी है।

एक अनुकूलित तंत्रिका कॉलोनी बनाने परख 4,6 का प्रयोग हम आदेश पृष्ठीय भर में तंत्रिका अग्रदूत सेल आबादी और कुत्ते हिप्पोकैम्पस के उदर उपक्षेत्र में संभावित मतभेद यों तो में तंत्रिका अग्रदूत सेल आवृत्ति का आकलन किया। प्रकोष्ठों एक अर्द्ध ठोस कोलेजन मैट्रिक्स है कि सेल संलयन precludes में प्रतिरूप घनत्व पर वरीयता प्राप्त थे, और 28 दिनों के लिए सुसंस्कृत (चित्रा 3 ए एफ = 96.8; पी = 0.001, चित्रा 3 बी )।

भेदभाव शर्तों के तहत, पक्षपाती कुत्ते तंत्रिका कोशिकाओं अग्रदूत सकल आकृति विज्ञान में प्रगतिशील परिवर्तन से पता चला है, अब और अधिक विस्तृत प्रक्रियाओं का विकास। न्यूरोनल (βIII ट्यूबिलिन) और glial (glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन, GFAP) के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति मार्करों भी भेदभाव (चित्रा 4) निम्न वृद्धि हुई है। कोई महत्वपूर्ण अंतर पृष्ठीय और उदर वियोजन के बीच सकारात्मक लेबल की कोशिकाओं की संख्या में मनाया। हमारे पहले प्रकाशित डेटा इन प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की पुष्टि होती है, ऊपर से विनियमन उनकी जुड़े जीन के तंत्रिका के नीचे विनियमन के साथ प्रदर्शन है 28 दिन की अवधि भेदभाव पर 7 अग्रदूत जीनों।

आकृति 1
चित्रा 1:। पृष्ठीय और उदर हिप्पोकैम्पस क्षेत्रों से पृथक प्रौढ़ कुत्ते हिप्पोकैम्पस तंत्रिका अग्रदूत साबित कोशिकाओं के इन विट्रो विस्तार में वयस्क कुत्ते हिप्पोकैम्पस तंत्रिका अग्रदूत साबित कोशिकाओं (ए) चल neurospheres के रूप में या (बी) के रूप में एक पक्षपाती monolayer विस्तार कर रहे हैं (सी) एक के रूप में। पक्षपाती monolayer इन तंत्रिका कोशिकाओं अग्रदूत गति को दोगुना करने में उल्लेखनीय गिरावट के बिना 10 से अधिक बार पारित होने से गुजरना सकता है। एन = 5; पैमाने = 50 माइक्रोन। प्रकाशित आंकड़ा 7 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2:। Proliferating एडल्ट कुत्ते हिप्पोकैम्पस तंत्रिका अग्रदूत साबित कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति तंत्रिका स्टेम सेल जीन की अभिव्यक्ति (ए) Nestin और (बी) Sox2 पक्षपाती proliferative संस्कृति की शर्तों के तहत वयस्क कुत्ते हिप्पोकैम्पस तंत्रिका कोशिकाओं में अग्रदूत पुष्टि की गई। इन जीनों की अभिव्यक्ति दोनों पृष्ठीय और उदर हिप्पोकैम्पस ली गई कोशिकाओं में बराबर था। एडल्ट कुत्ते fibroblasts रिश्तेदार जीन अभिव्यक्ति में मतभेदों की तुलना करने के लिए एक नियंत्रण रेखा के रूप में इस्तेमाल किया गया। एन = 5; त्रुटि सलाखों = SEM। प्रकाशित आंकड़ा 7 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। तंत्रिका कॉलोनी बनाने परख (ए)एडल्ट कुत्ते तंत्रिका कोशिकाओं अग्रदूत, एक अर्द्ध ठोस कोलेजन मैट्रिक्स में प्रतिरूप घनत्व वरीयता प्राप्त, संस्कृति के 28 दिनों के भीतर फार्म neurospheres। (बी) के तंत्रिका कोशिकाओं अग्रदूत पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस से निकाली गई से निकाली गई उन लोगों की तुलना में प्रति इकाई क्षेत्र neurospheres की काफी अधिक संख्या उत्पन्न उदर हिप्पोकैम्पस। एन = 5; त्रुटि सलाखों = SEM; पैमाने = 50 माइक्रोन। प्रकाशित आंकड़ा 7 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। विभेदित एडल्ट कुत्ते हिप्पोकैम्पस तंत्रिका अग्रदूत साबित कोशिकाओं के Immunocytochemistry जब 28 दिनों के लिए BDNF में सुसंस्कृत, वयस्क कुत्ते दोनों पृष्ठीय और उदर हिप्पोकैम्पस से तंत्रिका व्यापारियों परिपक्व न्यूरोनल (βIII ट्यूबिलिन पुलिस में अंतरsitive) और glial (GFAP सकारात्मक) सेल प्रकार के। एन = 5; पैमाने = 50 माइक्रोन। प्रकाशित आंकड़ा 7 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल सेल व्यवहार्यता अधिकतम करने के लिए अनुकूल संस्कृति की स्थिति बनाए रखने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। गति और देखभाल निकासी, अलगाव और विस्तार के दौरान लिए गए महत्वपूर्ण महत्व का है। पक्षपाती monolayer विस्तार की स्थापना के लिए एक महत्वपूर्ण कदम प्राथमिक neurospheres के प्रभावी हदबंदी है। पारित होने के बाद, अपर्याप्त अलग neurospheres माध्यमिक चल neurospheres उत्पन्न हो सकता है। मीडिया परिवर्तन के दौरान, इन neurospheres, हटाया जा सकता है अलग और पक्षपाती monolayer पारित होने के लिए reseeded। इसके विपरीत, यदि पोस्ट-हदबंदी सेल व्यवहार्यता 80% नीचे है, यह अत्यधिक pipetting का संकेत हदबंदी के दौरान हो सकता है। तंत्रिका कोशिकाओं अग्रदूत, और विशेष रूप से उनके समकक्षों विभेदित में, शारीरिक सीमा के बाहर पीएच में परिवर्तन, और हवा के संपर्क के प्रति संवेदनशील हैं। अचानक व्यापक कोशिका मृत्यु का अवलोकन इन कारकों के कारण हो सकता है। नतीजतन, मीडिया चान के दौरान एक महत्वपूर्ण कदमGES मीडिया के लिए नए सिरे से हर बार किए जाने के लिए, और मात्रा का केवल 50% के लिए प्रतिस्थापित किया जा रहा है। अंत में, mitogenic कारकों EGF और bFGF विट्रो 22,23 में अस्तित्व और हिप्पोकैम्पस तंत्रिका व्यापारियों के प्रसार के सीरम मुक्त शर्तों के तहत समर्थन करते हुए, इन mitogens के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया सेल विकासात्मक उम्र और mitogenic एकाग्रता 24,25 पर अत्यधिक निर्भर है। इसलिए, इन घटकों में न्यूनतम प्रयोगात्मक बदलाव सुनिश्चित संगत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सेल संस्कृतियों पैदा करने के लिए महत्वपूर्ण है।

अधिकतम व्यवहार्यता के लिए, कोशिकाओं 6 घंटे पोस्टमार्टम के भीतर संस्कृति के लिए वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए। हालांकि, निकाले मस्तिष्क अस्थायी रूप से 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में संग्रहित किया जा सकता है। इस संशोधन अलगाव के लिए अनुमति हो सकती है सेल उपज 26,27 में कम से कम कमी के साथ 24 घंटे तक की देरी हो। संस्कृति मीडिया के विकास कारक पूरकता भी प्रसार बढ़ाने के लिए या विभिन्न प्रोत्साहित करने के लिए संशोधित किया जा सकता हैविशिष्ट तंत्रिका कोशिका प्रकार के ntiation। इंसुलिन की तरह वृद्धि कारक 1 (100 एनजी / एमएल पर), इन विट्रो 28,29 में कृंतक तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं पर एक सहायक प्रभाव है दिखाया गया है भेदभाव के तहत की स्थिति समर्थक न्यूरोनल कारक BDNF 30 कारकों जैसे के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि इंटरल्युकिन 7 के रूप में या retinoic एसिड (500 एनजी / एमएल) पर (0.1 सुक्ष्ममापी पर) न्यूरोनल उपप्रकार या glial भेदभाव 31,32 की दिशा में एक पूर्वाग्रह प्रेरित करने के लिए।

कि क्या चल neurospheres के रूप में या एक पक्षपाती monolayer के रूप में तंत्रिका कोशिकाओं अग्रदूत का विस्तार करने पर फैसला काफी हद तक वांछित बहाव के अनुप्रयोगों और संस्कृति की विशेषताओं पर निर्भर करता है। जबकि neurosphere संस्कृति प्रणाली सरलीकृत और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, यह कोशिकाओं के सजातीय आबादी उत्पन्न करने की क्षमता में सीमित है। प्रत्येक क्षेत्र के भीतर जटिल microenvironment, apoptosis और सहज भेदभाव, एक विषम आबादी 33 को प्रोत्साहित करने को बढ़ावा देने के कर सकते हैं, जबकि प्रतिनिधिneurospheres कि तंत्रिका अग्रदूत सेल आबादी 34 की मात्रा का ठहराव उलझाना सकता है की मिश्रित संलयन। इसके अलावा, दोहराया यांत्रिक neurosphere पारित होने के लिए आवश्यक हदबंदी भी हानिकारक तनाव, वार्धक्य या यहां तक ​​कि सेल मौत का कारण हो सकता है। वैकल्पिक हदबंदी एंजाइम का उपयोग करते हैं, इस तरह के papain के रूप में, उसके एवज में सेल व्यवहार्यता 16 प्रभावित कर सकता है। इसके विपरीत, पक्षपाती monolayer संस्कृति प्रणाली, पर्यावरण mitogens करने के लिए और अधिक समान जोखिम के साथ, सेल प्रकार और अधिक सममित संभाग में अधिक से अधिक एकरूपता को प्रोत्साहित करती है। इस प्रणाली की कोशिकाओं के एक आला स्वतंत्र आबादी, कुंजी स्टेम सेल मार्कर 35,36 की अभिव्यक्ति के आधार पर उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है। इस प्रणाली के सेलुलर पालन को बढ़ावा देने के लिए पूर्व लेपित संस्कृति वाहिकाओं के उपयोग की आवश्यकता है। संस्कृति सब्सट्रेट के चुनाव को ध्यान से विचार किया जाना चाहिए, क्योंकि यह सुसंस्कृत तंत्रिका व्यापारियों 25,37 के भेदभाव प्रोफ़ाइल पर महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है।

एचअरे हम ताजा पोस्टमार्टम के ऊतकों से अलगाव, विस्तार और वयस्क कुत्ते हिप्पोकैम्पस तंत्रिका अग्रदूत साबित कोशिकाओं के भेदभाव के लिए प्रभावी प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एडल्ट कुत्ते तंत्रिका व्यापारियों साहित्य 18 में कम प्रतिनिधित्व कर रहे हैं; उनके अलगाव और विस्तार के लिए पूरा प्रोटोकॉल, यहां तक कि कम तो 17 के साथ। हमारे प्रोटोकॉल तो इस मूल्यवान पशु मॉडल के बारे में जागरूकता बढ़ाने के लिए और अध्ययन की इस मामूली संख्या के लिए एक महत्वपूर्ण इसके अलावा प्रतिनिधित्व करने के लिए सेवा कर सकते हैं। महत्व का है, हमारी अनोखी विधि का उपयोग कर, वयस्क कुत्ते हिप्पोकैम्पस तंत्रिका व्यापारियों को सफलतापूर्वक 10 से अधिक जनसंख्या दोहरीकरण का विस्तार किया जा सकता है। वयस्क कुत्ते हिप्पोकैम्पस तंत्रिका अग्रदूत का उपयोग कर ऐसा ही एक अध्ययन की रिपोर्ट है कि बड़े neurospheres, 100 पर passaged - 150 माइक्रोन व्यास में, पांचवीं पीढ़ी के 17 परे प्रसार रह गए हैं। जैसा कि हमारे प्रोटोकॉल में उल्लेख किया है, अत्यधिक neurosphere विकास सहज भेदभाव और apoptosis प्रोत्साहित कर सकते हैं, जो धारावाहिक बीतने पर हो सकता है lएड करने के लिए इस proliferative क्षमता कम हो। हम यह भी शास्त्रीय neurosphere विस्तार प्रणाली 17-21 के लिए एक विकल्प के रूप में, इस सेल की आबादी का पक्षपाती monolayer विस्तार के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस वैकल्पिक व्यवस्था सेलुलर पर्यावरण पर उपयोगकर्ता अधिक नियंत्रण देता है, और काफी, इन कोशिकाओं के लिए बहाव के अनुप्रयोगों की व्यापकता को बढ़ाता प्ररूपी homogenization और निर्देशित neuronal भेदभाव 35,38 लिए क्षमता के साथ।

सुसंस्कृत वयस्क कुत्ते हिप्पोकैम्पस तंत्रिका कोशिकाओं अग्रदूत सेलुलर और neurobiological अनुसंधान क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला में आवेदन किया है। कुत्ते मस्तिष्क मौजूदा कृंतक मॉडल की तुलना में मानव मस्तिष्क के लिए एक करीब अनुरूपता के पास। जैसे, वयस्क कुत्ते तंत्रिका कोशिकाओं अग्रदूत एक महत्वपूर्ण है, अभी तक understudied, संसाधन प्रतिनिधित्व करते हैं। इन कोशिकाओं पुनर्योजी चिकित्सा के विकास के लिए मानव में वयस्क न्यूरोजेनेसिस पीछे तंत्र में और अधिक जानकारी हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और है कि Targएट इस प्रक्रिया।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,000 μl filtered pipette tip Axygen TF1000
150 mm Petri dish BD Biosciences 351058
15 ml centrifuge tubes Greiner Bio One 188271
200 μl filtered pipette tip Axygen TF200
24 well culture plate Greiner Bio One 662160
35 mm tissue culture dish BD Biosciences 353001
40 µm cell strainer BD Biosciences 352340
6 well culture plate BD Biosciences 351146
B-27 Supplement (50x) serum free Life Technologies  17504044
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Life Technologies 13256029
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) Millipore GF029
Collagen solution Stem Cell Technologies 04902 Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 
DMEM (4.5 g/L, D-glucose) 500 ml Life Technologies 11960044
DPBS Life Technologies 14190250
Epidermal growth factor (EGF) BD Biosciences 354001
F-12 nutrient mixture (Ham) (1x) Liquid Life Technologies 31765035
Fetal bovine serum (FBS) Life Technologies 16141079
Gelatin from Porcine Skin Type A Sigma-Aldrich G1890
L-alanyl-L-glutamine dipeptide (GlutaMAX) Life Technologies 35050061
Heparin sodium salt from (porcine) Sigma-Aldrich H314950KU
Laminin (mouse) Life Technologies 23017015
NCFC serum free medium (NeuroCult) Stem Cell Technologies 5720 Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 
Proliferation NS-A (NeuroCult) Stem Cell Technologies 05773 Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit Cat: 05740, and NS-A Prolieration Kit (Rat) Cat: 05771  from Stem Cell Technologies.
NSC basal medium (Rat; NeuroCult) Stem Cell Technologies 5770 Also available in the Neurocult NS-A Prolieration Kit (Rat) from Stem Cell Technologies. Cat: 05771 
Penicillin/Streptomycin (5,000 U/ml) Life Technologies 15070063
Povidone-iodine Munipharma Betadine
Trypan blue (0.4%) Life Technologies 15250061
Trypsin EDTA Life Technologies 25200056
Class II biological safety cabinet ThermoFisher Scientific Safe 2020 1.2
Brain knife (disposable) Macroknife
Cell culture incubator ThermoFisher Scientific HERAcell 150i
Centrifuge Hettich Universal 320R
Dumont #5 Forceps Dumont
Easypet Electric pipette Eppindorf 
Hemocytometer Boeco Bright-Line Improved Neubauer
Manual pipettes Eppindorf research
Oscillating bone saw 
Scalpel blades (No.21) Paramount
Scissors  Delta
Water bath Grant JB Aqua 18 plus

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विकास जीवविज्ञान अंक 117 कुत्ते तंत्रिका व्यापारियों सेल संस्कृति neurosphere पक्षपाती monolayer भेदभाव।
अलगाव और वयस्क कुत्ते हिप्पोकैम्पस तंत्रिका व्यापारियों का विस्तार
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Duncan, T., Lowe, A., Dalton, M. A., Valenzuela, M. Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors. J. Vis. Exp. (117), e54953, doi:10.3791/54953 (2016).

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