Summary
송곳니 뇌는 성인 신경 연구에 귀중한 모델입니다. 분리 및 기본 뇌 조직에서 성인 개 해마 신경 전구 세포 확장을위한 프로토콜은 여기에 표시됩니다.
Protocol
뉴 사우스 웨일즈, 호주 법에 따라 사후 부검의 뇌 조직은 연구와 관련이없는 이유로 안락사 성인 개에서 인수되었다.
문화 매체의 1. 준비
- 100 ml의 증류수에 젤라틴 분말 0.1 g을 첨가하고, 용해 될 때까지 37 ℃에서 교반하여 0.1 % 젤라틴 용액을 준비한다. 15 분 동안 UV 조사에 의한 살균 용액. 이 매체는 1개월까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- DMEM 500 ㎖ (4.5 g / L의 D-포도당)로 F-12의 167 ml에 추가하여 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM) 및 영양 혼합 F12의 : 1 비율 3를 준비합니다. (1 % 최종 농도) 페니실린 / 스트렙토 마이신 솔루션의 6.7 ML을 추가합니다. 이 매체 1 개월까지 4 ℃에서 어둠 속에서 저장 될 수있다.
- DMEM (4.5 g / L D- 글루코스), 440 mL의 조합으로 혈청 배지 500 ml를 준비 5 ml의 L- 알라 닐 -L- 글루타민 디 펩티드 (200 mM)을 페니실린 / 스트렙토 마이신 5 ㎖ 태아 bovin 50㎖의즉 혈청 (FBS). 이 매체 1 개월까지 4 ℃에서 어둠 속에서 저장 될 수있다.
- 완전 성장 배지는 줄기 세포의 신경 구성 (NSC) 기본 배지 증식 신경 보충-A (NS-A), 2 % FBS, 2 μg의 / ㎖ 헤파린, 20 ng / ml의 상피 세포 성장 인자 (EGF), 10 ng의 / ㎖ 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF). 수욕에서 37 ° C이 매체는, 신선한 뇌 해부 직전에, 따뜻한합니다.
2. 뇌 추출
- 포비돈 - 요오드를 사용하여 강아지의 머리의 등쪽 표면을 살균하여 6 시간의 사후 내에서 추출을 시작합니다.
- 메스를 사용하여 기본 턱 근육을 노출, 두개골의 전체 지느러미 표면을 가로 질러, 시상 중간 선을 따라 세로 절개를합니다. 이 컷의 길이는 강아지의 종 및 연령에 따라 달라집니다.
- 두개골의 주동이의와 꼬리 국경에서 추가로 5 - - 양쪽에 10cm 수직 컷 통과각각 눈과 귀 뒤에 보내고는 피부가 충분히 반영 될 수 있도록합니다.
- 메스를 이용하여 두개골의 시상 크레스트 그들의 첨부의 턱 근육을 분리하고, 두개의 남아있는 결합 조직을 긁어.
- 발진 뼈를 사용하여 원주 라인에 두개골의 캡을 절단 보았다. 프로브를 사용하거나 경질에 남아있는 첨부 파일을 절단 메스 다음 조심스럽게 두개골 캡을 제거하면 뇌의 등쪽 표면을 노출합니다.
주의 : 뼈의 두께는 두개골에서 다른 지역에서 다르므로주의가 너무 깊이 침투하여 기본 뇌에 손상을주지하기 위해 행사해야합니다. - 상부 경추 사이의 메스를 삽입하여 척수 절단.
- 부드럽게 머리를 들어 올려 한 손으로 조심스럽게 두개골 베루스 포 사이 협곡에서 뇌를 확보하고 복부 측면에있는 연결하는 신경과 혈관을 절단하기 위해 메스를 사용합니다. 조심스럽게 B를 해제두개골의 출력 및 DPBS의 용기에 비.
주의 : 개 뇌의 큰 후각 전구는 앞쪽 뇌 포사에 깊은 연장 할 수있다. 뇌를 제거 할 때 이러한 구조를 유지하기 위해주의를 기울여야한다.
3. 해마 해부
- 150mm 배양 접시에있는 혈액을 제거하고 아래 지느러미 측면을 배치하는 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS)의 뇌를 씻어.
- 천천히 젖은 뇌 칼 블레이드의 전체 길이를 이용하여 하나의 슬라이스를 이용하여 중앙 시상면을 통해 종 방향으로 머리를 이등분. 추가 하락 압력을 적용하거나이 조직에 손상을 줄 수 등의 절단 동작을 사용하지 마십시오.
- 각 반구의 내측은, 최대 표면 메스 미세 핀셋을 이용하여 해마를 해부하고, 35mm 조직 배양 접시에 옮긴다 배치.
신경 전구 세포의 분리 4.
- t을 말하다약 1mm 3 조각으로 메스 블레이드를 사용하여 문제 샘플.
- , 15 ㎖의 튜브에 조직을 이동시켜, 0.1 % 트립신 EDTA 2 mL를 넣고 37 ℃ 수조에서 7 분 동안 배양한다.
- 튜브 혈청 배지 4㎖를 첨가하여 효소 반응을 중지. 7 분 100 XG에서 원심 분리하여 현탁액을 펠렛과 뜨는을 제거합니다.
- DPBS 300 μL에 펠렛을 재현 탁시키고, 기계적으로 부드럽게 부드러운 균질이 형성 될 때까지, 1000 μL 피펫 팁을 사용하여 상하로 피펫 팅에 의해 해리.
- 튜브에 혈청 미디어의 14 ML을 추가하고 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 전달합니다. 7 분 동안 100 XG에서 원심 분리하여 현탁액을 펠렛 뜨는을 제거하고 전체 성장 매체에 재현 탁.
5. Neurosphere 문화
- 분리로 얻어진 세포 현탁액에서 트립 판 블루 염색 배제 및 과다를 사용하여 생존 세포의 수를 계산사이토.
- 6- 웰 플레이트의 웰을 코팅에 1 × 105 세포 / cm 2의 완전한 성장 배지와 시드의 세포 현탁액을 희석.
- 37 ° C (14), 5 % CO 2> 95 % 습도에서 품어 - 28 일 7 일마다 성장 미디어의 50 %를 교체합니다. neurosphere를 정기적의 직경을 측정한다. 직경 100 μm의를 초과 할 수있는 경우, 세포 사멸 및 자연 분화는 neurosphere를 내 발생할 수 있습니다.
6. Neurosphere 항로
- neurosphere를 약 100 μm의 직경에 도달 부동 문화, 같은 통로에 하나의 튜브에 모든 neurosphere 포함 된 미디어를 결합한다. 7 분 100 XG에서 원심 분리하여 펠렛과 뜨는을 제거합니다.
- 0.1 % 트립신 EDTA 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁하고, 37 ℃에서 수조에 7 분 동안 배양한다. 부드럽게 피펫 100 배의 아래, 200 μL 피펫 팁을 사용 dissociati 있도록neurosphere를의에.
- 7 분 동안 100 XG에 튜브 원심 혈청 배지 5 ㎖를 첨가하여 효소 반응을 중지.
- 상층 액을 분리 한 용액에 세포 펠렛 완전 성장 배지를 재현 탁하고 트리 판 블루 염색 배제과 혈구를 사용하여 생존 세포의 수를 계산.
- 6- 웰 플레이트의 웰을 코팅에 1 × 105 세포 / cm 2의 완전한 성장 배지와 시드의 세포 현탁액을 희석. 7 일마다 성장 배지의 50 %를 교체 28 일 - 37 ° C, 14, 5 % CO 2 및> 95 %의 습도에서 인큐베이션.
7. 자기편 문화 신경 전구체 세포
- 종래 접착 배양 neurosphere를 처리로 1 시간 동안 37 ℃의 배양기에서 조직 배양 접시 경화의 표면을 커버하기 위해 0.1 % 젤라틴 용액의 충분한 양을 추가한다.
- 부동 neurosphere 문화에서 하나의 튜브에 모든 미디어를 결합한다. neur 펠렛100 XG에 원심 분리하여 ospheres 7 분 및 뜨는을 제거합니다.
- 0.1 % 트립신 EDTA 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁하고, 37 ℃에서 수조에 7 분 동안 배양한다. 부드럽게 피펫과 100 배 아래로, 200 μL 피펫 팁을 사용.
- 7 분 100 XG에 효소 반응과 원심 분리기를 중단 혈청 미디어의 5 ML을 추가합니다. 뜨는을 취소하고 전체 성장 매체 1 ML에있는 세포 펠렛을 재현 탁하고 트리 판 블루 염색 제외하고 혈구를 사용하여 가능한 세포의 수를 계산합니다.
- 완전 성장 배지에서 세포 현탁액을 희석하여 조직 배양 플라스크에서 젤라틴을 제거하고 / cm (2) 1 × 104 세포의 세포를 시드.
- 37 ° C, 5 % CO 2 및> 95 %의 습도에서 세포를 인큐베이션. 문화가 약 80 %의 합류 (후 약 7 일)에 도달 할 때까지 3 일마다 신선한, 예열 완료 성장 매체와 매체를 교체합니다.
8. Neur알 콜로니 형성 분석
- 신경 콜로니 형성 세포 (NCFC) 분석의 미디어 구성 요소를 조합 해 NCFC 혈청 배지 증식 NS-A, 콜라겐 용액 (3 ㎎ / ㎖). / ㎖ 헤파린 2 μg의 20 NG / ㎖ EGF, 10 NG / ㎖의 bFGF와 함께이 미디어를 보충합니다.
- 분석 배지 콜로니를 형성하는 신경 세포의 해마 조직 해리 재현 탁 후에, 수욕에서 37 ℃로 예열. 35 mm dish에 1.1 × 105 세포 / ml의 밀도로 클론 세포 종자.
- 37 ° C, 5 % CO 2 및> 95 %의 습도에서이 반고체 콜라겐 매트릭스 세포를 인큐베이션. 이십팔일위한 배양 7 일마다 성장 배지의 50 %를 교체.
신경 전구 세포의 분화 9.
- differentia 위해 세포를 가공하기 전에 24 시간 동안 37 ℃의 배양기에서 조직 배양 접시 경화의 표면을 덮도록 5 μg의 / cm 2 라미닌 용액의 충분한 양을 추가기.
참고 : 라미닌 용액을 제거하고 파종 직전에 DPBS 두 번 코팅 된 표면을 씻어. - 계대 때 DMEM-F12에서 1 × 104 세포 / ㎠의 세포 현탁액 시드 (3 : 1) 상에 20 NG / ㎖ EGF 40 NG / ㎖의 bFGF로 보충 된 용지 (미리 예열 37 ° C까지) 라미닌은 배양 접시 코팅.
- 37 ° C, 5 % CO 2 및> 95 %의 습도에서 세포를 인큐베이션하고 세포를 3 일 동안 증식 할 수있다.
- (1 3) 미디어가 37 ° C로 미리 예열, 10 ng의 신경 영양 인자 (BDNF) 파생 / ㎖ 뇌 보충 3 일 DMEM-F12를 포함하는 차별화 미디어와 미디어를 교체 한 후, 부착 된 신경 전구 세포를 구분합니다.
- 분화 동안 3 일마다 미디어의 50 %를 교체합니다. 이십팔일 - 차별화는 약 21를 통해 점진적으로 발생합니다.
주의 : 세포 분화하기 시작하면, 하나의 TI의 매체의 50 %를 대체공기에 노출 같은 날 세포의 건강에 유해한 영향을 미칠 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
시험 관내 신경 전구 분석법, 신경 및 신경 전구 세포 집단을 사용하여 특징 및 성인 송곳니 해마의 dorsoventral 축간에 비교 하였다. 절연 해마 조직 유래의 신경 전구 세포를 배양하여 100 μm의 28 일의 직경에 도달 분리 후 14 일 이내에 플로팅 neurosphere를 형성. 지느러미와 복부 균주에서 유래 neurosphere를가 평균 크기에 차이가 없었다, 단일 세포로 효소 분해 다음, neurosphere 문화를 떠로 계대 수 있습니다. 모두 해마 영역에서 보조 부동 neurosphere를이 유로 5 일 이내에 형성 할 수 있었다. 0.1 % 젤라틴 코팅 된 배양 플라스크에 1 × 104 세포 / cm 2 시딩 때 신경 전구 세포는 또한 부착 단층 (도 1a)을 증식 할 수 있었다. 어떤 형태 학적 차이 betwee 관찰되지 않았다n은 지느러미와 복부 해마 신경 전구 세포 모두 자기편 문화는이 통과 시간 (그림 1B)에 둔화 관찰하지 않고 10 인구의 분열을받을 수 있었다. 자기편 문화에 네 스틴 및 Sox2이 신경 줄기 세포의 유전자 발현 (그림 2) 해마 dorsoventral 축에서 유의 한 차이가 있었다. 이러한 세포의 신경 전구체의 신원을 확인하는 유전자 및 단백질 발현의보다 광범위한 특성은, 우리의 게시 된 데이터 (7)에보고됩니다.
개조 신경 콜로니 형성 분석 4,6- 사용 우리는 등쪽에 걸쳐 신경 전구 세포 집단 및 개과 해마 복부 하위 영역의 전위 차이를 정량화하기 위해 신경 전구 세포의 빈도를 평가 하였다. 세포를도 3a (세포 융합을 배제 반고체 콜라겐 매트릭스 클론 밀도로 접종, 28 일간 배양했다 F = 96.8, P = 0.001도 (b) ).
분화 조건에서 접착 송곳니 신경 전구 세포가 더 길고 복잡한 공정 개발 심한 형태에 누진 변화를 보였다. 신경 (βIII - 튜 불린)과 아교 (폐해의 섬유 성 산성 단백질, GFAP)에 대한 단백질 발현 마커는 분화 (그림 4) 다음 증가했다. 큰 차이는 등쪽 및 복부 균주간에 긍정적 표지화 된 세포의 수는 관찰되지. 우리의 이전에 게시 된 데이터는 최대 - 규제 관련 유전자의 신경의 하향 조절과 함께 보여,이 단백질 발현 변화를 확증 28 일 분화 기간 7 위에 전구체 유전자.
그림 1 :. 지느러미와 복부 해마 영역에서 고립 된 성인 개 해마 신경 전구체 세포의 체외 확장에서 성인 개 해마 신경 전구 세포는 (A) 부동 neurosphere를 또는 접착 성 단층 (B)로 확장됩니다 (C)가있다. 부착 단층이 신경 전구 세포는 속도를 두 배로 크게 감소하지 않고 10 배 이상의 통로를받을 수 있습니다. N = 5; 규모 = 50 μm의. 게시 된 그림 7에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
/ftp_upload/54953/54953fig2.jpg "/>
그림 2. 증식 성인 개 해마 신경 전구 세포에서 유전자 발현의 신경 줄기 세포의 유전자 발현 (A) 네 스틴 및 (B) Sox2이가 부착 증식 배양 조건 성인 송곳니 해마 신경 전구 세포에서 확인되었다. 이들 유전자의 발현은 지느러미와 복부 해마 유래 세포 모두에서 동등한이었다. 송곳니 성인 섬유 아세포의 상대 유전자 발현의 차이를 비교하기 위해 제어 라인으로 사용 하였다. N = 5; 오류 바 = SEM. 게시 된 그림 7에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 신경 식민지 형성 분석 (A)반고체 콜라겐 매트릭스 내로 클론 밀도로 시딩 성인 송곳니 신경 전구 세포, 배양 28 일 이내 폼 neurosphere를. (B) 지느러미 해마 유래의 신경 전구 세포로부터 유도 된 것보다 단위 면적 당 neurosphere를 상당히 큰 숫자를 생성 복부 해마. N = 5; 오류 바 = SEM; 규모 = 50 μm의. 게시 된 그림 7에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 차별화 된 성인 개 해마 신경 전구체 세포의 면역 세포 화학 이십팔일에 대한 BDNF에서 배양, 지느러미 및 복부 해마 모두에서 성인 개 신경 전구체 성숙한 신경 세포 (βIII - 튜 불린 포로 분화sitive)과 아교 (GFAP 양성) 세포 유형. N = 5; 규모 = 50 μm의. 게시 된 그림 7에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 세포 생존 능력을 최대화하기위한 바람직한 배양 조건을 유지하기 위해 최적화된다. 추출, 분리 및 확장 동안 촬영 속도 및 관리가 매우 중요하다. 접착 단층 확장을 설정하기위한 중요한 단계는 기본 neurosphere를 효과적으로 분리한다. 통과 후, 충분히 neurosphere를 보조 부동 neurosphere를 생성 할 수 있습니다 해리. 미디어 변화하는 동안,이 neurosphere를이 제거 해리와 부착 단층 통과를 위해 시드 할 수있다. 이후 해리 세포 생존율이 80 % 미만일 경우에는 반대로,이 해리 동안 과도한 피펫을 나타낼 수있다. 신경 전구 세포, 특히 그들의 대응 분화에서 생리적 범위를 벗어난 pH의 변화, 및 공기에 노출 민감하다. 급격한 확산 세포사의 관찰이 요인에 기인 할 수있다. 미디어 찬 동안 따라서, 중요한 단계GES 미디어 신선한마다 이루어져야하고, 체적의 50 %를 대체하는 것이다. 분열 촉진 인자 EGF 및 bFGF를 시험관 (22, 23)에서 무 혈청 조건 하에서 생존과 해마 신경 전구체의 증식을 지원하는 동안 마지막으로,이 분열 촉진 물질에 대한 세포 반응은 세포 발달 연령 및 분열 촉진 농도 (24, 25)에 크게 의존한다. 따라서, 이들 구성 요소의 최소한의 실험적인 변화를 보장하는 것은 일관된 재현성 세포 배양을 발생 중요하다.
최대 생존을 위해, 세포 6 시간 후 부검에서 문화 시드해야합니다. 그러나, 추출 된 뇌 일시적 4 ℃에서 PBS에 저장 될 수있다. 이 수정 세포 수율 26, 27 최소한의 감소와 24 시간까지 지연 될 격리를 허용 할 수있다. 배양 배지 중의 성장 인자의 보충은 증식을 향상 또는 differe을 촉진하도록 변형 될 수있다특정 신경 세포 유형의 ntiation. 분화를위한 조건 프로 신경 인자가 BDNF 30 요인 예와 함께 사용될 수 있지만, 인슐린 유사 성장 인자 1 (100 NG / ㎖로), 시험관 (28, 29)에 쥐의 신경 줄기 세포의지지 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다 인터루킨 7 또는 레티노 산 (500 NG / ㎖에서) (0.1 μM에서) 신경 하위 유형 또는 아교 차별화 (31, 32)을 향해 바이어스를 유도한다.
부동 neurosphere를 또는 접착 성 단층으로 신경 전구 세포를 확장할지 여부에 대한 결정은 주로 원하는 다운 스트림 응용 프로그램 및 문화의 특성에 따라 달라집니다. neurosphere 배양 시스템이 단순하고 재현성 있지만, 그것은 세포의 동종 집단을 생성 할 수있는 능력이 제한된다. 각 영역 내의 복잡한 미세 환경은 담당자 동안 세포 사멸과 자발적 분화, 이기종 인구 33 장려를 홍보 할 수신경 전구 세포 집단 (34)의 정량화를 혼동 할 수 neurosphere를의 orted 융합. 또한, neurosphere 통과를 위해 필요한 반복 기계적 분리는 해로운 스트레스, 노화 또는 세포의 죽음으로 이어질 수 있습니다. 대안 분해 효소의 사용은 파파인 같이 얻어진 세포 생존률 (16)에 영향을 미칠 수있다. 반대로, 접착 성 단층 배양 시스템은 환경 적 분열 촉진 물질을보다 균일하게 노출, 세포 유형 등의 큰 대칭형 분할 균질성을 촉진. 이 시스템은 키를 줄기 세포 마커 (35, 36)의 표현에 기초하여 세포의 틈새 독립적 집단을 생성하는 것으로 나타났다. 이 시스템은 세포 부착을 촉진하는 예비 코팅 된 배양 용기의 사용을 필요로한다. 이 배양 된 신경 전구체의 분화 25,37 프로파일에 상당한 영향을 미칠 수 있으므로 배양 용 기재의 선택은 신중하게 고려되어야한다.
H의 전에 우리는 신선한 사후 조직에서 성인 개 해마 신경 전구 세포의 분리, 확장 및 차별화를위한 효과적인 프로토콜을 제시한다. 성인 개 신경 전구체는 문헌 18에서-표시됩니다; 자신의 분리 및 확장을위한 완전한 프로토콜도 덜 17. 우리의 프로토콜은이 귀중한 동물 모델에 대한 인식을 높이고 연구의이 적당한 수에 상당한 추가를 대표하는 역할을 할 수있다. 중요한 것은, 우리의 독특한 방법을 사용하여, 성인 개 해마 신경 전구체는 성공적으로 10 개 이상의 인구 분열을 확장 할 수 있습니다. 직경 150 μm의, 5 세대 17 이상 증식을 정지 - 성인 개 해마 신경 전구체를 사용하여 유사한 연구는 100 계대 큰 neurosphere를가 보도했다. 우리의 프로토콜에서 언급 한 바와 같이, 과도한 neurosphere 성장은 리터를 가질 수있다 시리얼 통로에 걸쳐있는 자연 분화 및 세포 사멸을 유도 할 수 있습니다이에 에디션은 증식 능력을 감소시켰다. 또한 고전 neurosphere 확장 시스템 17-21 대안으로, 이러한 세포 집단의 부착 단층 확장을위한 프로토콜을 제공한다. 이것은 대체 시스템이 셀룰러 환경을 통해 더 많은 사용자 제어를 수득하고, 상당히 표현형 균질화 감독 신경 분화 35,38 가능성,이 셀 하류 응용 범위를 넓게.
배양 성인 송곳니 해마 신경 전구 세포는 세포 및 신경 생물학 연구 분야의 넓은 범위에 걸쳐 응용이있다. 송곳니 뇌는 기존의 설치류 모델보다 인간의 두뇌에 가까운 동성을 보유하고있다. 따라서, 성인 송곳니 신경 전구 세포가 중요한 아직 파악 하였다 자원을 나타낸다. 이러한 세포는 인간 성인 신경 뒤에 메커니즘에 추가 통찰력을 얻기 위해 사용되고, 재생 치료의 개발 될 수 TARG등이 과정.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 μl filtered pipette tip | Axygen | TF1000 | |
| 150 mm Petri dish | BD Biosciences | 351058 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 200 μl filtered pipette tip | Axygen | TF200 | |
| 24 well culture plate | Greiner Bio One | 662160 | |
| 35 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353001 | |
| 40 µm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 6 well culture plate | BD Biosciences | 351146 | |
| B-27 Supplement (50x) serum free | Life Technologies | 17504044 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | 13256029 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Millipore | GF029 | |
| Collagen solution | Stem Cell Technologies | 04902 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| DMEM (4.5 g/L, D-glucose) 500 ml | Life Technologies | 11960044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | BD Biosciences | 354001 | |
| F-12 nutrient mixture (Ham) (1x) Liquid | Life Technologies | 31765035 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 16141079 | |
| Gelatin from Porcine Skin Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide (GlutaMAX) | Life Technologies | 35050061 | |
| Heparin sodium salt from (porcine) | Sigma-Aldrich | H314950KU | |
| Laminin (mouse) | Life Technologies | 23017015 | |
| NCFC serum free medium (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5720 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| Proliferation NS-A (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 05773 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit Cat: 05740, and NS-A Prolieration Kit (Rat) Cat: 05771 from Stem Cell Technologies. |
| NSC basal medium (Rat; NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5770 | Also available in the Neurocult NS-A Prolieration Kit (Rat) from Stem Cell Technologies. Cat: 05771 |
| Penicillin/Streptomycin (5,000 U/ml) | Life Technologies | 15070063 | |
| Povidone-iodine | Munipharma | Betadine | |
| Trypan blue (0.4%) | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| Class II biological safety cabinet | ThermoFisher Scientific | Safe 2020 1.2 | |
| Brain knife (disposable) | Macroknife | ||
| Cell culture incubator | ThermoFisher Scientific | HERAcell 150i | |
| Centrifuge | Hettich | Universal 320R | |
| Dumont #5 Forceps | Dumont | ||
| Easypet Electric pipette | Eppindorf | ||
| Hemocytometer | Boeco | Bright-Line Improved Neubauer | |
| Manual pipettes | Eppindorf research | ||
| Oscillating bone saw | |||
| Scalpel blades (No.21) | Paramount | ||
| Scissors | Delta | ||
| Water bath | Grant | JB Aqua 18 plus |
References
- Kheirbek, M. A., Hen, R. Dorsal vs ventral hippocampal neurogenesis: implications for cognition and mood. Neuropharmacol. 36 (1), 373 (2011).
- Tanti, A., Rainer, Q., Minier, F., Surget, A., Belzung, C. Differential environmental regulation of neurogenesis along the septo-temporal axis of the hippocampus. Neuropharmacol. 63 (3), 374-384 (2012).
- Eriksson, P. S., et al.
- Bull, N. D., Bartlett, P. F. The adult mouse hippocampal progenitor is neurogenic but not a stem cell. J Neurosci. 25 (47), 10815-10821 (2005).
- Kempermann, G., et al. Why and how physical activity promotes experience-induced brain plasticity. Front Neurosci. 4 (189), 1-9 (2010).
- Golmohammadi, M. G., et al. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26 (4), 979-987 (2008).
- Lowe, A., et al. Neurogenesis and precursor cell differences in the dorsal and ventral adult canine hippocampus. Neurosc. Lett. 593, 107-113 (2015).
- Sasaki, M., et al. MRI identification of dorsal hippocampus homologue in human brain. Neuroreport. 15 (14), 2173-2176 (2004).
- Powell, E. W., Hines, G. The Hippocampus. , Springer. 41-59 (1975).
- Jung, M. -A., et al. Canine hippocampal formation composited into three-dimensional structure using MPRAGE. J Vet Med Sci. 72 (7), 853-860 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Ray, J., Raymon, H. K., Gage, F. H. Generation and culturing of precursor cells and neuroblasts from embryonic and adult central nervous system. Methods Enzymol. 254, 20-37 (1995).
- Oliver-Dela Cruz, J., Ayuso-Sacido, A. Neural stem cells from mammalian brain: isolation protocols and maintenance conditions. INTECH Open Access Publisher. , (2012).
- Pacey, L., Stead, S., Gleave, J., Tomczyk, K., Doering, L. Neural stem cell culture: neurosphere generation, microscopical analysis and cryopreservation. Nat Protoc. , (2006).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), e2393 (2010).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225 (2014).
- Lim, J. -H., Koh, S., Olby, N. J., Piedrahita, J., Mariani, C. L. Isolation and characterization of neural progenitor cells from adult canine brains. Am J Vet Res. 73 (12), 1963-1968 (2012).
- Herranz, C., et al. Spontaneously Arising Canine Glioma as a Potential Model for Human Glioma. J Comp Pathol. 154 (2), 169-179 (2016).
- Walton, R. M., Parmentier, T., Wolfe, J. H. Postnatal neural precursor cell regions in the rostral subventricular zone, hippocampal subgranular zone and cerebellum of the dog (Canis lupus familiaris). Histochem Cell Biol. 139 (3), 415-429 (2013).
- Walton, R. M., Wolfe, J. H. Abnormalities in neural progenitor cells in a dog model of lysosomal storage disease. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (8), 760-769 (2007).
- Milward, E. A., et al. Isolation and transplantation of multipotential populations of epidermal growth factor-responsive, neural progenitor cells from the canine brain. J Neurosci Res. 50 (5), 862-871 (1997).
- Ray, J., Peterson, D. A., Schinstine, M., Gage, F. H. Proliferation, differentiation, and long-term culture of primary hippocampal neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. 90 (8), 3602-3606 (1993).
- Palmer, T., Ray, J., Gage, F. FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain. Mol Cell Neurosci. 6 (5), 474-486 (1995).
- Zhu, G., Mehler, M., Mabie, P., Kessler, J. Developmental changes in progenitor cell responsiveness to cytokines. J. Neurosci. Res. 56 (2), 131-145 (1999).
- Whittemore, S. R., Morassutti, D. J., Walters, W. M., Liu, R. -H., Magnuson, D. S. Mitogen and substrate differentially affect the lineage restriction of adult rat subventricular zone neural precursor cell populations. Exp. Cell. Res. 252 (1), 75-95 (1999).
- Kennedy, P. Postmortem survival characteristics of rat glial cells in culture. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 50 (6), 798-800 (1987).
- Viel, J. J., McManus, D. Q., Cady, C., Evans, M. S., Brewer, G. J. Temperature and time interval for culture of postmortem neurons from adult rat cortex. J. Neurosci. Res. 64 (4), 311-321 (2001).
- Huat, T. J., et al. IGF-1 enhances cell proliferation and survival during early differentiation of mesenchymal stem cells to neural progenitor-like cells. BMC Neurosci. 15 (91), 1-13 (2014).
- Supeno, N. E., et al. IGF-1 acts as controlling switch for long-term proliferation and maintenance of EGF/FGF-responsive striatal neural stem cells. Int. J. Med. Sci. 10 (5), 522-531 (2013).
- Ahmed, S., Reynolds, B. A., Weiss, S. BDNF enhances the differentiation but not the survival of CNS stem cell-derived neuronal precursors. J Neurosci. 15 (8), 5765-5778 (1995).
- Wohl, C. A., Weiss, S. Retinoic acid enhances neuronal proliferation and astroglial differentiation in cultures of CNS stem cell-derived precursors. J Neurobiol. 37 (2), 281-290 (1998).
- Araujo, D. M., Cotman, C. W. Trophic effects of interleukin-4,-7 and-8 on hippocampal neuronal cultures: potential involvement of glial-derived factors. Brain Res. 600 (1), 49-55 (1993).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3 (10), 801-806 (2006).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3 (9), 283 (2005).
- Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, Suppl 1 112-120 (2006).
- Ma, W., et al. Cell-extracellular matrix interactions regulate neural differentiation of human embryonic stem cells. BMC Dev Biol. 8 (90), 1-13 (2008).
- Goffredo, D., et al. Setting the conditions for efficient, robust and reproducible generation of functionally active neurons from adult subventricular zone-derived neural stem cells. Cell Death Differ. 15 (12), 1847-1856 (2008).
