Summary
המוח הכלבי הוא מודל ערך שבו ללמוד neurogenesis למבוגרים. מתפרסמים כאן פרוטוקולים לבידוד והרחבת תאים עצביים מבשרים כלבי מבוגרים בהיפוקמפוס מרקמות המוח עיקריות.
Protocol
בהתאם ניו סאות 'ויילס, אוסטרליה החוק, רקמת המוח פוסט מורטם נרכשה כלבים בוגרים מורדמים מסיבות שאינן קשורות למחקר.
1. הכנת בינוני תרבות
- הכן פתרון ג'לטין 0.1% על ידי הוספת 0.1 גרם של אבקת ג'לטין 100 מ"ל של מים מזוקקים להסעיר על 37 מעלות צלזיוס עד שהיא נמסה. לעקר את הפתרון על ידי קרינת UV במשך 15 דקות. מדיה זה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד 1 חודש.
- כן יחס 3: 1 של בינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) ו- F12 תערובת מזין ידי הוספת 167 מיליליטר של F-12 500 מיליליטר של DMEM (4.5 גר '/ ל D- גלוקוז). להוסיף 6.7 מ"ל של תמיסת פניצילין / סטרפטומיצין (ריכוז 1% הסופי). מדיה זו ניתן לאחסן בחושך על 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש 1.
- הכן 500 מ"ל של התקשורת בסרום על ידי שילוב 440 מ"ל של DMEM (4.5 גר '/ ל D- גלוקוז), 5 מ"ל של L-alanyl-L- גלוטמין dipeptide (200 מ"מ), 5 מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין ו -50 מ"ל של בובין עובריתסרום דואר (FBS). מדיה זו ניתן לאחסן בחושך על 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש 1.
- מדיום הגידול השלם מורכב גזע עצביים נייד (המל"ל) Basal בינוני-תוסף הפצת עצבית (NS-A), 2% FBS, 2 מיקרוגרם / הפרין מ"ל, 20 ng / גורם הגדילה באפידרמיס מ"ל (EGF) ו -10 ng / ml גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF). הפוך את המדיה הזו טריה, מייד לפני לנתיחת מוח, וחמה עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
2. הפקת המוח
- בגין חילוץ בתוך מורטם 6 שעות שלאחר ידי חיטוי את פני השטח הגבי של הראש של הכלב באמצעות יוד povidone.
- באמצעות אזמל, לעשות חתך אורכים לאורך קו אמצע sagittal, על פני השטח הגבה כולו של הגולגולת, כדי לחשוף את שרירי masseter הבסיסיות. אורכו של החתך הזה יהיה תלוי המין והגיל של הכלב.
- בגבולות המקוריים ואת הזנב של הגולגולת, להפוך נוספים 5 - 10 סנטימטרים חתכי בניצב משני הצדדים, להעבירing מאחורי העיניים והאוזניים בהתאמה, כדי לאפשר לעור להיות לידי ביטוי מלא.
- באמצעות אזמל, להפריד את שרירי masseter מהעיקול שלהם אל פסגת sagittal הגולגולת לגרד את כל רקמת חיבור שנותרה מן הגולגולת.
- שימוש עצם נדנוד ראה לחתוך את כובע הגולגולת בקו היקפי. באמצעות בדיקה או אזמל לנתק כל קבצים מצורפים הנותרים עם הדורה, ולאחר מכן להסיר בזהירות את הכיפה שעל לחשוף את פני השטח הגבי של המוח.
זהירות: העובי של העצם משתנה לאזורים שונים בגולגולת, כך יש להיזהר שלא ימומש לחדור עמוק מדי להזיק למוח הבסיסי. - לנתק את חוט השדרה על ידי החדרת אזמל בין חוליות צוואר העליונות.
- ביד אחת להרים את המוח בעדינות, השתמש באזמל כדי לשחרר את המוח בקפידה מתוך fossae גולגולתי ולנתק את העצבים חיבור וכלי דם ממוקמים בצד הגחון שלה. הרם בעדינות את bגשם מתוך הגולגולת לתוך מיכל של DPBS.
זהירות: נורות חוש הריח הגדולות של המוח הכלבי רשאיות להאריך עמוק לתוך שקע גולגולתי הקדמי. יש להקפיד בעת הסרת המוח כדי לשמר את המבנים האלה.
3. בהיפוקמפוס Dissection
- שוטפים את המוח בופר פוספט של Dulbecco (DPBS) כדי להסיר כל הדם ולמקם אותו בצד הגב למטה על צלחת 150 מ"מ פטרי.
- לאט החוצים את המוח longitudinally דרך מישור sagittal אמצע בעזרת סכין המוח רטוב פרוסה אחת אשר מנצל את מלוא אורכו של הלהב. אל תפעילו לחץ כלפי מטה נוספת, או להשתמש בתנועות ניסור, מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק לרקמות.
- מיקומה של כל המדיאלי האונה משטח עד, לנתח את ההיפוקמפוס באמצעות אזמל מלקחיים בסדר, ולהעביר אותו אל צלחת בתרבית רקמה 35 מ"מ.
בידוד 4. של תאים עצביים מבשר
- לרכך את tדגימות נושא באמצעות סכין אזמל לחתיכות 1 מ"מ 3 כ.
- העברת רקמה לתוך צינור 15 מ"ל, להוסיף 2 מ"ל של 0.1% טריפסין EDTA, דגירה במשך 7 דקות באמבט מים ב 37 ° C.
- לעצור את תגובת האנזים ידי הוספת 4 מיליליטר של תקשורת בסרום אל הצינור. גלולת ההשעיה על ידי צנטריפוגה ב 100 XG במשך 7 דקות ולהסיר את supernatant.
- Resuspended גלולה ב 300 μl של DPBS, ניתק באופן מכני על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה, באמצעות קצה פיפטה 1,000 μl, עד להיווצרות homogenate חלקה.
- להוסיף 14 מ"ל של התקשורת בסרום אל הצינור להעביר את ההשעיה התא דרך מסננת תא 40 מיקרומטר. גלולה ההשעיה על ידי צנטריפוגה ב 100 XG במשך 7 דקות, להסיר את supernatant, resuspend במדיום הגידול להשלים.
5. neurosphere תרבות
- מתוך השעית התא מתקבלת על בידוד, לספור את מספר תאי קיימא באמצעות דרת צבע הכחול Trypan וכן חמוcytometer.
- לדלל את ההשעיה תא בינוני וזרעי צמיחה שלם ב 1 x 10 5 תאים / 2 ס"מ לתוך בארות ללא ציפוי של צלחת 6 היטב.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ו> לחות 95% במשך 14 - 28 ימים, להחליף 50% של תקשורת הצמיחה כל 7 ימים. מדוד את הקוטר של neurospheres בקביעות. אם מותר לגדול מעבר 100 מיקרומטר קוטר, מוות של תאים והתמיינות ספונטנית יכולים להתרחש בתוך neurospheres.
6. מעבר neurosphere
- למעבר כתרבות צף, כאשר neurospheres להגיע כ 100 מיקרומטר קוטר, לשלב את כל התקשורת המכיל neurosphere לתוך צינור אחד. גלולה ידי צנטריפוגה ב 100 XG במשך 7 דקות ולהסיר את supernatant.
- Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של 0.1% טריפסין EDTA דגירה במשך 7 דקות באמבט מים ב 37 ° C. פיפטה בעדינות מעלה ומטה 100 פעמים, באמצעות קצה פיפטה 200 μl, כדי להבטיח dissociatiעל של neurospheres.
- לעצור את תגובת האנזים ידי הוספת 5 מיליליטר של תקשורת בסרום אל צינור צנטריפוגות ב 100 XG במשך 7 דקות.
- הסר את supernatant, resuspend התא גלולה ב 1 מ"ל מדיום הגידול להשלים ולספור את מספר התאים קיימא באמצעות הדרה הצבע הכחול Trypan ו hemocytometer.
- לדלל את ההשעיה תא בינוני וזרעי צמיחה שלם ב 1 x 10 5 תאים / 2 ס"מ לתוך בארות ללא ציפוי של צלחת 6 היטב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ו> לחות 95% במשך 14 - 28 ימים, החלפת 50% של תקשורת הצמיחה כל 7 ימים.
7. חסיד והתרבות של תאים עצביים מבשר
- הוספת נפח מספיק של פתרון ג'לטין 0.1% כדי לכסות את פני השטח של צלחת בתרבית רקמה ולרפא באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 לפני עיבוד neurospheres לתרבות חסידה.
- מתרבה neurosphere צף, לשלב את כל אמצעי התקשורת לתוך צינור אחד. גלולת neurospheres על ידי צנטריפוגה ב 100 XG במשך 7 דקות ולהסיר את supernatant.
- Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של 0.1% טריפסין EDTA דגירה במשך 7 דקות באמבט מים ב 37 ° C. פיפטה בעדינות מעלה ומטה 100 פעמים, באמצעות קצה פיפטה 200 μl.
- הוסף 5 מ"ל של התקשורת בסרום כדי לעצור את התגובה אנזים צנטריפוגות ב 100 XG במשך 7 דקות. בטל supernatant ו resuspend התא גלולה ב 1 מ"ל מדיום הגידול להשלים ולספור את מספר התאים קיימא באמצעות הדרה הצבע הכחול Trypan ו hemocytometer.
- לדלל את ההשעיה תא במדיום הגידול שלם, הסר את ג'לטין מן צלוחיות בתרבית רקמה וזרעי התאים ב 1 x 10 4 תאים / 2 ס"מ.
- דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולחות 95%>. החלף את המדיה עם טרי, מחומם, תקשורת צמיחה להשלים כל שלושה ימים עד התרבות מגיעה כ 80 מפגש% (לאחר כ 7 ימים).
8. NeurAssay אל המושבה להרכיב
- שלב נייד המושבה להרכיב עצבית (NCFC) רכיבי התקשורת Assay: בינוני חופשי בסרום NCFC, הפצת NS-A, והפתרון קולגן (3 מ"ג / מ"ל). מוסף המדיה הזו עם 2 מיקרוגרם / מ"ל הפרין, 20 ng / ml EGF, ו -10 ng / ml bFGF.
- בעקבות ניתוק רקמה בהיפוקמפוס Resuspend התאים המושבה עצבית להרכיב בינוני assay, מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. זרעי התאים בצפיפות משובטת של 1.1 x 10 מיליליטר 5 תאים / לתוך צלחת 35 מ"מ תרבות.
- דגירה התאים במטריצה קולגן חצי מוצק זה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולחות 95%>. תרבות במשך 28 ימים, החלפת 50% של תקשורת הצמיחה כל 7 ימים.
בידול 9. של תאים עצביים מבשר
- הוספת נפח מספיק של 5 מיקרוגרם / 2 ס"מ פתרון laminin כדי לכסות את פני השטח של צלחת בתרבית רקמה ולרפא באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפני עיבוד התאים עבור differentiation.
הערה: הסר את הפתרון laminin ו לשטוף את המשטח מצופה פעמיים DPBS מיד לפני זריעה. - כאשר passaging, לזרוע את ההשעיה תא 1 x 10 4 תאים / ס"מ 2 ב DMEM-F12 (3: 1) מדיה (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס) בתוספת 20 ng / ml EGF ו 40 ng / ml bFGF על laminin מצופה צלחת תרבות.
- לחות CO 2 ו> 95% דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% ולאפשר לתאים להתרבות במשך 3 ימים.
- כדי לבדל את התאים העצביים מבשרי החסיד, לאחר 3 ימים להחליף את התקשורת עם תקשורת בידול המכילה DMEM-F12 (3: 1) מדיה מחוממת מראש ל 37 מעלות צלזיוס, בתוספת 10 ng / ml המוח הנגזר גורם neurotrophic (BDNF).
- במהלך ההתמיינות להחליף 50% של התקשורת כל 3 ימים. בידול מתרחש בהדרגה על פני כ 21 - 28 ימים.
זהירות: ברגע שהתאים החלו להבדיל, רק להחליף 50% של התקשורת באחד tiלי כחשיפת אוויר יכולות להיות השפעה מזיקה על הבריאות של התאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות שימוש מבחני מבשר במבחנה עצביים, הנוירוגנזה אוכלוסיות תאים עצביים מבשר התאפיינו ולעומת פני ציר dorsoventral של ההיפוקמפוס כלבים בוגרים. תאים עצביים מבשרים נגזרים רקמות בהיפוקמפוס מבודדות נוצר צף neurospheres בתוך 14 ימים של בידוד, להגיע בקוטר של 100 מיקרומטר ידי 28 ימים של התרבות. Neurospheres נגזר הגבה ומבודד גחון לא הצביע על הבדל בגודל ממוצע, ובעקבות דיסוציאציה האנזימטית לתוך תאים בודדים, ניתן passaged צף תרבויות neurosphere. neurospheres צף משני משני האזורים בהיפוקמפוס הצליח ליצור בתוך 5 ימים מיום המעבר. כאשר זורעים 1 x 10 4 תאים / 2 ס"מ על 0.1% ג'לטין מצופה צלוחיות תרבות, תאים עצביים מבשר היו גם מסוגל להתרבות monolayers חסיד כמו (איור 1 א). אין הבדלים מורפולוגיים נצפו between הגב ועל תאים עצביים מבשר הגחון בהיפוקמפוס שתי התרבויות חסיד יכלו לעבור מעל 10 הכפלות האוכלוסייה ללא כל נצפתה האטה בזמן המעבר (איור 1B). Nestin ו Sox2 ביטוי גנים בתאי גזע עצביים בתרבות חסידה לא היה שונה משמעותי על פני ציר dorsoventral בהיפוקמפוס (איור 2). עוד נרחב ואפיון גני ביטוי חלבון, המאשר את זהותו העצבית המבשרת של תאים אלה, מדווח הנתונים שפורסמו שלנו 7.
שימוש assay המושבה להרכיב עצבית מותאם 4,6 אנו הערכנו תדירויות תא עצביות מבשר על מנת לכמת הבדלים אפשריים בין אוכלוסיות תאים עצביות מבשר על פני הגב ואת אזורי משנה גחון של ההיפוקמפוס הכלבים. תאים היו זורע בצפיפות משובטת במטריצת קולגן חצי מוצקה המונעת איחוי תאים, ותרבותי עבור 28 ימים (איור 3 א F = 96.8, p = 0.001; איור 3B ).
בתנאי בידול, תאים עצביים מבשרים כלבי חסיד הראו שינויים מתקדמים במורפולוגיה ברוטו, פיתוח כבר ותהליכים משוכללים יותר. ביטוי חלבון עבור העצבית (βIII טובולין) ואת גליה (חלבון חומצי fibrillary גליה; GFAP) סמנים גדל גם בעקבות בידול (איור 4). לא נמצא הבדל משמעותי שנצפה במספר התאים שכותרתו החיובית בין הגבה ומבודד גחון. בעבר פרסמו הנתונים שלנו מאששים שינויים בביטוי החלבונים הללו, הוכיחו את התקנה של הגנים הקשורים בם יחד עם ויסות למטה של עצבי גנים מבשר על פני תקופת בידול 28 יום 7.
איור 1:. בשנת הרחבה חוץ גופית של כלב מבוגר בהיפוקמפוס עצבית מבשר תאים תאים עצביים מבשר בהיפוקמפוס כלבים מבוגרים מבודד הגבי ואזורים בהיפוקמפוס הגחון מורחבות כמו (א) neurospheres צף או (ב) monolayer חסיד (ג) בתור. monolayer חסיד תאים עצביים מבשר אלה יכולים לעבור במעבר מעל 10 פעמים ללא ירידה משמעותית הכפלת מהירות. n = 5; בקנה מידה = 50 מיקרומטר. שונה מן שפורסם איור 7. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
/ftp_upload/54953/54953fig2.jpg "/>
איור 2:. Gene Expression ב מתרבה למבוגרים לכלבים בהיפוקמפוס עצבי מבשרים תאי ביטוי של גנים בתאי גזע עצביים (א) Nestin ו- (ב) Sox2 אושר תאים עצביים מבשרים בהיפוקמפוס כלבי מבוגרים בתנאי תרבות שגשוג חסיד. הביטוי של גנים אלה היה שקול גם בירכתיים ותאי נגזר ההיפוקמפוס הגחון. פיברובלסטים כלבים מבוגרים שימשו פס בקרה להשוות ההבדלים בביטוי הגנים יחסית. n = 5; ברי שגיאה = SEM. שונה מן שפורסם איור 7. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. עצבית המושבה להרכיב assay (א)תאי מבשר כלבים למבוגרים עצביים, זורעים בצפיפות המשובטים לתוך מטריצת קולגן חצי מוצקה, טופס neurospheres בתוך 28 ימים של התרבות. (ב) תאים עצביים מבשרים נגזרים מן ההיפוקמפוס הגבה ליצור מספרים גדולים המשמעותי של neurospheres ליחידת שטח מאשר אלה שמקורם ההיפוקמפוס הגחון. n = 5; ברי שגיאה = SEM; בקנה מידה = 50 מיקרומטר. שונה מן שפורסם איור 7. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. Immunocytochemistry של תאים עצביים מבשר בהיפוקמפוס לכלבים הבדיל למבוגרים כאשר בתרבית BDNF במשך 28 ימים, מבשרי עצביים כלבים בוגרים משני הגבי ו ההיפוקמפוס הגחון להתמיין נוירונים בוגרים (PO βIII טובוליןsitive) ואת גליה (תאים מסוגים חיובי GFAP). n = 5; בקנה מידה = 50 מיקרומטר. שונה מן שפורסם איור 7. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקולים המתוארים כאן מותאמים לשמור על תנאי תרבות נוחים למקסם כדאי תא. המהירות טופל במהלך חילוץ, בידוד והרחבה היא בעלת חשיבות מכרעת. שלב קריטי לביסוס והרחבת monolayer חסיד הוא דיסוציאציה היעיל של neurospheres העיקרי. בעקבות מעבר, מספיק ניתק neurospheres עלול ליצור neurospheres צף משני. במהלך לשנות את פני התקשורת, neurospheres אלה ניתן להסיר, ניתק reseeded למעבר monolayer חסיד. לעומת זאת, אם כדאיות התא שלאחר הניתוק הוא מתחת ל -80%, זה עלול להצביע על pipetting מופרז במהלך דיסוציאציה. תאים עצביים מבשרים, ובשנת עמיתיהם בדיל בפרט, רגישים לשינויים ב- pH מחוץ לטווח הפיזיולוגי, וחשיפה לאוויר. התצפית של מוות של תאים נפוצים פתאומי עלולה לנבוע מגורמים אלו. כתוצאה מכך, צעד קריטי במהלך התקשורת צ'אןGES היא לאמצעי התקשורת להיעשות טרי בכל פעם, רק 50% מנפח להיות מוחלף. לבסוף, בעוד גורמי mitogenic EGF ו bFGF לתמוך ההישרדות ושגשוגם של מבשרים עצביים בהיפוקמפוס בתנאי סרום ללא במבחנה 22,23, את תגובת תאי mitogens אלה תלויה מאוד בגיל התא התפתחותיים וריכוז mitogenic 24,25. לכן, על מנת להבטיח וריאציה ניסיונית מינימאלית רכיבים אלה הוא חיוני ליצירה עקבית, תרביות תאים לשחזור.
עבור כדאיות מקסימלית, יש זורעים תאים לתרבות בתוך 6 שעות פוסט מורטם. עם זאת, מוח החילוץ עשוי להיות מאוחסן באופן זמני PBS ב 4 מעלות צלזיוס. שינוי זה עשוי לאפשר לבידוד להתעכב על ידי עד 24 שעות עם ירידה מזערית 26,27 תשואת תא. תוספת גורם צמיחה של התקשורת והתרבות עשויה גם להיות שונה כדי לשפר את ההתפשטות או לעודד את differentiation של סוגי תאים עצביים ספציפיים. גדילה דמוי אינסולין גורם 1 (ב 100 ng / ml) הוכח להיות השפעה תומכת על תאי גזע עצביים מכרסם במבחנה 28,29, ואילו תחת בידול התנאים פרו-עצבי הגורם BDNF 30 יכול לשמש בשילוב עם גורמים כגון 7 כמו אינטרלויקין (500 ng / ml) או חומצה רטינואית (0.1 מיקרומטר) כדי לגרום הטיה כלפי תת סוג עצבי או בידול גליה 31,32.
ההחלטה אם להרחיב תאים עצביים מבשרים כמו neurospheres צף או כקובץ monolayer חסיד תלוי במידה רבה על היישומים במורד הזרם הרצויים ומאפייני תרבות. בעוד מערכת תרבות neurosphere היא פשטנית מאוד לשחזור, היא מוגבלת ביכולתה ליצור אוכלוסיות הומוגניות של תאים. במיקרו-סביבה של מורכבות בתוך כל כדור יכול לקדם אפופטוזיס והבחנה ספונטנית, עידוד אוכלוסיה הטרוגנית 33, בעוד נציגהיתוך של neurospheres orted שיכול לבלבל כימות של אוכלוסיות תאים עצביים מבשר 34. יתר על כן, ניתוק המכאני החוזר והנשנה הנדרשים neurosphere מעבר עשוי גם להוביל ללחץ מזיק, הזדקנות או אפילו מוות של תאים. השימוש אנזים דיסוציאציה חלופיים, כגון פפאין, עשויים להשפיע על כדאיות התא כתוצאה 16. לעומת זאת, מערכת התרבות monolayer החסידה, עם חשיפה אחידה יותר mitogens הסביבה, מעודדת הומוגניות יותר בסוג תא וחלוקה סימטרית יותר. מערכת זו הוכחה לייצר אוכלוסייה עצמאית נישה של תאים, המבוסס על הביטוי של סמנים בתאי גזע מפתח 35,36. מערכת זו דורשת שימוש כלי תרבות טרום מצופה לקדם דבקות הסלולר. הבחירה של מצע התרבות צריכה להישקל בזהירות, כפי שהוא עשוי להיות השפעה משמעותית על פרופיל הבידול של המבשרים העצביים התרבותיים 25,37.
Here אנו מציגים פרוטוקולים יעילים עבור הבידוד, ההרחבה וההתמיינות של תאים עצביים מבשרים בהיפוקמפוס כלבי בוגרים מרקמת פוסט מורטם טרי. מבשרי עצביים כלבים בוגרים הם מתת-ייצוג בספרות 18; עם פרוטוקולים מלאים ל הבידוד והרחבתן, קל וחומר 17. הפרוטוקולים שלנו רשאים להגיש כדי להגביר את המודעות של מודל החיה הזה יקר ולייצג תוספת משמעותית למספר הצנוע הזה של מחקרים. משמעות, בשיטה הייחודית שלנו, מבשרים עצביים בהיפוקמפוס כלבי בוגרים ניתן להרחיב בהצלחה יותר מ -10 הכפלות אוכלוסייה. מחקר דומה באמצעות עצביים מבשרים בהיפוקמפוס כלבי מבוגרים דיווח כי neurospheres הגדול, passaged ב 100 - 150 מיקרומטר בקוטר, חדל התפשטות מעבר הדור החמישי 17. כפי שצוין בפרוטוקול שלנו, צמיחת neurosphere מוגזמת עלולה לעודד בידול אפופטוזיס ספונטני, אשר מעל מעבר סדרתי ייתכן שיהיה lאד גורם לירידה ביכולת שגשוג. כמו כן, אנו מספקים פרוטוקול להרחבת monolayer חסיד של אוכלוסיית תא זה, כחלופה למערכת הרחבה הקלסית neurosphere 17-21. מערכת חלופית זו מקנה למשתמש שליטה רבה יותר על הסביבה הסלולר, באופן משמעותי מרחיב את מגוון היישומים במורד הזרם עבור תאים אלה, עם פוטנציאל המגון פנוטיפי והבחנה עצבית מכוונת 35,38.
מבוגר מתורבת כלבים יש תאים עצביים מבשרים בהיפוקמפוס יישומים על פני מגוון רחב של תחומי מחקר הסלולר הנוירוביולוגי. מוח כלבי בעל הומולוגיה קרובה למוח האנושי מאשר במודלים של מכרסמים קיימים. ככזה, תאים עצביים מבשר כלבים בוגרים מייצגים חשוב, עדיין אילתר, משאב. תאים אלה ניתן להשתמש כדי לרכוש תובנה נוספת לתוך המנגנונים מאחורי neurogenesis למבוגרים בבני אדם, וכן על הפיתוח של טיפולי משובים כי טארגet התהליך הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 μl filtered pipette tip | Axygen | TF1000 | |
| 150 mm Petri dish | BD Biosciences | 351058 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 200 μl filtered pipette tip | Axygen | TF200 | |
| 24 well culture plate | Greiner Bio One | 662160 | |
| 35 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353001 | |
| 40 µm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 6 well culture plate | BD Biosciences | 351146 | |
| B-27 Supplement (50x) serum free | Life Technologies | 17504044 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | 13256029 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Millipore | GF029 | |
| Collagen solution | Stem Cell Technologies | 04902 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| DMEM (4.5 g/L, D-glucose) 500 ml | Life Technologies | 11960044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | BD Biosciences | 354001 | |
| F-12 nutrient mixture (Ham) (1x) Liquid | Life Technologies | 31765035 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 16141079 | |
| Gelatin from Porcine Skin Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide (GlutaMAX) | Life Technologies | 35050061 | |
| Heparin sodium salt from (porcine) | Sigma-Aldrich | H314950KU | |
| Laminin (mouse) | Life Technologies | 23017015 | |
| NCFC serum free medium (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5720 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| Proliferation NS-A (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 05773 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit Cat: 05740, and NS-A Prolieration Kit (Rat) Cat: 05771 from Stem Cell Technologies. |
| NSC basal medium (Rat; NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5770 | Also available in the Neurocult NS-A Prolieration Kit (Rat) from Stem Cell Technologies. Cat: 05771 |
| Penicillin/Streptomycin (5,000 U/ml) | Life Technologies | 15070063 | |
| Povidone-iodine | Munipharma | Betadine | |
| Trypan blue (0.4%) | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| Class II biological safety cabinet | ThermoFisher Scientific | Safe 2020 1.2 | |
| Brain knife (disposable) | Macroknife | ||
| Cell culture incubator | ThermoFisher Scientific | HERAcell 150i | |
| Centrifuge | Hettich | Universal 320R | |
| Dumont #5 Forceps | Dumont | ||
| Easypet Electric pipette | Eppindorf | ||
| Hemocytometer | Boeco | Bright-Line Improved Neubauer | |
| Manual pipettes | Eppindorf research | ||
| Oscillating bone saw | |||
| Scalpel blades (No.21) | Paramount | ||
| Scissors | Delta | ||
| Water bath | Grant | JB Aqua 18 plus |
References
- Kheirbek, M. A., Hen, R. Dorsal vs ventral hippocampal neurogenesis: implications for cognition and mood. Neuropharmacol. 36 (1), 373 (2011).
- Tanti, A., Rainer, Q., Minier, F., Surget, A., Belzung, C. Differential environmental regulation of neurogenesis along the septo-temporal axis of the hippocampus. Neuropharmacol. 63 (3), 374-384 (2012).
- Eriksson, P. S., et al.
- Bull, N. D., Bartlett, P. F. The adult mouse hippocampal progenitor is neurogenic but not a stem cell. J Neurosci. 25 (47), 10815-10821 (2005).
- Kempermann, G., et al. Why and how physical activity promotes experience-induced brain plasticity. Front Neurosci. 4 (189), 1-9 (2010).
- Golmohammadi, M. G., et al. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26 (4), 979-987 (2008).
- Lowe, A., et al. Neurogenesis and precursor cell differences in the dorsal and ventral adult canine hippocampus. Neurosc. Lett. 593, 107-113 (2015).
- Sasaki, M., et al. MRI identification of dorsal hippocampus homologue in human brain. Neuroreport. 15 (14), 2173-2176 (2004).
- Powell, E. W., Hines, G. The Hippocampus. , Springer. 41-59 (1975).
- Jung, M. -A., et al. Canine hippocampal formation composited into three-dimensional structure using MPRAGE. J Vet Med Sci. 72 (7), 853-860 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Ray, J., Raymon, H. K., Gage, F. H. Generation and culturing of precursor cells and neuroblasts from embryonic and adult central nervous system. Methods Enzymol. 254, 20-37 (1995).
- Oliver-Dela Cruz, J., Ayuso-Sacido, A. Neural stem cells from mammalian brain: isolation protocols and maintenance conditions. INTECH Open Access Publisher. , (2012).
- Pacey, L., Stead, S., Gleave, J., Tomczyk, K., Doering, L. Neural stem cell culture: neurosphere generation, microscopical analysis and cryopreservation. Nat Protoc. , (2006).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), e2393 (2010).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225 (2014).
- Lim, J. -H., Koh, S., Olby, N. J., Piedrahita, J., Mariani, C. L. Isolation and characterization of neural progenitor cells from adult canine brains. Am J Vet Res. 73 (12), 1963-1968 (2012).
- Herranz, C., et al. Spontaneously Arising Canine Glioma as a Potential Model for Human Glioma. J Comp Pathol. 154 (2), 169-179 (2016).
- Walton, R. M., Parmentier, T., Wolfe, J. H. Postnatal neural precursor cell regions in the rostral subventricular zone, hippocampal subgranular zone and cerebellum of the dog (Canis lupus familiaris). Histochem Cell Biol. 139 (3), 415-429 (2013).
- Walton, R. M., Wolfe, J. H. Abnormalities in neural progenitor cells in a dog model of lysosomal storage disease. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (8), 760-769 (2007).
- Milward, E. A., et al. Isolation and transplantation of multipotential populations of epidermal growth factor-responsive, neural progenitor cells from the canine brain. J Neurosci Res. 50 (5), 862-871 (1997).
- Ray, J., Peterson, D. A., Schinstine, M., Gage, F. H. Proliferation, differentiation, and long-term culture of primary hippocampal neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. 90 (8), 3602-3606 (1993).
- Palmer, T., Ray, J., Gage, F. FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain. Mol Cell Neurosci. 6 (5), 474-486 (1995).
- Zhu, G., Mehler, M., Mabie, P., Kessler, J. Developmental changes in progenitor cell responsiveness to cytokines. J. Neurosci. Res. 56 (2), 131-145 (1999).
- Whittemore, S. R., Morassutti, D. J., Walters, W. M., Liu, R. -H., Magnuson, D. S. Mitogen and substrate differentially affect the lineage restriction of adult rat subventricular zone neural precursor cell populations. Exp. Cell. Res. 252 (1), 75-95 (1999).
- Kennedy, P. Postmortem survival characteristics of rat glial cells in culture. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 50 (6), 798-800 (1987).
- Viel, J. J., McManus, D. Q., Cady, C., Evans, M. S., Brewer, G. J. Temperature and time interval for culture of postmortem neurons from adult rat cortex. J. Neurosci. Res. 64 (4), 311-321 (2001).
- Huat, T. J., et al. IGF-1 enhances cell proliferation and survival during early differentiation of mesenchymal stem cells to neural progenitor-like cells. BMC Neurosci. 15 (91), 1-13 (2014).
- Supeno, N. E., et al. IGF-1 acts as controlling switch for long-term proliferation and maintenance of EGF/FGF-responsive striatal neural stem cells. Int. J. Med. Sci. 10 (5), 522-531 (2013).
- Ahmed, S., Reynolds, B. A., Weiss, S. BDNF enhances the differentiation but not the survival of CNS stem cell-derived neuronal precursors. J Neurosci. 15 (8), 5765-5778 (1995).
- Wohl, C. A., Weiss, S. Retinoic acid enhances neuronal proliferation and astroglial differentiation in cultures of CNS stem cell-derived precursors. J Neurobiol. 37 (2), 281-290 (1998).
- Araujo, D. M., Cotman, C. W. Trophic effects of interleukin-4,-7 and-8 on hippocampal neuronal cultures: potential involvement of glial-derived factors. Brain Res. 600 (1), 49-55 (1993).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3 (10), 801-806 (2006).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3 (9), 283 (2005).
- Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, Suppl 1 112-120 (2006).
- Ma, W., et al. Cell-extracellular matrix interactions regulate neural differentiation of human embryonic stem cells. BMC Dev Biol. 8 (90), 1-13 (2008).
- Goffredo, D., et al. Setting the conditions for efficient, robust and reproducible generation of functionally active neurons from adult subventricular zone-derived neural stem cells. Cell Death Differ. 15 (12), 1847-1856 (2008).
