Summary
犬大脑是在研究成年神经宝贵的典范。这里介绍的是隔离，并从原发性脑组织扩大成年犬海马神经前体细胞协议。
Protocol
按照新南威尔士，澳大利亚的法律， 验尸脑组织从对安乐死无关的研究的理由成年犬收购。
1.培养基的制备
- 通过加入0.1克明胶粉末到100毫升蒸馏水中并在37℃下搅拌直至溶解制备0.1％的明胶溶液。消毒通过UV照射该溶液15分钟。然后，该媒体可以被存储在4℃下长达1个月。
- 通过加入167毫升F-12的至500ml的DMEM（4.5 g / L的D-葡萄糖）的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）和营养混合物F12的比例为1：制备3。加6.7毫升的青霉素/链霉素溶液（为1％的最终浓度）。此媒体可存储在黑暗中在4℃下长达1个月。
- 通过组合440毫升的DMEM（4.5 g / L的D-葡萄糖）中，制成500毫升之血清培养基5毫升的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽（200毫米），将5ml青霉素/链霉素和50毫升胎儿BOVIN的Ë血清（FBS）。此媒体可存储在黑暗中在4℃下长达1个月。
- 完全生长培养基由神经干细胞（NSC）基础培养基和增殖神经补充-A（NS-A），2％FBS，2微克/毫升肝素，20毫微克/毫升表皮生长因子（EGF）和10毫微克/毫升碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。使此媒体鲜，紧接大脑解剖，性温至37℃的水浴中。
2.脑提取
- 用碘伏消毒狗的头部背侧面开始在6个小时的验尸提取。
- 使用手术刀，使一个纵向切口沿矢状中线，穿过头盖骨的整个背侧表面，以暴露底层咬肌肌肉。该切口的长度将依赖于狗的种类和年龄。
- 在头盖骨的喙和尾部的边界，使额外的5 - 双方10厘米垂直切割，通进入眼睛和耳朵后面的分别，让皮肤得到充分的体现。
- 使用手术刀，从他们的附件中的咬肌分开，颅骨矢状嵴和刮去头盖骨任何剩余的结缔组织。
- 使用一个振荡骨锯切割颅骨在周线的帽。用探针或手术刀断绝与硬脑膜任何剩余的附件，然后小心地取出颅盖，露出大脑的背水面。
注意：骨的厚度在颅骨不同地区的不同而不同，所以必须谨慎，以不渗透太深，损害底层的大脑。 - 通过将上部颈椎之间手术刀切断脊髓。
- 用一只手轻轻抬起脑，用解剖刀小心释放从颅窝脑和断绝位于其腹侧连接神经和血管。轻轻抬起的B雨出颅骨并进入DPBS的容器。
注意：犬脑的大嗅球可以深深延伸到前颅窝。必须小心除去脑时，应考虑以保留这些结构。
3.海马解剖
- 冲洗在Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）大脑以去除任何血液，并将其放置背侧向下到150毫米的培养皿。
- 慢慢通过中间矢状平面利用湿式脑刀和利用所述刀片的整个长度的单个切片纵向平分大脑。不要施加额外的下行压力，或使用锯切运动，因为这样可能会损坏组织。
- 放置每个半球内侧表面上，解剖出使用解剖刀和细镊子海马，并将其转移到35毫米组织培养皿中。
4.隔离神经前体细胞
- 切碎的T使用手术刀刀片成约1mm 3个问题样本。
- 转移组织入15ml管中，加2ml的0.1％胰蛋白酶的EDTA，和在37℃的水浴中孵育7分钟。
- 停止加入4毫升血清培养基的管中的酶反应。沉淀通过离心悬浮液在100×g离心7分钟，除去上清液。
- 重悬浮沉淀在300微升DPBS，并轻轻吹打上下，用1000微升枪头，直到光滑匀浆形式机械分离。
- 14毫升血清培养基添加到管，并通过一个40微米的细胞滤网通过细胞悬浮液。沉淀通过离心悬浮液在100×g离心7分钟，除去上清液，并在完全生长培养基中重悬。
5.神经球文化
- 从在分离获得细胞悬浮液，用台盼蓝染料排除和HEMO计数存活细胞的数目流式细胞仪。
- 稀释在完全生长培养基和种子中的细胞悬浮液以1×10 5个细胞/ cm 2到6孔板的未涂覆的孔中。
- 孵育在37℃，5％CO 2和> 95％的湿度为14 - 28天更换50％的生长培养基的每7天。定期测量神经球的直径。如果允许超越100微米增长直径，细胞死亡和自发分化可在神经球内发生。
6.神经球通道
- 到通道作为浮动培养，当神经球达到直径约100微米，结合所有的含神经球媒体到单个管中。离心在100×g离心7分钟沉淀并去除上清。
- 重悬沉淀在1毫升0.1％胰蛋白酶的EDTA中，并在37℃的水浴中孵育7分钟。轻轻吸取上下100次，用200μl移液管尖，以确保dissociati在神经球。
- 停止在100 xg离心加入5毫升血清培养基的管中，离心7分钟的酶反应。
- 除去上清液，重悬在1ml的细胞沉淀完全生长培养基中并计数使用台盼蓝染料排除和血球存活细胞的数量。
- 稀释在完全生长培养基和种子中的细胞悬浮液以1×10 5个细胞/ cm 2到6孔板的未涂覆的孔中。孵育在37℃，5％CO 2和> 95％的湿度为14 - 28天更换50％的生长培养基的每7天。
神经前体细胞7.贴壁培养
- 添加足够量的0.1％明胶溶液覆盖在培养箱组织培养皿和固化的表面，在37℃进行1小时处理神经球为贴壁培养之前。
- 从浮神经球文化，将所有媒体到一个单管。沉淀neurospheres离心100×g离心7分钟，除去上清液。
- 重悬沉淀在1毫升0.1％胰蛋白酶的EDTA中，并在37℃的水浴中孵育7分钟。轻轻移液器上下100次，用200μl的枪头。
- 加入5毫升血清培养基以制止在100×g离心7分钟的酶反应和离心机。弃去上清，重悬在1ml完全生长培养基将细胞沉淀，并计算使用台盼蓝染料排除和血球存活细胞的数量。
- 稀释在完全生长培养基将细胞悬液，除去从组织培养瓶中的明胶和以1×10 4个细胞/ cm 2接种细胞。
- 孵育细胞在37℃，5％的CO 2和> 95％的湿度。直到培养达到约80％汇合（后约7天）用新鲜，温暖，完整的生长介质更换介质每三天。
8. Neur人集落形成实验
- 结合神经细胞集落形成细胞（NCFC）测定媒体组件：NCFC无血清培养基，细胞增殖的NS-A，和胶原溶液（3毫克/毫升）。补充本媒体用2微克/ ml肝素，20纳克/毫升的EGF和10ng / ml的bFGF。
- 以下海马组织离解重悬在神经集落形成测定培养基中的细胞，预先加热到37℃的水浴中。种子的细胞以1.1×10 5个细胞/ ml的克隆密度为35毫米的培养皿中。
- 孵育在此半固体胶原基质的细胞在37℃，5％的CO 2和> 95％的湿度。培养28天，取代50％的生长培养基的每7天。
9.分化神经前体细胞
- 在37℃下处理细胞不同点之前添加5 微克 /平方厘米的层粘连蛋白溶液的足够体积，以覆盖在培养箱组织培养皿和固化的表面24小时化。
注意：删除层粘连蛋白溶液和冲洗两次涂覆表面在DPBS之前立即播种。 - 传代时，种子在DMEM-F12以1×10 4个细胞/ cm 2的细胞悬浮液（3：1）补充有20毫微克/毫升EGF和40毫微克/ ml的bFGF到介质（预热至37℃）层粘连蛋白涂层的培养皿。
- 孵育细胞在37℃，5％的CO 2和> 95％的湿度，并允许细胞增殖3天。
- 区分粘附神经前体细胞，3天后更换分化培养基含有DMEM-F12介质（3：1）介质预加热到37℃，在补充有10纳克源性神经营养因子（BDNF）/ ml的脑。
- 在分化更换50％的培养基每3天。 28天 - 分化在大约21逐渐发生的。
注意：一旦细胞已开始分化，仅在一个钛更换介质的50％我如暴露于空气中可对细胞的健康产生不利影响。
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Representative Results
通过使用体外神经前体测定法，神经发生和神经前体细胞群进行了表征，并在整个成年犬海马背腹轴比较。从孤立的海马组织的神经前体细胞形成的内隔离14天浮动的神经球，达到了直径为100微米由28天文化。从背部和腹部分离衍生神经球表现出平均尺寸没有差别了，下面酶解成单个细胞，可以传代浮动的神经球文化。从两个海马区次要浮动神经球能够形成内通道5天。当以1×10 4个细胞/ cm 2接种于0.1％明胶包被的培养瓶，神经前体细胞还能够增殖以贴壁单层（ 图1A）。观察betwee无形态差异Ñ背侧和腹侧海马神经前体细胞和贴壁培养物能经受超过10次群体倍增而没有任何观察到在通道时间（ 图1B）放缓。在贴壁培养Nestin和Sox2的神经干细胞的基因表达不跨越海马背腹轴显著不同（ 图2）。基因和蛋白表达的更广泛的表征，证明了这些细胞的神经前体的身份，则报告在我们公布的数据7。
使用适于神经菌落形成测定法4,6，我们以量化穿过背神经前体细胞群和犬海马腹侧分区域的电位差评估神经前体细胞的频率。细胞在该排除细胞融合半固体胶原基质克隆密度接种，并持续28天培养（ 图3A F = 96.8，P = 0.001; 图3B ）。
在分化的条件，贴壁犬神经前体细胞呈进行改建大体形态，开发更长，更复杂的过程。神经元（βIII微管蛋白）和神经胶质细胞（胶质纤维酸性蛋白，GFAP）表达的蛋白标志物也增加了以下的分化（ 图4）。在背侧和腹侧菌株之间正标记的细胞的数目没有显著差异观察到。我们此前公布的数据证实了这些蛋白表达的变化，表明上调的相关基因以及神经的下调前体基因在28天分化期7。
图1：从背，腹海马区分离的成年犬海马神经前体细胞体外扩增成年犬海马神经前体细胞被扩展为（A）浮动的神经球或（B）附着的单层（C）作为。贴壁单层这些神经前体细胞可以进行10倍以上通道没有翻倍的速度显著下跌。 N = 5;标度= 50微米。从公布的图7修改。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图2：在成人增殖犬海马神经前体细胞基因表达的神经干细胞的基因表达（A）巢和（B）Sox2的被证实在贴壁细胞增殖培养条件下，成年犬海马神经前体细胞。这些基因的表达是在背侧和腹侧海马衍生的细胞都等同。成年犬成纤维细胞作为对照线以比较在相对于基因表达的差异。 N = 5;误差棒= SEM。从公布的图7修改。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：神经细胞集落形成实验 （A）成年犬神经前体细胞，在克隆密度接种到半固体胶原基质，内培养28天形式神经球。（B）中从背海马衍生神经前体细胞产生的每单位面积的神经球的显著更大数目比那些衍生自腹侧海马。 N = 5;误差棒= SEM;标度= 50微米。从公布的图7修改。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：分化成熟犬海马神经前体细胞免疫细胞化学当BDNF培养28天，从背腹海马成年犬的神经前体细胞分化成神经细胞的成熟（βIII微管蛋白POsitive）和神经胶质（GFAP阳性）的细胞类型。 N = 5;标度= 50微米。从公布的图7修改。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这里描述的协议优化，保持最大限度地提高细胞活力良好的培养条件。期间提取，分离和扩增所采取的速度和护理是至关重要的。建立单层贴壁扩张的一个关键步骤是初级神经球的有效分离。下面这段话，充分游离神经球可能产生二次浮动的神经球。期间媒体的变化，这些神经球可以被移除，解离和重新接种于贴壁单层通道。相反，如果解离后的细胞存活率为80％以下，这可能离解过程中是指示过度移液。神经前体细胞，特别是其分化的对应，对生理范围之外pH值的变化，并暴露于空气敏感。突然广泛的细胞死亡的观察可能是由于这些因素。因此，在媒体瓒的关键一步GES为要进行的媒体新鲜每个时间以及仅50％的体积被替换。最后，虽然促有丝分裂因子EGF和bFGF支持无血清条件下的生存和海马神经前体的增殖在体外 22,23，这些促细胞分裂剂的细胞反应是高度依赖于细胞发育年龄和促有丝分裂的浓度24,25。因此，确保在这些部件最小实验误差是用于产生一致的，可重现的细胞培养物是至关重要的。
为了获得最大的生存能力，应细胞后 6小时内验播种文化。然而，提取的大脑可以暂时存储在PBS在4℃下。这种修改可以允许隔离可以通过长达24小时，在细胞产量26,27最小减少延迟。培养基的生长因子补充也可以被修饰以增强增殖或鼓励各色特定神经细胞类型的ntiation。胰岛素样生长因子1（100毫微克/毫升）已经显示出具有体外 28,29上的啮齿动物的神经干细胞支持性的效果，而在分化条件促神经营养因子30可以结合使用等因素如白介素7（在500纳克/毫升）或视黄酸（0.1μM）以诱导向神经元亚型或神经胶质分化31,32的偏置。
关于是否扩大神经前体细胞为浮动神经球，或作为贴壁单层的决定在很大程度上取决于所需的下游应用和培养特性。而神经球培养系统简单，重现性好，在其产生的细胞均匀人口的能力是有限的。每个球中的复杂的微环境可以促进细胞凋亡和自发分化，鼓励不同种类的人口33，而声望可以混淆神经前体细胞群34的量化神经球orted融合。此外，神经球通道所需的反复机械解离，也可能导致有害的应力，衰老或甚至细胞死亡。使用替代解离酶，如木瓜蛋白酶，可能会影响所得到的细胞生存力16。相反，单层贴壁培养体系，具有更均匀接触环境有丝分裂原，鼓励细胞类型和更对称分裂较大的同质性。该系统已被证明产生细胞小生独立人口的基础上，关键干细胞标记物35,36的表达。这种系统需要使用预涂培养容器，以促进细胞粘附。栽培基质的选择应慎重考虑，因为这可能对培养的神经前体25,37分化轮廓显著的影响。
HERE我们提出有效的协议用于从新鲜验尸组织成年犬海马神经前体细胞的分离，扩增和分化。成年犬的神经前体低于限额文献18;为他们的分离和扩增完整的协议，就更少了17。然后，我们的协议可能有助于增加这个宝贵的动物模型的认识，并代表了显著除了这个温和的多项研究。意义，用我们独特的方法，成年犬海马神经前体细胞可以被成功地扩大了10多个群体倍增。一项类似的研究利用成年犬海马神经前体报道，大神经球，在100代-直径为150微米，停止增殖超越了第五代17。正如在我们的协议指出，过度的神经球生长可以鼓励自发的分化和凋亡，通过串行通道可能成为LED这一减少的增殖能力。我们也提供了该细胞群的贴壁单层扩张的协议，作为替代的经典神经球膨胀系统17-21。这种替代系统，得到在蜂窝环境中的用户更多的控制，并且显著拓宽了这些细胞的下游应用的范围内，对于表型均化和定向神经元分化35,38潜能。
培养的成年犬海马神经前体细胞有在广泛的细胞和神经生物学研究领域的应用。犬齿脑具有更紧密的同源性的人脑比现有啮齿动物模型。因此，成年犬神经前体细胞是一个重要的，但充分研究，资源。这些细胞可用于进一步深入了解背后在人类成人神经发生的机制，以及用于再生疗法的发展即塔尔格等这一过程。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 μl filtered pipette tip | Axygen | TF1000 | |
| 150 mm Petri dish | BD Biosciences | 351058 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 200 μl filtered pipette tip | Axygen | TF200 | |
| 24 well culture plate | Greiner Bio One | 662160 | |
| 35 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353001 | |
| 40 µm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 6 well culture plate | BD Biosciences | 351146 | |
| B-27 Supplement (50x) serum free | Life Technologies | 17504044 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | 13256029 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Millipore | GF029 | |
| Collagen solution | Stem Cell Technologies | 04902 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| DMEM (4.5 g/L, D-glucose) 500 ml | Life Technologies | 11960044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | BD Biosciences | 354001 | |
| F-12 nutrient mixture (Ham) (1x) Liquid | Life Technologies | 31765035 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 16141079 | |
| Gelatin from Porcine Skin Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide (GlutaMAX) | Life Technologies | 35050061 | |
| Heparin sodium salt from (porcine) | Sigma-Aldrich | H314950KU | |
| Laminin (mouse) | Life Technologies | 23017015 | |
| NCFC serum free medium (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5720 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| Proliferation NS-A (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 05773 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit Cat: 05740, and NS-A Prolieration Kit (Rat) Cat: 05771 from Stem Cell Technologies. |
| NSC basal medium (Rat; NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5770 | Also available in the Neurocult NS-A Prolieration Kit (Rat) from Stem Cell Technologies. Cat: 05771 |
| Penicillin/Streptomycin (5,000 U/ml) | Life Technologies | 15070063 | |
| Povidone-iodine | Munipharma | Betadine | |
| Trypan blue (0.4%) | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| Class II biological safety cabinet | ThermoFisher Scientific | Safe 2020 1.2 | |
| Brain knife (disposable) | Macroknife | ||
| Cell culture incubator | ThermoFisher Scientific | HERAcell 150i | |
| Centrifuge | Hettich | Universal 320R | |
| Dumont #5 Forceps | Dumont | ||
| Easypet Electric pipette | Eppindorf | ||
| Hemocytometer | Boeco | Bright-Line Improved Neubauer | |
| Manual pipettes | Eppindorf research | ||
| Oscillating bone saw | |||
| Scalpel blades (No.21) | Paramount | ||
| Scissors | Delta | ||
| Water bath | Grant | JB Aqua 18 plus |
References
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