Summary
O cérebro canino é um modelo valioso para estudar a neurogênese adulta. Aqui apresentados são protocolos para isolar e expandir adultos células precursoras neurais do hipocampo caninos a partir de tecido cerebral primário.
Protocol
De acordo com o New South Wales, Austrália lei, o tecido cerebral post mortem foi adquirida a partir cães adultos sacrificados por razões não relacionadas com o estudo.
1. Preparação do Meio de Cultura
- Prepara-se uma solução de gelatina a 0,1% por adição de 0,1 g de gelatina em pó a 100 ml de água destilada e agitando a 37 ° C até se dissolver. Esterilizar a solução por irradiação UV durante 15 min. Este meio pode então ser armazenado a 4 ° C durante até 1 mês.
- Prepara-se uma proporção de 3: 1 de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) e mistura de nutriente F12 pela adição de 167 mL de F-12 a 500 ml de DMEM (4,5 g / L D-glucose). Adicionar 6,7 ml de solução de Penicilina / Estreptomicina (para uma concentração final de 1%). Este suporte de dados pode ser armazenada no escuro a 4 ° C durante até 1 mês.
- Preparar 500 ml de meio de soro através da combinação de 440 mL de meio DMEM (4,5 g / L D-glucose), 5 mL de L-alanil-L-glutamina dipeptídeo (200 mM), 5 mL de Penicilina / Estreptomicina e 50 ml de bovin fetale soro (FBS). Este suporte de dados pode ser armazenada no escuro a 4 ° C durante até 1 mês.
- meio de crescimento completo consiste em Neural Stem Cell (NSC) Meio Basal e proliferação Neural Suplemento-A (NS-A), 2% de FBS, 2 ug / ml de heparina, 20 ng / de factor de crescimento epidérmico ml (EGF) e 10 ng / mL factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF). Adicione este meio fresco, imediatamente antes da dissecação do cérebro, e aquecer a 37 ° C num banho de água.
2. Extração de cérebro
- Comece a extração dentro de 6 horas post mortem, esterilizando a superfície dorsal da cabeça do cão usando iodopovidona.
- Utilizando um bisturi, fazer uma incisão longitudinal ao longo da linha média sagital, por toda a superfície dorsal do crânio, para expor os músculos subjacentes masséter. O comprimento deste corte irá depender da espécie e idade do cão.
- Nas fronteiras rostral e caudal do crânio, faça adicional de 5 - 10 cm cortes perpendiculares em ambos os lados, passeing atrás dos olhos e ouvidos, respectivamente, para permitir que a pele a ser totalmente refletida.
- Usando um bisturi, separar os músculos masseter de seu apego à crista sagital do crânio e raspar qualquer tecido conjuntivo remanescente do crânio.
- Usando um osso oscilante viu cortar a tampa do crânio em uma linha circunferencial. Usando uma sonda ou bisturi cortar quaisquer anexos remanescentes com a dura-máter, e, em seguida, retire cuidadosamente a tampa do crânio para expor a superfície dorsal do cérebro.
Cuidado: A espessura do osso varia em diferentes regiões do crânio, assim que o cuidado deve ser exercido para não penetrar muito profundamente e danificar o cérebro subjacente. - Separar a medula espinal por inserção de um bisturi entre as vértebras cervicais superiores.
- Com uma mão para levantar suavemente o cérebro, usar um bisturi para libertar cuidadosamente o cérebro do crânio e fossas cortar os nervos e os vasos sanguíneos de ligação situadas no seu lado ventral. Levante cuidadosamente a bchuva para fora do crânio e para um recipiente de DPBS.
Cuidado: Os grandes bulbos olfativos do cérebro canino pode estender-se profundamente na fossa craniana anterior. Deve ser tomado cuidado ao remover o cérebro de modo a preservar estas estruturas.
3. hipocampo Dissection
- Lavar o cérebro em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) para remover todo o sangue e colocá-lo lado dorsal para baixo sobre uma placa de Petri de 150 mM.
- Lentamente bissectar o cérebro longitudinalmente através do plano médio-sagital utilizando uma faca cérebro molhado e uma única fatia que utiliza o comprimento total da lâmina. Não aplique pressão adicional, ou usar um movimento de corte, pois isso pode danificar o tecido.
- Colocando cada medial hemisfério superfície para cima, dissecar o hipocampo utilizando um bisturi e pinça fina, e transferi-lo para um prato de cultura de tecidos de 35 mm.
4. Isolamento de células neurais precursoras
- Picar o tamostras de problema usando uma lâmina de bisturi em aproximadamente 1 mm 3 peças.
- Transferir o tecido em um tubo de 15 ml, adicionar 2 ml de tripsina a 0,1% de EDTA, e incuba-se durante 7 minutos num banho de água a 37 ° C.
- Pare a reacção enzimática pela adição de 4 ml de meio de soro para o tubo. Pellet da suspensão por centrifugação a 100 xg durante 7 minutos e remover o sobrenadante.
- Ressuspenso o sedimento em 300 mL de DPBS, e mecanicamente dissociados cuidado pipetando para cima e para baixo, usando uma ponteira 1.000 l, até se formar um homogeneizado lisas.
- Adicionar 14 ml de meio de soro ao tubo passar e a suspensão de células através de um coador de células de 40 ^ m. Pellet da suspensão por centrifugação a 100 xg durante 7 minutos, remover o sobrenadante e ressuspender em meio de crescimento completo.
5. Cultura Neurosphere
- A partir da suspensão de células obtida no isolamento, contar o número de células viáveis utilizando a exclusão de tripano de corante azul e uma hemocitômetro.
- Dilui-se a suspensão de células em meio de crescimento completo e sementes a 1 x 10 5 células / cm2 em poços não revestidos de uma placa de 6 poços.
- Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 e> 95% de humidade durante 14 - 28 dias, substituir 50% do meio de crescimento a cada 7 dias. Medir o diâmetro das neuroesferas regularmente. Se for permitido que crescem para além de 100 um de diâmetro, a morte celular e diferenciação espontânea pode ocorrer dentro das neuroesferas.
6. Neurosphere Passage
- Para passagem como uma cultura flutuante, quando as neuroesferas atingir cerca de 100 um de diâmetro, combinar todos os meios neuroesfera contendo em um único tubo. Sedimentar por centrifugação a 100 xg durante 7 minutos e remover o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento em 1 ml de 0,1% de tripsina EDTA e incubar durante 7 minutos num banho de água a 37 ° C. Pipeta suavemente para cima e para baixo de 100 vezes, utilizando uma ponta de pipeta de 200 mL, para garantir dissociatisobre as neuroesferas.
- Pare a reacção enzimática por adição de 5 ml de meio de soro para o tubo e centrifugar a 100 xg durante 7 minutos.
- Remover o sobrenadante, ressuspender o sedimento celular em 1 ml de meio de crescimento completo e contar o número de células viáveis utilizando azul de tripano de corante de exclusão e um hemocitómetro.
- Dilui-se a suspensão de células em meio de crescimento completo e sementes a 1 x 10 5 células / cm2 em poços não revestidos de uma placa de 6 poços. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 e> 95% de humidade durante 14 - 28 dias, a substituição de 50% dos meios de crescimento a cada 7 dias.
7. Aderente Cultura de células neuronais precursoras
- Adicionar um volume suficiente de solução de gelatina a 0,1% para cobrir a superfície de um prato de cultura de tecidos e cura em estufa a 37 ° C durante 1 h antes de processar as neuroesferas para cultura aderente.
- A partir da cultura neurosphere flutuante, combinar todas as mídias em um único tubo. Agregar as neurospheres por centrifugação a 100 xg durante 7 minutos e remover o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento em 1 ml de 0,1% de tripsina EDTA e incubar durante 7 minutos num banho de água a 37 ° C. Pipeta suavemente para cima e para baixo de 100 vezes, utilizando uma ponta de pipeta de 200 mL.
- Adicionar 5 ml de meio de soro para interromper a reacção enzimática e centrifugar a 100 xg durante 7 minutos. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 1 ml de meio de crescimento completo e contar o número de células viáveis utilizando azul de tripano de corante de exclusão e um hemocitómetro.
- Dilui-se a suspensão de células em meio de crescimento completo, remover a gelatina a partir dos frascos de cultura de tecidos e semear as células a 1 x 10 4 células / cm2.
- Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO 2 e> 95% de humidade. Substituir a mídia com, aquecido, meios de crescimento frescos completas a cada três dias até que a cultura atinge aproximadamente 80% de confluência (após aproximadamente 7 dias).
8. Neural Colony Forming Assay
- Combine celular componentes de mídia (NCFC) ensaio de formação Neural Colony: meio de soro NCFC livre, Proliferação NS-A, e solução de colágeno (3 mg / ml). Suplemento este meio com 2 ug / ml de heparina, 20 ng / ml de EGF, e 10 ng / ml de bFGF.
- Após dissociação de tecido do hipocampo ressuspender as células em colónia neural formando meio de ensaio, pré-aquecido a 37 ° C num banho de água. Semear as células a uma densidade clonal de 1,1 x 10 5 culas / ml num prato de cultura de 35 mm.
- Incubar as células nesta matriz de colagénio semi-sólido a 37 ° C, 5% de CO 2 e> 95% de humidade. Cultura de 28 dias, a substituição de 50% do meio de crescimento a cada 7 dias.
9. A diferenciação de células neuronais precursoras
- Adicionar um volume suficiente de 5 ug / cm solução laminina 2 para cobrir a superfície de um prato de cultura de tecidos e cura em estufa a 37 ° C durante 24 h antes do processamento das células de diferenciaçãoção.
Nota: Remover a solução laminina e enxaguar a superfície revestida por duas vezes em DPBS imediatamente antes da semeadura. - Quando passaging, a semente da suspensão de células a 1 x 10 4 células / cm2 em DMEM-F12 (3: 1) meios (pré-aquecido a 37 ° C) suplementado com 20 ng / ml de EGF e 40 ng / ml de bFGF para o laminina revestido prato de cultura.
- Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO 2 e> 95% de humidade e permitir que as células a proliferar durante 3 dias.
- Para diferenciar as células precursoras neurais aderentes, depois de 3 dias substituir os meios de comunicação com meios de diferenciação contendo DMEM-F12 (3: 1) meios de pré-aquecido a 37 ° C, suplementada com 10 ng / ml cérebro factor neurotrófico derivado (BDNF).
- Durante a diferenciação substituir 50% do meio a cada 3 dias. A diferenciação ocorre gradualmente ao longo de cerca de 21-28 dias.
Cuidado: Uma vez que as células tenham começado a diferenciar-se, substituir apenas 50% dos meios de comunicação em uma TI-me como a exposição ao ar podem ter um efeito prejudicial na saúde das células.
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Representative Results
Através do uso de precursores neuronais in vitro, ensaios neurogénese e populações de células precursoras neurais foram caracterizadas e comparadas ao longo do eixo dorsoventral do hipocampo adulto canino. células precursoras neurais derivadas de tecido do hipocampo isolado formado neuroesferas flutuante no prazo de 14 dias de isolamento, atingindo um diâmetro de 100 um até 28 dias de cultura. As neuroesferas derivados de dorsal e ventral isolados mostrou nenhuma diferença em tamanho significativo, e após dissociação enzimática em células individuais, pode ser passado como culturas de neuroesferas flutuante. neurospheres flutuantes secundárias de ambas as regiões do hipocampo foram capazes de formar dentro de 5 dias de passagem. Quando semeadas a 1 x 10 4 células / cm2 em frascos de cultura de 0,1% de gelatina revestidos, as células precursoras neurais também foram capazes de proliferar como monocamadas aderentes (Figura 1A). Não há diferenças morfológicas foram observadas entrN dorsal e as células precursoras neurais do hipocampo ventral e ambas as culturas aderentes foram capazes de submeter-se a mais de 10 duplicações da população sem qualquer observada em retardar a passagem do tempo (figura 1B). Nestina e Sox2 expressão génica em células estaminais neurais em cultura aderente não foi significativamente diferente entre o eixo dorsoventral do hipocampo (Figura 2). Mais extensa caracterização da expressão gênica e protéica, confirmando a identidade precursor neural destas células, é relatado em nossos dados publicados 7.
Usando um adaptado Neural Colony Forming 4,6 ensaio avaliou-se a frequência de células precursoras neuronais a fim de quantificar as diferenças de potencial em populações de células precursoras neuronais em todo o sub-regiões dorsal e ventral do hipocampo canino. As células foram semeadas a uma densidade clonal em uma matriz de colagénio semi-sólido que se opõe a fusão celular, e cultivadas durante 28 dias (Figura 3A F = 96,8; p = 0,001; Figura 3B ).
Em condições de diferenciação, as células precursoras neurais caninos aderentes apresentaram alterações progressivas na morfologia, desenvolvimento de processos mais elaborados mais tempo e. A expressão de proteínas por neuronal (βIII-tubulina) e (proteína ácida fibrilar glial, GFAP) glial marcadores aumentou também após a diferenciação (Figura 4). Não houve diferença significativa observada no número de células marcadas positivamente entre dorsal e ventral isolados. Nossos dados publicado anteriormente corrobora essas mudanças de expressão de proteínas, demonstrando aumento da regulação dos genes associados juntamente com a regulação negativa de neural genes precursores durante o período de diferenciação 28 dias 7.
Figura 1:. In Vitro expansão de células Adulto Canino hipocampo Neural Precursor mediana células neuronais do hipocampo canino precursoras isoladas a partir da dorsal e regiões do hipocampo ventral são expandidos como (a) neuroesferas flutuantes ou como (B) uma monocamada aderente (C) Como. monocamada aderente estas células precursoras neurais poderia sofrer passagem mais de 10 vezes, sem redução significativa na duplicação da velocidade. n = 5; scale = 50 mm. Modificado de valor publicado 7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2:. Expressão de genes em células em proliferação Adulto Canino hipocampo Neural Precursor A expressão de genes de células estaminais neurais (A) nestina e (B) Sox2 foi confirmada em células de hipocampo de adulto canino precursoras neuronais proliferativas sob condições de cultura aderentes. A expressão destes genes foi equivalente em ambos dorsal e células de hipocampo ventral derivado. fibroblastos adultos canino foram usadas como uma linha de controlo para comparar as diferenças na expressão genética relativa. n = 5; barras de erro = SEM. Modificado de valor publicado 7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Neural Formadoras de Colónias de Ensaio (A)Células adultas canino neurais precursoras, semeadas a uma densidade clonal em uma matriz de colagénio semi-sólido, neuroesferas formar-se dentro de 28 dias de cultura. (B), as células precursoras neurais derivados dos hipocampo dorsal gerar significativamente maiores números de neuroesferas por unidade de área do que os derivados de o hipocampo ventral. n = 5; barras de erro = SEM; scale = 50 mm. Modificado de valor publicado 7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Imunocitoqu�ica de células diferenciadas Adulto Canino hipocampo Neural Precursor Quando cultivados em BDNF durante 28 dias, adultos canina precursores neurais, tanto do dorsal e hipocampo ventral diferenciar em neurônios maduros (po βIII-tubulinasitive) e gliais (tipos de células positivas) GFAP. n = 5; scale = 50 mm. Modificado de valor publicado 7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os protocolos aqui descritos são optimizados para manter condições favoráveis de cultura para maximizar a viabilidade celular. A velocidade e cuidado durante a extração, isolamento e expansão é de importância crítica. Um passo fundamental para o estabelecimento de expansão monocamada aderente é a dissociação eficaz das neuroesferas primárias. Passagem seguinte, insuficientemente dissociada neurospheres pode gerar neurospheres flutuantes secundárias. Durante a mudança de mídia, estes neurospheres pode ser removido, dissociados e reseeded para a passagem monocamada aderente. Por outro lado, se a viabilidade das células pós-dissociação é inferior a 80%, isto pode ser indicativo de pipetagem excessivo durante a dissociação. As células precursoras neurais e, nomeadamente, os seus homólogos diferenciadas, são sensíveis às mudanças no pH fora da faixa fisiológica e exposição ao ar. A observação de morte celular generalizada súbita pode ser atribuída a estes factores. Consequentemente, um passo crítico durante media chanGES é para os meios de comunicação para ser feito fresco de cada vez, e de apenas 50% do volume a ser substituído. Finalmente, enquanto os factores mitogénicos de EGF e bFGF suportar a sobrevivência e proliferação de precursores neuronais do hipocampo em condições isentas de soro, in vitro 22,23, a resposta celular a estes mitogénios é altamente dependente da idade de desenvolvimento celular e a concentração mitogénica 24,25. Por conseguinte, garantir a variação mínima experimental nestes componentes é crucial para a geração de culturas de células, consistentes e reprodutíveis.
Para a viabilidade máxima, as células devem ser semeadas para a cultura dentro de 6 horas post mortem. No entanto, o cérebro extraído pode ser temporariamente armazenada em PBS a 4 ° C. Esta modificação pode permitir o isolamento a ser atrasado por até 24 horas com uma redução mínima no rendimento celular 26,27. a suplementação do meio de cultura do factor de crescimento também podem ser modificados para aumentar a proliferação ou para estimular a diferentiation de tipos de células neuronais específicas. Factor de crescimento semelhante a insulina 1 (a 100 ng / ml) foi demonstrado ter um efeito favorável sobre as células estaminais neurais roedor in vitro 28,29, enquanto que sob condições de diferenciação neuronal factor de pró-BDNF 30 pode ser usado em conjunto com factores tais como a interleucina 7 (a 500 ng / mL) ou ácido retinóico (a 0,1 uM) para induzir uma tendência para o subtipo neuronal ou glial diferenciação 31,32.
A decisão sobre a possibilidade de expandir as células precursoras neurais como neurospheres flutuantes ou como uma monocamada aderente depende em grande parte das aplicações a jusante desejados e características da cultura. Enquanto o sistema de cultura neurosphere é simplista e altamente reprodutível, é limitado em sua capacidade de gerar populações homogêneas de células. O microambiente complexo dentro de cada esfera pode promover a apoptose e diferenciação espontânea, encorajando uma população heterogênea 33, enquanto representantefusion orted de neurospheres que podem confundir a quantificação das populações de células precursoras neurais 34. Além disso, a dissociação mecânica repetida necessária para neuroesfera passagem também pode levar ao estresse prejudicial, a senescência ou até mesmo a morte celular. A utilização da enzima de dissociação alternativa, tal como papaína, pode afectar a viabilidade celular resultante 16. Por outro lado, o sistema de cultura em monocamada aderente, com a exposição mais uniforme a mitógenos ambientais, incentiva uma maior homogeneidade no tipo de célula e divisão mais simétrico. Este sistema tem sido mostrado para produzir uma população de células independente de nicho, com base na expressão de marcadores de células estaminais chave 35,36. Este sistema requer a utilização de recipientes de cultura de pré-revestidos para promover a adesão celular. A escolha do substrato de cultura deve ser cuidadosamente considerada, uma vez que pode ter efeitos significativos sobre o perfil diferenciação dos precursores neurais em cultura 25,37.
Here apresentamos protocolos eficazes para o isolamento, a expansão e a diferenciação de células precursoras do hipocampo adulto canino neurais a partir de tecido post-mortem fresco. Precursores neurais caninos adultos estão sub-representadas na literatura de 18 anos; com protocolos completos para o seu isolamento e expansão, ainda menos 17. Nossos protocolos pode, então, servir para aumentar a sensibilização para este modelo animal valioso e representa um contributo significativo para este número modesto de estudos. De significância, usando o nosso método único, precursores neurais do hipocampo caninos adultos pode ser expandido com sucesso mais de 10 duplicações da população. Um estudo semelhante utilizando precursor neural do hipocampo canino adulto relatou que neurospheres maiores, passadas a 100-150 m de diâmetro, deixou proliferação para além da quinta geração 17. Como observado em nosso protocolo, o crescimento neurosphere excessivo pode estimular diferenciação espontânea e apoptose, que ao longo passagem em série pode ter lEd a esta redução da capacidade proliferativa. Também fornecemos um protocolo para a expansão monocamada aderente desta população de células, como uma alternativa para o sistema de expansão neuroesfera clássica 17-21. Este sistema alternativo proporciona ao usuário mais controle sobre o ambiente celular, e amplia significativamente a gama de aplicações a jusante para estas células, com potencial para homogeneização fenotípica e dirigido a diferenciação neuronal 35,38.
adultas cultivadas células precursoras neurais do hipocampo caninos têm aplicações em uma ampla gama de campos de pesquisa celulares e neurobiológicos. O cérebro canino possui uma homologia mais próxima do cérebro humano do que os modelos de roedores existentes. Como tal, adultos células precursoras neurais caninos representam um importante, ainda pouco estudada, de recursos. Estas células podem ser usadas para obter mais conhecimentos sobre os mecanismos subjacentes a neurogénese adulto em seres humanos, e para o desenvolvimento de terapias de regeneração que target este processo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 μl filtered pipette tip | Axygen | TF1000 | |
| 150 mm Petri dish | BD Biosciences | 351058 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 200 μl filtered pipette tip | Axygen | TF200 | |
| 24 well culture plate | Greiner Bio One | 662160 | |
| 35 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353001 | |
| 40 µm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 6 well culture plate | BD Biosciences | 351146 | |
| B-27 Supplement (50x) serum free | Life Technologies | 17504044 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | 13256029 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Millipore | GF029 | |
| Collagen solution | Stem Cell Technologies | 04902 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| DMEM (4.5 g/L, D-glucose) 500 ml | Life Technologies | 11960044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | BD Biosciences | 354001 | |
| F-12 nutrient mixture (Ham) (1x) Liquid | Life Technologies | 31765035 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 16141079 | |
| Gelatin from Porcine Skin Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide (GlutaMAX) | Life Technologies | 35050061 | |
| Heparin sodium salt from (porcine) | Sigma-Aldrich | H314950KU | |
| Laminin (mouse) | Life Technologies | 23017015 | |
| NCFC serum free medium (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5720 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| Proliferation NS-A (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 05773 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit Cat: 05740, and NS-A Prolieration Kit (Rat) Cat: 05771 from Stem Cell Technologies. |
| NSC basal medium (Rat; NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5770 | Also available in the Neurocult NS-A Prolieration Kit (Rat) from Stem Cell Technologies. Cat: 05771 |
| Penicillin/Streptomycin (5,000 U/ml) | Life Technologies | 15070063 | |
| Povidone-iodine | Munipharma | Betadine | |
| Trypan blue (0.4%) | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| Class II biological safety cabinet | ThermoFisher Scientific | Safe 2020 1.2 | |
| Brain knife (disposable) | Macroknife | ||
| Cell culture incubator | ThermoFisher Scientific | HERAcell 150i | |
| Centrifuge | Hettich | Universal 320R | |
| Dumont #5 Forceps | Dumont | ||
| Easypet Electric pipette | Eppindorf | ||
| Hemocytometer | Boeco | Bright-Line Improved Neubauer | |
| Manual pipettes | Eppindorf research | ||
| Oscillating bone saw | |||
| Scalpel blades (No.21) | Paramount | ||
| Scissors | Delta | ||
| Water bath | Grant | JB Aqua 18 plus |
References
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