Summary
Il cervello canino è un modello valido in cui studiare neurogenesi adulta. Presentato qui sono i protocolli per isolare ed espandere adulti canini dell'ippocampo cellule precursori neurali dal tessuto cerebrale primario.
Protocol
In accordo con New South Wales, in Australia la legge, dopo il tessuto cerebrale mortem è stata acquisita da cani adulti eutanasia per ragioni non correlate allo studio.
1. Preparazione del terreno di coltura
- Preparare una soluzione di gelatina 0,1% aggiungendo 0,1 g di gelatina in polvere a 100 ml di acqua distillata e agitazione a 37 ° C fino a dissoluzione. Sterilizzare la soluzione per irraggiamento UV per 15 min. Questo supporto può essere conservato a 4 ° C per 1 mese.
- Preparare un rapporto 3: 1 di Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) e nutrienti F12 miscela aggiungendo 167 ml di F-12 a 500 ml di DMEM (4,5 g / L D-glucosio). Aggiungere 6.7 ml di soluzione di penicillina / streptomicina (per una concentrazione finale 1%). Questo supporto può essere conservato al buio a 4 ° C per 1 mese.
- Preparare 500 ml di media siero combinando 440 ml di DMEM (4,5 g / L D-glucosio), 5 ml di L-alanil-L-glutammina dipeptide (200 mM), 5 ml di penicillina / streptomicina e 50 ml di bovin fetalee siero (FBS). Questo supporto può essere conservato al buio a 4 ° C per 1 mese.
- terreno di coltura completo è costituito da cellule staminali neurali (NSC) basale media e proliferazione Neural Supplemento-A (NS-A), 2% FBS, 2 mg / eparina ml, 20 ng / ml fattore di crescita epidermico (EGF) e 10 ng / ml fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF). Rendere tale supporto fresco, immediatamente prima dissezione del cervello, e riscaldare a 37 ° C in un bagno d'acqua.
2. Cervello Estrazione
- Inizia l'estrazione entro 6 ore post mortem sterilizzando la superficie dorsale della testa del cane usando iodopovidone.
- Usando un bisturi, fare una incisione longitudinale lungo la linea mediana sagittale, su tutta la superficie dorsale del cranio, per esporre i muscoli masseteri sottostanti. La lunghezza di questo taglio dipende dalla specie e l'età del cane.
- Ai confini rostrale e caudale del cranio, fare altri 5 - 10 cm tagli perpendicolari su entrambi i lati, passareing dietro gli occhi e le orecchie, rispettivamente, per permettere alla pelle di essere pienamente riflessa.
- Usando un bisturi, separare i muscoli masseteri dal loro attaccamento alla cresta sagittale del cranio e raschiare qualsiasi tessuto connettivo rimanente dal cranio.
- Utilizzando un osso oscillante visto tagliare il tappo del cranio in una linea circonferenziale. Usando una sonda o bisturi recidere ogni residuo di allegati con la dura, e poi rimuovere con attenzione la calotta per esporre la superficie dorsale del cervello.
Attenzione: Lo spessore dell'osso varia in diverse regioni del cranio, quindi si deve esercitare cautela per non penetrano troppo profonda e danneggiare il cervello sottostante. - Recidere il midollo spinale inserendo un bisturi tra le vertebre cervicali.
- Con una mano per sollevare delicatamente il cervello, usare un bisturi per liberare con cura il cervello dalla fossa cranica e recidere i nervi e vasi sanguigni di collegamento situati sul suo lato ventrale. Sollevare delicatamente la bpioggia fuori del cranio e in un contenitore di DPBS.
Attenzione: Le grandi bulbi olfattivi del cervello canino possono estendersi in profondità nella fossa cranica anteriore. Bisogna fare attenzione quando si rimuove il cervello in modo da preservare queste strutture.
3. ippocampale Dissection
- Sciacquare il cervello in tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) per rimuovere il sangue e posizionarlo lato dorsale verso il basso su un 150 millimetri piastra di Petri.
- Lentamente bisect cervello longitudinalmente attraverso il piano sagittale con un coltello cervello bagnato e una sola fetta che utilizza l'intera lunghezza della lama. Non applicare ulteriore pressione verso il basso, o utilizzare un movimento di taglio, per evitare di danneggiare il tessuto.
- Posizionamento di ogni mediale dell'emisfero superficie fino, sezionare l'ippocampo con un bisturi e pinza sottile e le trasferisce ad un piatto di coltura di tessuti da 35 mm.
4. L'isolamento di cellule neurali Precursore
- Tritare il temettere campioni utilizzando una lama di bisturi in circa 1 mm 3 pezzi.
- Trasferire il tessuto in una provetta da 15 ml, 2 ml di 0,1% tripsina EDTA e incubare per 7 minuti in un bagno d'acqua a 37 ° C.
- Arrestare la reazione enzimatica aggiungendo 4 ml di mezzi di siero al tubo. Pellet la sospensione mediante centrifugazione a 100 xg per 7 minuti e rimuovere il surnatante.
- Risospeso il pellet in 300 ml di DPBS, e meccanicamente dissociato pipettando gentilmente su e giù, con un puntale di 1.000 ml, fino a quando si forma una omogenato lisce.
- Aggiungere 14 ml di mezzi di siero al tubo e passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cella 40 micron. Pellet la sospensione mediante centrifugazione a 100 xg per 7 minuti, rimuovere il surnatante, e risospendere in terreno di coltura completo.
5. cultura neurosfere
- Dalla sospensione cellulare ottenuta in isolamento, contare il numero di cellule vitali utilizzando Trypan blue dye esclusione e un hemocitometro.
- Diluire la sospensione cellulare in mezzo di crescita completo e sementi a 1 x 10 5 cellule / cm 2 nei pozzetti rivestiti di una piastra 6 bene.
- Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2 e> 95% di umidità per 14 - 28 giorni, sostituire il 50% dei terreni di crescita ogni 7 giorni. Misurare il diametro delle neurosfere regolarmente. Se permesso di crescere oltre i 100 micron di diametro, la morte cellulare e la differenziazione spontanea possono verificarsi entro le neurosfere.
6. neurosfere Passage
- Per il passaggio da una cultura fluttuante, quando le neurosfere raggiungono circa 100 micron di diametro, unire tutti i media neurosfere contenente in un unico tubo. Pellet per centrifugazione a 100 xg per 7 minuti e rimuovere il surnatante.
- Risospendere il pellet in 1 ml di 0,1% tripsina EDTA e incubare per 7 minuti in un bagno d'acqua a 37 ° C. Delicatamente pipetta su e giù per 100 volte, usando un puntale 200 pl, al fine di garantire dissociatisu delle neurosfere.
- Arrestare la reazione enzimatica aggiungendo 5 ml di media siero nella provetta e centrifugare a 100 xg per 7 minuti.
- Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 ml di mezzo di crescita completo e contare il numero di cellule vitali mediante trypan colorante blu esclusione e un emocitometro.
- Diluire la sospensione cellulare in mezzo di crescita completo e sementi a 1 x 10 5 cellule / cm 2 nei pozzetti rivestiti di una piastra 6 bene. Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2 e> 95% di umidità per 14 - 28 giorni, sostituendo il 50% dei terreni di crescita ogni 7 giorni.
7. Cultura aderente cellule neurali Precursore
- Aggiungere un volume sufficiente di soluzione di gelatina 0,1% per coprire la superficie di un piatto di coltura tissutale e la polimerizzazione in un incubatore a 37 ° C per 1 ora prima di elaborare le neurosfere cultura aderente.
- Dalla cultura neurosfere galleggiante, unire tutti i media in un unico tubo. Agglomerare le neurospheres per centrifugazione a 100 xg per 7 minuti e rimuovere il surnatante.
- Risospendere il pellet in 1 ml di 0,1% tripsina EDTA e incubare per 7 minuti in un bagno d'acqua a 37 ° C. Delicatamente pipetta su e giù per 100 volte, usando un puntale 200 l.
- Aggiungere 5 ml di mezzi di siero per fermare la reazione enzimatica e centrifugare a 100 xg per 7 minuti. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di terreno di coltura completo e contare il numero di cellule vitali utilizzando Trypan colorante blu esclusione e un emocitometro.
- Diluire la sospensione di cellule in terreno di coltura, rimuovere la colla di pesce dai fiaschi di coltura di tessuti e seminare le cellule a 1 x 10 4 cellule / cm 2.
- Incubare le cellule a 37 ° C, 5% di CO 2 e> 95% di umidità. Sostituire il supporto con, riscaldato, i media di crescita complete freschi ogni tre giorni fino a quando la cultura raggiunge circa l'80% di confluenza (dopo circa 7 giorni).
8. Neural Colony Forming Assay
- Combinare neurale formanti colonia cellulari componenti multimediali (NCFC) del saggio: media NCFC siero libero, proliferazione NS-A, e la soluzione di collagene (3 mg / ml). Supplemento questo supporto con 2 mg / ml di eparina, 20 ng / ml EGF, e 10 ng / ml bFGF.
- Dopo la dissociazione del tessuto dell'ippocampo risospendere le cellule in colonia neurali che formano terreno di coltura, pre-riscaldato a 37 ° C in un bagno d'acqua. Seme le cellule ad una densità clonale di 1,1 x 10 5 cellule / ml in un piatto di coltura da 35 mm.
- Incubare le cellule in questa matrice di collagene semi-solido a 37 ° C, 5% di CO 2 e> 95% di umidità. Culture per 28 giorni, sostituendo il 50% dei mezzi di crescita ogni 7 giorni.
9. differenziazione delle cellule neurali Precursore
- Aggiungere un volume sufficiente di 5 mg / cm 2 soluzione laminina per coprire la superficie di un piatto di coltura tissutale e la polimerizzazione in un incubatore a 37 ° C per 24 ore prima di elaborare le cellule per differentiazione.
Nota: Rimuovere la soluzione laminina e risciacquare la superficie rivestita due volte in DPBS immediatamente prima della semina. - Quando passaging, seminare la sospensione cellulare a 1 x 10 4 cellule / cm 2 in DMEM-F12 (3: 1) i media (pre-riscaldato a 37 ° C) integrata con 20 ng / ml EGF e 40 ng / ml bFGF sul laminina rivestito piatto di coltura.
- Incubare le cellule a 37 ° C, 5% di CO 2 e> 95% di umidità e consentono alle cellule a proliferare per 3 giorni.
- Per differenziare le cellule precursori neurali aderenti, dopo 3 giorni sostituire il supporto con i media differenziazione contenenti DMEM-F12 (3: 1) supporto pre-riscaldato a 37 ° C, supplementato con 10 ng / ml cervello derivato fattore neurotrofico (BDNF).
- Durante differenziazione sostituire il 50% dei media ogni 3 giorni. La differenziazione avviene gradualmente nel corso di circa 21 - 28 giorni.
Attenzione: Una volta che le cellule hanno iniziato a differenziarsi, sostituire solo il 50% dei mezzi a uno time come esposizione all'aria può avere un effetto negativo sulla salute delle cellule.
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Representative Results
Attraverso l'uso di precursori neuronali in vitro saggi, neurogenesi e popolazioni di cellule progenitrici sono stati caratterizzati e confrontati attraverso l'asse dorsoventrale dell'ippocampo cane adulto. cellule precursori neurali derivate da tessuto dell'ippocampo isolato formarono neurosfere galleggiante entro 14 giorni di isolamento, raggiungendo un diametro di 100 micron entro il 28 giorni di coltura. Neurosfere derivate da dorsali e ventrali isolati hanno mostrato alcuna differenza nella dimensione media, e dopo dissociazione enzimatica in singole cellule, potrebbero essere diversi passaggi come galleggiante culture neurosfere. neurosfere galleggianti secondari di entrambe le regioni dell'ippocampo sono stati in grado di formare entro 5 giorni dal passaggio. Quando seminate a 1 x 10 4 cellule / cm 2 sul 0,1% ricoperto di gelatina fiasche di coltura, le cellule precursori neurali sono stati anche in grado di proliferare monostrati come aderenti (Figura 1A). Nessuna differenza è stata osservata morfologiche between dorsale e cellule precursori neurali dell'ippocampo ventrali e entrambe le culture aderenti sono stati in grado di sottoporsi a più di 10 raddoppi popolazione senza alcuna osservato un rallentamento nel passaggio-tempo (Figura 1B). Nestin e Sox2 espressione genica di cellule staminali neurali in coltura aderente non era significativamente diversa lungo l'asse dorsoventrale dell'ippocampo (Figura 2). Una più ampia caratterizzazione genica e proteica, confermando l'identità precursori neurali di queste cellule, è riportata in nostri dati pubblicati 7.
L'utilizzo di un adeguato Neural formanti colonia saggio 4,6 abbiamo valutato la frequenza di cellule precursori neurali al fine di quantificare i potenziali differenze di popolazioni di cellule precursore neuronali attraverso la dorsale e ventrale sottoregioni dell'ippocampo canina. Le cellule sono state seminate ad una densità clonale in un semi-solido matrice di collagene che preclude fusione cellulare, e coltivate per 28 giorni (Figura 3A F = 96,8; p = 0.001; figura 3B ).
In condizioni di differenziazione, aderenti canine cellule precursori neurali hanno mostrato alterazioni progressive nella morfologia lordo, in via di sviluppo più a lungo e processi più elaborate. Espressione della proteina per neuronale (βIII-tubulina) e gliale (proteina silicea fibrillare gliale; GFAP) marcatori anche aumentato a seguito di differenziazione (Figura 4). Nessuna differenza significativa osservata nel numero di cellule marcate positivamente tra dorsali e ventrali isolati. I nostri dati pubblicati in precedenza avvalora questi cambiamenti di espressione proteica, dimostrando up-regolazione dei loro geni associati con down-regulation di neurale geni precursori durante il periodo di differenziazione 28 giorni 7.
Figura 1:. In Vitro espansione di cellule adulte Canine ippocampale neurale precursori adulti canini dell'ippocampo cellule precursori neurali isolate dalla dorsale e regioni dell'ippocampo ventrali sono espansi come (A) neurosfere galleggianti o come (B) un monostrato aderente (C) Come. monostrato aderente queste cellule precursori neurali potrebbero subire il passaggio di oltre 10 volte senza calo significativo raddoppiando la velocità. n = 5; scala = 50 micron. Modificata dalla figura pubblicato 7. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 2:. L'espressione genica in cellule proliferanti Canine Adult ippocampale neurale Precursore espressione di geni di cellule staminali neurali (A) Nestin e (B) Sox2 è stata confermata in cellule adulte canine dell'ippocampo neurali precursori in condizioni di coltura proliferative aderenti. Espressione di questi geni era equivalente sia dorsale e cellule dell'ippocampo derivato ventrale. fibroblasti Canine Adult sono state usate come una linea di controllo per confrontare le differenze di espressione genica relativa. n = 5; barre di errore = SEM. Modificata dalla figura pubblicato 7. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Neural formanti colonia Assay (A)Adulti cellule canine neurali precursori, seminate a densità clonale in una matrice di collagene semi-solido, neurosfere modulo entro 28 giorni della cultura. (B) le cellule precursori neurali derivate dalle dell'ippocampo dorsale generano significativamente un maggior numero di neurosfere per unità di superficie rispetto a quelle derivate da l'ippocampo ventrale. n = 5; barre di errore = SEM; scala = 50 micron. Modificata dalla figura pubblicato 7. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Immunocitochimica di cellule differenziate Canine Adult ippocampale neurale precursori Quando coltivate in BDNF per 28 giorni, per adulti canino precursori neurali sia dalla dorsale e ventrale ippocampo si differenziano in neuroni maturi (po βIII-tubulinaallo snervamento) e gliali (tipi positivo) di cellule GFAP. n = 5; scala = 50 micron. Modificata dalla figura pubblicato 7. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I protocolli descritti qui sono ottimizzati per mantenere condizioni di coltura favorevoli per massimizzare la vitalità cellulare. La velocità e la cura durante l'estrazione, l'isolamento e l'espansione è di importanza critica. Un passo fondamentale per stabilire l'espansione monostrato aderente è la dissociazione efficace delle neurosfere primarie. A seguito di passaggio, non sufficientemente dissociate neurosfere possono generare neurosfere galleggianti secondarie. Durante il cambio dei media, questi neurosfere possono essere rimossi, dissociate e reseeded per il passaggio monostrato aderente. Al contrario, se la vitalità delle cellule post-dissociazione è inferiore all'80%, questo può essere indicativo di pipettaggio eccessivo durante la dissociazione. cellule precursori neurali, e in particolare le loro controparti differenziati, sono sensibili alle variazioni di pH al di fuori del range fisiologico, e l'esposizione all'aria. L'osservazione della improvvisa morte cellulare diffusa può essere attribuibile a questi fattori. Di conseguenza, un passo fondamentale nel supporto chanGES è per i supporti da fatti freschi ogni volta, e solo il 50% del volume da sostituire. Infine, mentre i fattori mitogeni EGF e bFGF sostengono la sopravvivenza e la proliferazione dei precursori neurali dell'ippocampo in condizioni di assenza di siero in vitro 22,23, la risposta cellulare a questi mitogeni è fortemente dipendente dall'età evolutiva delle cellule e la concentrazione mitogenica 24,25. Pertanto, assicurando variazioni sperimentali minima questi componenti è cruciale per generare coerenti, colture cellulari riproducibili.
Per la massima vitalità, le cellule devono essere seminate per la cultura entro 6 ore post mortem. Tuttavia, il cervello estratto può essere conservato temporaneamente in PBS a 4 ° C. Questa modifica può consentire l'isolamento di essere ritardata fino a 24 ore con una minima riduzione della resa delle cellule 26,27. Il fattore di crescita integrazione dei terreni di coltura può anche essere modificato per aumentare la proliferazione o per favorire la differentiation di specifici tipi di cellule neurali. Fattore di crescita insulino-simile 1 (a 100 ng / ml) ha mostrato di avere un effetto favorevole sulle cellule staminali roditore neurali in vitro 28,29, mentre sotto differenziazione condizioni fattore pro-neuronale BDNF 30 può essere utilizzato in combinazione con fattori tali come interleuchina 7 (a 500 ng / ml) o acido retinoico (a 0,1 pM) per indurre una polarizzazione verso sottotipo neuronale o differenziazione gliale 31,32.
La decisione di espandere le cellule precursori neurali come neurosfere galleggianti o come un monostrato aderente dipende in gran parte delle applicazioni a valle desiderati e le caratteristiche della cultura. Mentre il sistema di coltura neurosfere è semplicistico e altamente riproducibile, che è limitato nella sua capacità di generare popolazioni omogenee di cellule. Il microambiente complesso all'interno di ogni sfera può promuovere l'apoptosi e la differenziazione spontanea, favorendo una popolazione eterogenea 33, mentre repfusion orted di neurosfere che possono confondere quantificazione delle popolazioni di cellule precursori neurali 34. Inoltre, la dissociazione meccanica ripetuta richiesta per neurosfere passaggio può anche portare a stress dannoso, senescenza o addirittura la morte delle cellule. L'uso di enzimi di dissociazione alternative, come ad esempio la papaina, può influenzare la vitalità delle cellule risultante 16. Al contrario, il sistema di coltura monostrato aderente, con l'esposizione più uniforme a mitogeni ambientali, favorisce una maggiore omogeneità nel tipo di cellula e divisione più simmetrica. Questo sistema è stato dimostrato di produrre una nicchia frazione indipendente cellule, sulla base dell'espressione di marcatori di cellule staminali chiave 35,36. Questo sistema richiede l'utilizzo di recipienti di coltura pre-rivestiti di promuovere l'adesione cellulare. La scelta di substrato cultura dovrebbe essere considerato con attenzione, in quanto può avere effetti significativi sul profilo differenziazione dei precursori neuronali in coltura 25,37.
Here presentiamo protocolli efficaci per l'isolamento, espansione e la differenziazione delle cellule precursori adulte canine dell'ippocampo neurali dal tessuto post mortem fresco. Adulti precursori neurali canini sono sotto-rappresentate nella letteratura 18; con i protocolli completi per il loro isolamento e l'espansione, tanto meno 17. I nostri protocolli possono poi servire per aumentare la consapevolezza di questo modello animale prezioso e rappresentano una significativa aggiunta a questo modesto numero di studi. Di rilievo, con il nostro metodo unico, adulti canini precursori neurali dell'ippocampo può essere espansa con successo più di 10 raddoppi popolazione. Uno studio simile utilizzando adulto canino precursore neurale dell'ippocampo riferito che neurosfere più grandi, diversi passaggi a 100 - 150 micron di diametro, hanno cessato la proliferazione di là della quinta generazione 17. Come notato nel nostro protocollo, eccessiva crescita neurosfere può incoraggiare la differenziazione spontanea e apoptosi, che nel corso del passaggio di serie può avere lEd a questa ridotta capacità proliferativa. Forniamo anche un protocollo per espansione monostrato aderente di questa popolazione cellulare, in alternativa al sistema di espansione neurosfere classica 17-21. Questo sistema alternativo permette all'utente maggiore controllo sull'ambiente cellulare e amplia notevolmente la gamma di applicazioni a valle di queste cellule, con un potenziale di omogeneizzazione fenotipica e diretto differenziazione neuronale 35,38.
Colta adulti canini dell'ippocampo cellule precursori neurali hanno applicazioni in una vasta gamma di campi di ricerca cellulari e neurobiologici. Il cervello canino possiede una omologia più vicino al cervello umano di modelli di roditori esistenti. Come tale, adulti canini cellule precursori neurali rappresentano un importante, ma poco studiato, risorsa. Queste cellule possono essere utilizzati per ottenere ulteriori informazioni sui meccanismi che stanno dietro neurogenesi adulta negli esseri umani, e per lo sviluppo di terapie rigenerative che Target questo processo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 μl filtered pipette tip | Axygen | TF1000 | |
| 150 mm Petri dish | BD Biosciences | 351058 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 200 μl filtered pipette tip | Axygen | TF200 | |
| 24 well culture plate | Greiner Bio One | 662160 | |
| 35 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353001 | |
| 40 µm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 6 well culture plate | BD Biosciences | 351146 | |
| B-27 Supplement (50x) serum free | Life Technologies | 17504044 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | 13256029 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Millipore | GF029 | |
| Collagen solution | Stem Cell Technologies | 04902 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| DMEM (4.5 g/L, D-glucose) 500 ml | Life Technologies | 11960044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | BD Biosciences | 354001 | |
| F-12 nutrient mixture (Ham) (1x) Liquid | Life Technologies | 31765035 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 16141079 | |
| Gelatin from Porcine Skin Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide (GlutaMAX) | Life Technologies | 35050061 | |
| Heparin sodium salt from (porcine) | Sigma-Aldrich | H314950KU | |
| Laminin (mouse) | Life Technologies | 23017015 | |
| NCFC serum free medium (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5720 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| Proliferation NS-A (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 05773 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit Cat: 05740, and NS-A Prolieration Kit (Rat) Cat: 05771 from Stem Cell Technologies. |
| NSC basal medium (Rat; NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5770 | Also available in the Neurocult NS-A Prolieration Kit (Rat) from Stem Cell Technologies. Cat: 05771 |
| Penicillin/Streptomycin (5,000 U/ml) | Life Technologies | 15070063 | |
| Povidone-iodine | Munipharma | Betadine | |
| Trypan blue (0.4%) | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| Class II biological safety cabinet | ThermoFisher Scientific | Safe 2020 1.2 | |
| Brain knife (disposable) | Macroknife | ||
| Cell culture incubator | ThermoFisher Scientific | HERAcell 150i | |
| Centrifuge | Hettich | Universal 320R | |
| Dumont #5 Forceps | Dumont | ||
| Easypet Electric pipette | Eppindorf | ||
| Hemocytometer | Boeco | Bright-Line Improved Neubauer | |
| Manual pipettes | Eppindorf research | ||
| Oscillating bone saw | |||
| Scalpel blades (No.21) | Paramount | ||
| Scissors | Delta | ||
| Water bath | Grant | JB Aqua 18 plus |
References
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