Summary
الدماغ الكلاب هو نموذجا قيما للدراسة الخلايا العصبية الكبار. قدمت هنا بروتوكولات لعزل وتوسيع الكلاب الخلايا العصبية السلائف الحصين الكبار من أنسجة الدماغ الأولية.
Protocol
وفقا لنيو ساوث ويلز، أستراليا القانون، تم الحصول عليها بعد الأنسجة بعد الوفاة الدماغية من الكلاب الكبار الموت الرحيم لأسباب لا علاقة لها الدراسة.
1. إعداد الثقافة المتوسطة
- إعداد محلول الجيلاتين 0.1٪ وذلك بإضافة 0.1 غرام من مسحوق الجيلاتين إلى 100 مل من الماء المقطر وتهييج عند 37 درجة مئوية حتى يذوب. تعقيم الحل عن طريق الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة. هذه وسائل الاعلام ومن ثم يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر.
- إعداد 3: 1 نسبة من Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) والمغذيات F12 الخليط بإضافة 167 مل من F-12-500 مل من DMEM (4.5 جم / لتر مد الجلوكوز). إضافة 6.7 مل من محلول البنسلين / الستربتوميسين (لتركيز النهائي 1٪). هذه الوسائط يمكن تخزينها في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر.
- إعداد 500 مل من وسائل الاعلام المصل عن طريق الجمع بين 440 مل من DMEM (4.5 جم / لتر مد الجلوكوز)، 5 مل من L-ألانيل-L-الجلوتامين ثنائي الببتيد (200 ملم)، 5 مل من البنسلين / الستربتوميسين و 50 مل من بوفين الجنينالبريد المصل (FBS). هذه الوسائط يمكن تخزينها في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر.
- يتكون متوسطة النمو الكامل من العصبية الخلايا الجذعية (NSC) بصل متوسطة وانتشار العصبية الملحق-A (NS-A)، 2٪ FBS، 2 ميكروغرام / الهيبارين مل، 20 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF) و 10 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF). جعل هذه الوسائط طازجة، مباشرة قبل تشريح الدماغ، ودافئة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
2. الدماغ استخراج
- بدء استخراج ضمن 6 ساعات بعد الوفاة التي كتبها تعقيم السطح الظهري للرأس الكلب باستخدام بوفيدون اليود.
- باستخدام مشرط، وجعل شق طولي على طول خط الوسط سهمي، عبر السطح الظهري كامل من الجمجمة، لفضح العضلات الماضغة الكامنة. ويبلغ طول هذا الخفض تعتمد على الأنواع وعمر الكلب.
- في حدود منقاري والذيلية من الجمجمة، وجعل إضافية 5-10 سم تخفيضات عمودي على كلا الجانبين، وتمريرجي وراء العينين والأذنين على التوالي، للسماح للجلد إلى أن تنعكس بشكل كامل.
- باستخدام مشرط، فصل العضلات الماضغة من تمسكهم قمة السهمي من الجمجمة وتتخلص من أي نوع من الأنسجة الضامة المتبقية من الجمجمة.
- باستخدام العظام تتأرجح رأيت قطع غطاء الجمجمة في خط كفافي. باستخدام مسبار أو مشرط قطع أي مرفقات المتبقية مع الجافية، ثم إزالة بعناية غطاء الجمجمة لفضح السطح الظهري من المخ.
تحذير: سمك العظام يختلف في مناطق مختلفة في الجمجمة، لذلك يجب توخي الحذر لعدم اختراق عميق جدا وتلف الدماغ الكامنة. - قطع الحبل الشوكي عن طريق إدخال مشرط بين الفقرات العنقية العليا.
- مع يدا واحدة لرفع بلطف الدماغ، واستخدام مشرط لبعناية تحرير الدماغ من الجمجمة الحفرة وقطع الأعصاب التي تربط والأوعية الدموية الموجودة على جانبها بطني. رفع بلطف بالمطر من الجمجمة وفي وعاء من DPBS.
تحذير: إن بصيلات الشم كبيرة من الدماغ الكلاب قد تمتد في عمق الحفرة القحفية الأمامية. يجب توخي الحذر عند إزالة المخ وذلك للحفاظ على هذه الهياكل.
3. الحصين تشريح
- شطف الدماغ في الفوسفات مخزنة المالحة Dulbecco و(DPBS) لإزالة أي الدم ووضعه الجانب الظهري أسفل على 150 ملم طبق بيتري.
- ببطء شطر المخ طوليا من خلال طائرة منتصف السهمي باستخدام سكين الدماغ الرطب وشريحة واحدة أن يستخدم كامل طول النصل. لا الضغط النزولي إضافي، أو تستخدم حركة نشر، لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف الأنسجة.
- وضع كل وسطي نصف الكرة الأرضية السطحية تصل، تشريح خارج الحصين باستخدام مشرط وملقط غرامة، وتحويلها إلى طبق نسيج الثقافة 35 مم.
4. عزل الخلايا العصبية السلائف
- فرم رقضية العينات باستخدام شفرة مشرط إلى حوالي 1 ملم 3 قطع.
- نقل الأنسجة في أنبوب 15 مل، إضافة 2 مل من 0.1٪ التربسين EDTA، واحتضان لمدة 7 دقائق في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
- وقف رد فعل الانزيم بإضافة 4 مل من وسائل الاعلام المصل إلى الأنبوب. بيليه تعليق بواسطة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 7 دقائق وإزالة طاف.
- معلق بيليه في 300 ميكرولتر من DPBS، وفصلها ميكانيكيا بواسطة pipetting بلطف صعودا وهبوطا، وذلك باستخدام 1000 ميكرولتر ماصة، وحتى أشكال جناسة على نحو سلس.
- إضافة 14 مل من وسائل الاعلام المصل إلى أنبوب وتمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرون. بيليه تعليق بواسطة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 7 دقائق، وإزالة طاف، و resuspend في المتوسط النمو الكامل.
5. Neurosphere الثقافة
- من تعليق الخلية التي تم الحصول عليها في العزلة، والاعتماد على عدد من خلايا قابلة للحياة في استخدام استبعاد التريبان الأزرق صبغ والرئيسية hemoالكريات.
- تمييع تعليق خلية في متوسطة النمو الكامل والبذور على 1 × 10 5 خلية / سم 2 في الآبار غير المصقول من لوحة 6 جيدا.
- احتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 و> 95٪ الرطوبة ل14-28 يوما، استبدال 50٪ من وسائل الإعلام نمو كل 7 أيام. قياس قطر neurospheres بانتظام. إذا ما سمح لتنمو وراء 100 ميكرون في القطر، ويمكن أن يحدث موت الخلايا والتمايز عفوية داخل neurospheres.
6. Neurosphere المرور
- لمرور كثقافة العائمة، عندما تصل إلى neurospheres ما يقرب من 100 ميكرون في القطر، والجمع بين جميع وسائل الإعلام neurosphere تحتوي في أنبوب واحد. بيليه بواسطة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 7 دقائق وإزالة طاف.
- resuspend الكرية في 1 مل من 0.1٪ التربسين EDTA واحتضان لمدة 7 دقائق في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. ماصة بلطف صعودا وهبوطا 100 مرة، باستخدام 200 ميكرولتر ماصة، لضمان dissociatiعلى من neurospheres.
- وقف رد فعل الانزيم بإضافة 5 مل من وسائل الاعلام المصل إلى أنبوب وأجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 7 دقائق.
- إزالة طاف، resuspend الكرية خلية في 1 مل متوسطة النمو الكامل وحساب عدد خلايا قابلة للحياة باستخدام التريبان صبغة زرقاء الإقصاء وعدادة الكريات.
- تمييع تعليق خلية في متوسطة النمو الكامل والبذور على 1 × 10 5 خلية / سم 2 في الآبار غير المصقول من لوحة 6 جيدا. احتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 و> 95٪ الرطوبة ل14-28 يوما، ليحل محل 50٪ من وسائل الإعلام نمو كل 7 أيام.
7. تمسكا الثقافة من الخلايا العصبية السلائف
- إضافة كمية كافية من 0.1٪ محلول الجيلاتين لتغطية سطح طبق زراعة الأنسجة والعلاج في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة قبل معالجة neurospheres للثقافة ملتصقة.
- من ثقافة neurosphere العائمة، والجمع بين جميع وسائل الإعلام في أنبوب واحد. بيليه neurospheres بواسطة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 7 دقائق وإزالة طاف.
- resuspend الكرية في 1 مل من 0.1٪ التربسين EDTA واحتضان لمدة 7 دقائق في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. ماصة بلطف صعودا وهبوطا 100 مرة، باستخدام 200 ميكرولتر ماصة.
- إضافة 5 مل من وسائل الاعلام المصل لوقف رد فعل الإنزيم وأجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 7 دقائق. تجاهل طاف و resuspend بيليه خلية في 1 مل متوسطة النمو الكامل وحساب عدد خلايا قابلة للحياة باستخدام التريبان صبغة زرقاء الإقصاء وعدادة الكريات.
- تمييع تعليق خلية في متوسطة النمو الكامل، وإزالة الجيلاتين من قوارير زراعة الأنسجة والبذور الخلايا في 1 × 10 4 خلية / سم 2.
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 و> 95٪ الرطوبة. استبدال وسائل الإعلام مع، استعد، وسائط النمو كاملة جديدة كل ثلاثة أيام حتى تصل الثقافة حوالي 80٪ التقاء (بعد ما يقرب من 7 أيام).
8. Neurآل تشكيل مستعمرة الفحص
- الجمع بين العصبية تشكيل خلية مستعمرة مكونات وسائل الإعلام (NCFC) الفحص: NCFC المتوسطة مجانا المصل، انتشار NS-A، والحل الكولاجين (3 ملغ / مل). تكملة هذه الوسائط مع 2 ميكروغرام / مل الهيبارين، 20 نانوغرام / مل EGF، و 10 نانوغرام / مل bFGF.
- وفيما يلي تفكك الأنسجة قرن آمون resuspend الخلايا في مستعمرة العصبية تشكيل المتوسطة الفحص، قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. البذور الخلايا في مناطق ذات كثافة نسيلي من 1.1 × 10 5 خلية / مل في صحن الثقافة 35 مم.
- احتضان الخلايا في هذه المصفوفة الكولاجين شبه صلبة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 و> 95٪ الرطوبة. الثقافة لمدة 28 يوما، ليحل محل 50٪ من وسائل الإعلام نمو كل 7 أيام.
9. تمايز الخلايا العصبية السلائف
- إضافة كمية كافية من 5 ميكروغرام / سم 2 حل laminin لتغطية سطح طبق زراعة الأنسجة والعلاج في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة قبل معالجة الخلايا للفارقنشوئها.
ملاحظة: إزالة حل laminin وشطف السطح المطلي مرتين في DPBS مباشرة قبل البذر. - عندما الركض، البذور تعليق خلية في 1 × 10 4 خلية / سم 2 في DMEM-F12 (3: 1) وسائل الاعلام (قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية) تستكمل مع 20 نانوغرام / مل EGF و 40 نانوغرام / مل bFGF على laminin المغلفة صحن الثقافة.
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 و> 95٪ الرطوبة وتسمح للخلايا لتتكاثر لمدة 3 أيام.
- التفريق بين الخلايا العصبية السلائف ملتصقة، بعد 3 أيام استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام التمايز التي تحتوي على DMEM-F12 (3: 1) وسائل الاعلام قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية، على أن تستكمل مع 10 نانوغرام / مل الدماغ المستمدة عامل التغذية العصبية (BDNF).
- خلال التمايز استبدال 50٪ من وسائل الاعلام كل 3 أيام. يحدث التمايز تدريجيا على مدى ما يقرب من 21 - 28 يوما.
تحذير: عندما بدأت الخلايا للتمييز، استبدال فقط 50٪ من وسائل الإعلام في منظمة الشفافية الدولية واحدةلي والتعرض للهواء يمكن أن يكون لها تأثير ضار على صحة الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
من خلال استخدام في المختبر العصبية السلائف المقايسات، تكوين الخلايا العصبية والعصبية السكان الخلية تمهيدا تميزت ومقارنة عبر محور ظهري بطني من الكبار الحصين الكلاب. الخلايا العصبية السلائف المستمدة من الأنسجة قرن آمون معزولة شكلت يتحرك neurospheres في غضون 14 يوما من العزلة، وبلغ قطرها 100 ميكرون من قبل 28 يوما من الثقافة. أظهر Neurospheres المستمدة من ظهري وبطني العزلات لا فرق في متوسط حجم، وبعد تفكك الأنزيمية في خلايا واحدة، يمكن passaged عائمة الثقافات neurosphere. كانت neurospheres العائمة الثانوي من المنطقتين الحصين قادرة على تشكيل ضمن 5 أيام من مرور. عندما المصنف في 1 × 10 4 خلية / سم 2 على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة قوارير الثقافة، وكانت الخلايا العصبية السلائف قادرة على التكاثر الطبقات الوحيدة كما ملتصقة (الشكل 1A) أيضا. ويلاحظ وجود اختلافات شكلية بين هذا وذاكن كان ظهري والخلايا العصبية السلائف الحصين بطني والثقافتين ملتصقة قادرا على الخضوع أكثر من 10 الأضعاف السكان دون أي رصدها وهى تباطؤ في مرور الوقت (الشكل 1B). كان Nestin وSox2 التعبير العصبي الجيني للخلايا الجذعية في ثقافة ملتصقة لا تختلف كثيرا عبر محور ظهري بطني قرن آمون (الشكل 2). توصيف أكثر اتساعا من الجينات والبروتين، مما يؤكد هوية العصبية السلائف من هذه الخلايا، يتم عرضها في بياناتنا المنشورة 7.
باستخدام تكييفها العصبية تشكيل مستعمرة الفحص 4،6 قمنا بتقييم العصبية السلائف تردد خلية من أجل تحديد الاختلافات المحتملة في السكان الخلية العصبية السلائف عبر ظهري وبطني الفرعية للقرن آمون الكلاب. كانت المصنفة الخلايا في كثافة نسيلي في شبه الصلبة مصفوفة الكولاجين التي تحول دون اندماج الخلايا، وتربيتها لمدة 28 يوما (الشكل 3A F = 96.8؛ P = 0.001؛ الشكل 3B ).
في ظل ظروف التمايز، وأظهرت ملتصقة الخلايا العصبية السلائف الكلاب التعديلات التقدمية في التشكل الإجمالي، وتطوير أطول وعمليات أكثر تفصيلا. زادت علامات أيضا التالية التمايز (الشكل 4)؛ بروتين تعبير عن العصبية (βIII تويولين) والدبقية (GFAP الدبقية ييفي البروتين الحمضية). لا يوجد فرق كبير لوحظ في عدد من الخلايا المسمى إيجابي بين ظهري وبطني العزلات. لدينا البيانات المنشورة سابقا صحه هذه التغييرات تعبير البروتين، مما يدل على ما يصل تنظيم الجينات المرتبطة بها جنبا إلى جنب مع التنظيم لأسفل من العصبية الجينات السلائف خلال الفترة التمايز 28 يوم 7.
يتم توسيع في المختبر توسيع خلايا الكبار الناب الحصين العصبية السلائف الكبار الكلاب الحصين الخلايا العصبية السلائف معزولة عن ظهري والمناطق الحصين بطني كما (A) neurospheres العائمة أو (ب) أحادي الطبقة ملتصقة (C) باعتبارها: الشكل 1. أحادي الطبقة ملتصقة هذه الخلايا العصبية السلائف يمكن أن تخضع لمرور أكثر من 10 مرات دون انخفاض كبير في مضاعفة سرعة. ن = 5؛ مقياس = 50 ميكرون. تعديل من الرقم المنشور 7. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
/ftp_upload/54953/54953fig2.jpg "/>
الشكل 2: التعبير الجيني في الخلايا المتكاثرة الكبار الناب الحصين العصبية السلائف التعبير عن جينات الخلايا الجذعية العصبية (A) Nestin وأكد (B) Sox2 في الخلايا قرن آمون الكلاب الكبار العصبية السلائف في ظل ظروف ثقافة التكاثري ملتصقة. كان التعبير عن هذه الجينات ما يعادلها في كل من ظهري وخلايا قرن آمون المستمدة البطنية. استخدمت الخلايا الليفية الكلاب الكبار كخط التحكم لمقارنة الاختلافات في التعبير الجيني النسبي. ن = 5؛ أشرطة الخطأ = SEM. تعديل من الرقم المنشور 7. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): العصبية تشكيل مستعمرة الفحص (A)الكبار الكلاب الخلايا العصبية السلائف المصنفة في كثافة نسيلي في مصفوفة الكولاجين شبه صلبة، neurospheres النموذج في غضون 28 يوما من الثقافة. (ب) الخلايا الطليعية العصبية مشتقة من الحصين الظهرية توليد أعداد أكبر بكثير من neurospheres في وحدة المساحة من تلك المستمدة من الحصين بطني. ن = 5؛ أشرطة الخطأ = SEM. مقياس = 50 ميكرون. تعديل من الرقم المنشور 7. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4: سيتولوجية مناعية للخلايا متباينة الكبار الناب الحصين العصبية السلائف عندما مثقف في عامل التغذية العصبية لمدة 28 يوما، والكبار الكلاب السلائف العصبية من كل من ظهري وبطني الحصين تفرق في الخلايا العصبية الناضجة (ص βIII تويولينsitive) والدبقية (أنواع الخلايا إيجابية) GFAP. ن = 5؛ مقياس = 50 ميكرون. تعديل من الرقم المنشور 7. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتم تحسين البروتوكولات المذكورة هنا للحفاظ على ظروف ثقافة مواتية لتحقيق أقصى قدر من بقاء الخلية. السرعة والحرص أثناء استخراج والعزلة والتوسع ذات أهمية حاسمة. خطوة مهمة لإقامة التوسع أحادي الطبقة ملتصقة هي التفكك الفعلي لneurospheres الأساسي. وبعد مرور، فصل كاف neurospheres قد تولد neurospheres العائمة الثانوي. خلال تغيير وسائل الإعلام، قد تتم إزالة هذه neurospheres، فصلها وreseeded للمرور أحادي الطبقة ملتصقة. على العكس من ذلك، إذا بقاء الخلية بعد تفكك أقل من 80٪، وهذا قد يكون مؤشرا على pipetting لالمفرط أثناء التفكك. الخلايا العصبية السلائف، وبخاصة نظرائهم متباينة، حساسة للتغيرات في درجة الحموضة خارج نطاق الفسيولوجية، والتعرض للهواء. مراقبة المفاجئ موت الخلايا على نطاق واسع قد يعزى إلى هذه العوامل. ونتيجة لذلك، خطوة حاسمة خلال وسائل الإعلام تشانغيس هو قيام وسائل الإعلام أن تكون جديدة في كل مرة، وفقط 50٪ من حجم لاستبداله. وأخيرا، في حين دعم عوامل مولد للتفتل EGF وbFGF بقاء وانتشار السلائف العصبية قرن آمون في ظروف خالية من المصل في المختبر 22،23، الاستجابة الخلوية لهذه mitogens تعتمد بشكل كبير على عمر التنموي الخلية وتركيز مولد للتفتل 24،25. وبالتالي، ضمان تباين تجريبي في الحد الأدنى من هذه المكونات هو أمر حاسم لتوليد متسقة، مزارع الخلايا استنساخه.
لأقصى قدر من الجدوى، ينبغي المصنف خلايا للثقافة في غضون 6 ساعات بعد الوفاة. ومع ذلك، قد يتم تخزين الدماغ استخراج مؤقتا في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية. هذا التعديل قد تسمح لعزل ليتأخر بنسبة تصل إلى 24 ساعة بأقل تأثير على 26،27 العائد الخلية. عامل النمو مكملات من وسائل الإعلام الثقافة ويمكن أيضا أن يتم تعديل لتعزيز انتشار أو لتشجيع احntiation من أنواع الخلايا العصبية المحددة. الذي يشبه الانسولين عامل النمو 1 (في 100 نانوغرام / مل) وقد تبين أن يكون لها تأثير على خلايا داعمة القوارض العصبية الجذعية في المختبر 28،29، بينما ظل التمايز الظروف عامل الموالية للالخلايا العصبية BDNF 30 يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع عوامل مثل كما انترلوكين 7 (في 500 نانوغرام / مل) أو حامض الريتينويك (عند 0.1 ميكرومتر) للحث على التحيز لسلالة الخلايا العصبية أو التمايز الدبقية 31،32.
قرار بشأن ما إذا كان لتوسيع الخلايا العصبية السلائف كما neurospheres العائمة أو في شكل أحادي الطبقة ملتصقة يعتمد إلى حد كبير على التطبيقات المصب المطلوب وخصائص الثقافة. في حين أن النظام الثقافة neurosphere هو التبسيط وتكرار للغاية، هي محدودة في قدرتها على توليد السكان متجانسة من الخلايا. المكروية المعقدة داخل كل مجال يمكن أن تعزز الخلايا والتمايز عفوية، تشجيع السكان غير متجانسة 33، في حين أن مندوبالانصهار orted من neurospheres التي يمكن أن نخلط الكمي للسكان الخلية العصبية السلائف 34. وعلاوة على ذلك، فإن تفكك الميكانيكية المتكررة اللازمة لneurosphere مرور قد يؤدي أيضا إلى الإجهاد الضار، الشيخوخة أو حتى موت الخلية. استخدام انزيم تفارق البديلة، مثل غراء، قد تؤثر على الخلايا الحيوية الناتجة 16. على العكس من ذلك، فإن النظام الثقافة أحادي الطبقة ملتصقة، مع التعرض أكثر اتساقا لmitogens البيئية، وتشجع على مزيد من التجانس في نوع من الخلايا والانقسام أكثر متناظرة. وقد تبين هذا النظام لإنتاج مكانة السكان مستقل من الخلايا، على أساس التعبير عن علامات الخلايا الجذعية الرئيسية 35،36. يتطلب هذا النظام استخدام السفن ثقافة ما قبل المغلفة لتشجيع الانضمام الخلوي. اختيار الركيزة ثقافة يجب أن تدرس بعناية، لأنها قد يكون لها آثار كبيرة على البيانات الشخصية تمايز السلائف العصبية مثقف 25،37.
Hيحرث نقدم بروتوكولات فعالة لعزل والتوسع وتمايز الخلايا الكلاب الكبار قرن آمون العصبية السلائف من جديدة الأنسجة بعد الوفاة. السلائف العصبية الكلاب الكبار وتحت ممثلة في الأدب 18. مع بروتوكولات كاملة لعزلتهم والتوسع، حتى أقل من ذلك (17). قد بروتوكولات لدينا بعد ذلك تعمل على زيادة الوعي من هذا النموذج الحيواني قيمة وتمثل إضافة مهمة إلى هذا العدد المتواضع من الدراسات. من الأهمية، وذلك باستخدام طريقة فريدة من نوعها لدينا، الكبار الكلاب السلائف العصبية قرن آمون ويمكن توسيع بنجاح أكثر من 10 الأضعاف السكان. أفادت دراسة مماثلة باستخدام الكبار الكلاب السلائف العصبية الحصين أن neurospheres أكبر، passaged في 100-150 ميكرون في القطر، وتوقف انتشار ما وراء الجيل الخامس (17). كما لوحظ في بروتوكول لدينا، يمكن للنمو neurosphere المفرط تشجيع التمايز عفوية وموت الخلايا المبرمج، الذي عبر مرور التسلسلي قد يكون لإد إلى هذا انخفاض القدرة التكاثري. ونحن نقدم أيضا على بروتوكول للتوسع أحادي الطبقة ملتصقة من هذه الفئة من السكان الخلية، كبديل لنظام التوسع neurosphere الكلاسيكية 17-21. هذا نظام بديل يتيح للمستخدم المزيد من السيطرة على البيئة الخلوية، ويوسع بشكل كبير من مجموعة من التطبيقات المصب لهذه الخلايا، مع إمكانية التجانس المظهري وإخراج تمايز الخلايا العصبية 35،38.
الكبار مثقف الكلاب الخلايا العصبية السلائف الحصين لها تطبيقات عبر مجموعة واسعة من المجالات البحثية الخلوية والعصبية. الدماغ الكلاب تمتلك تناظر أقرب إلى العقل البشري من نماذج القوارض الموجودة. على هذا النحو، والكبار الكلاب الخلايا العصبية السلائف تمثل المهم، بعد دراسة سلوكه، والموارد. ويمكن استخدام هذه الخلايا لاكتساب مزيد من التبصر في الآليات وراء تكوين الخلايا العصبية الكبار في البشر، ولتطوير علاجات التجدد التي TARGآخرون هذه العملية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 μl filtered pipette tip | Axygen | TF1000 | |
| 150 mm Petri dish | BD Biosciences | 351058 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 200 μl filtered pipette tip | Axygen | TF200 | |
| 24 well culture plate | Greiner Bio One | 662160 | |
| 35 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353001 | |
| 40 µm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 6 well culture plate | BD Biosciences | 351146 | |
| B-27 Supplement (50x) serum free | Life Technologies | 17504044 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | 13256029 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Millipore | GF029 | |
| Collagen solution | Stem Cell Technologies | 04902 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| DMEM (4.5 g/L, D-glucose) 500 ml | Life Technologies | 11960044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | BD Biosciences | 354001 | |
| F-12 nutrient mixture (Ham) (1x) Liquid | Life Technologies | 31765035 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 16141079 | |
| Gelatin from Porcine Skin Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide (GlutaMAX) | Life Technologies | 35050061 | |
| Heparin sodium salt from (porcine) | Sigma-Aldrich | H314950KU | |
| Laminin (mouse) | Life Technologies | 23017015 | |
| NCFC serum free medium (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5720 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| Proliferation NS-A (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 05773 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit Cat: 05740, and NS-A Prolieration Kit (Rat) Cat: 05771 from Stem Cell Technologies. |
| NSC basal medium (Rat; NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5770 | Also available in the Neurocult NS-A Prolieration Kit (Rat) from Stem Cell Technologies. Cat: 05771 |
| Penicillin/Streptomycin (5,000 U/ml) | Life Technologies | 15070063 | |
| Povidone-iodine | Munipharma | Betadine | |
| Trypan blue (0.4%) | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| Class II biological safety cabinet | ThermoFisher Scientific | Safe 2020 1.2 | |
| Brain knife (disposable) | Macroknife | ||
| Cell culture incubator | ThermoFisher Scientific | HERAcell 150i | |
| Centrifuge | Hettich | Universal 320R | |
| Dumont #5 Forceps | Dumont | ||
| Easypet Electric pipette | Eppindorf | ||
| Hemocytometer | Boeco | Bright-Line Improved Neubauer | |
| Manual pipettes | Eppindorf research | ||
| Oscillating bone saw | |||
| Scalpel blades (No.21) | Paramount | ||
| Scissors | Delta | ||
| Water bath | Grant | JB Aqua 18 plus |
References
- Kheirbek, M. A., Hen, R. Dorsal vs ventral hippocampal neurogenesis: implications for cognition and mood. Neuropharmacol. 36 (1), 373 (2011).
- Tanti, A., Rainer, Q., Minier, F., Surget, A., Belzung, C. Differential environmental regulation of neurogenesis along the septo-temporal axis of the hippocampus. Neuropharmacol. 63 (3), 374-384 (2012).
- Eriksson, P. S., et al.
- Bull, N. D., Bartlett, P. F. The adult mouse hippocampal progenitor is neurogenic but not a stem cell. J Neurosci. 25 (47), 10815-10821 (2005).
- Kempermann, G., et al. Why and how physical activity promotes experience-induced brain plasticity. Front Neurosci. 4 (189), 1-9 (2010).
- Golmohammadi, M. G., et al. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26 (4), 979-987 (2008).
- Lowe, A., et al. Neurogenesis and precursor cell differences in the dorsal and ventral adult canine hippocampus. Neurosc. Lett. 593, 107-113 (2015).
- Sasaki, M., et al. MRI identification of dorsal hippocampus homologue in human brain. Neuroreport. 15 (14), 2173-2176 (2004).
- Powell, E. W., Hines, G. The Hippocampus. , Springer. 41-59 (1975).
- Jung, M. -A., et al. Canine hippocampal formation composited into three-dimensional structure using MPRAGE. J Vet Med Sci. 72 (7), 853-860 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Ray, J., Raymon, H. K., Gage, F. H. Generation and culturing of precursor cells and neuroblasts from embryonic and adult central nervous system. Methods Enzymol. 254, 20-37 (1995).
- Oliver-Dela Cruz, J., Ayuso-Sacido, A. Neural stem cells from mammalian brain: isolation protocols and maintenance conditions. INTECH Open Access Publisher. , (2012).
- Pacey, L., Stead, S., Gleave, J., Tomczyk, K., Doering, L. Neural stem cell culture: neurosphere generation, microscopical analysis and cryopreservation. Nat Protoc. , (2006).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), e2393 (2010).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225 (2014).
- Lim, J. -H., Koh, S., Olby, N. J., Piedrahita, J., Mariani, C. L. Isolation and characterization of neural progenitor cells from adult canine brains. Am J Vet Res. 73 (12), 1963-1968 (2012).
- Herranz, C., et al. Spontaneously Arising Canine Glioma as a Potential Model for Human Glioma. J Comp Pathol. 154 (2), 169-179 (2016).
- Walton, R. M., Parmentier, T., Wolfe, J. H. Postnatal neural precursor cell regions in the rostral subventricular zone, hippocampal subgranular zone and cerebellum of the dog (Canis lupus familiaris). Histochem Cell Biol. 139 (3), 415-429 (2013).
- Walton, R. M., Wolfe, J. H. Abnormalities in neural progenitor cells in a dog model of lysosomal storage disease. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (8), 760-769 (2007).
- Milward, E. A., et al. Isolation and transplantation of multipotential populations of epidermal growth factor-responsive, neural progenitor cells from the canine brain. J Neurosci Res. 50 (5), 862-871 (1997).
- Ray, J., Peterson, D. A., Schinstine, M., Gage, F. H. Proliferation, differentiation, and long-term culture of primary hippocampal neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. 90 (8), 3602-3606 (1993).
- Palmer, T., Ray, J., Gage, F. FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain. Mol Cell Neurosci. 6 (5), 474-486 (1995).
- Zhu, G., Mehler, M., Mabie, P., Kessler, J. Developmental changes in progenitor cell responsiveness to cytokines. J. Neurosci. Res. 56 (2), 131-145 (1999).
- Whittemore, S. R., Morassutti, D. J., Walters, W. M., Liu, R. -H., Magnuson, D. S. Mitogen and substrate differentially affect the lineage restriction of adult rat subventricular zone neural precursor cell populations. Exp. Cell. Res. 252 (1), 75-95 (1999).
- Kennedy, P. Postmortem survival characteristics of rat glial cells in culture. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 50 (6), 798-800 (1987).
- Viel, J. J., McManus, D. Q., Cady, C., Evans, M. S., Brewer, G. J. Temperature and time interval for culture of postmortem neurons from adult rat cortex. J. Neurosci. Res. 64 (4), 311-321 (2001).
- Huat, T. J., et al. IGF-1 enhances cell proliferation and survival during early differentiation of mesenchymal stem cells to neural progenitor-like cells. BMC Neurosci. 15 (91), 1-13 (2014).
- Supeno, N. E., et al. IGF-1 acts as controlling switch for long-term proliferation and maintenance of EGF/FGF-responsive striatal neural stem cells. Int. J. Med. Sci. 10 (5), 522-531 (2013).
- Ahmed, S., Reynolds, B. A., Weiss, S. BDNF enhances the differentiation but not the survival of CNS stem cell-derived neuronal precursors. J Neurosci. 15 (8), 5765-5778 (1995).
- Wohl, C. A., Weiss, S. Retinoic acid enhances neuronal proliferation and astroglial differentiation in cultures of CNS stem cell-derived precursors. J Neurobiol. 37 (2), 281-290 (1998).
- Araujo, D. M., Cotman, C. W. Trophic effects of interleukin-4,-7 and-8 on hippocampal neuronal cultures: potential involvement of glial-derived factors. Brain Res. 600 (1), 49-55 (1993).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3 (10), 801-806 (2006).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3 (9), 283 (2005).
- Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, Suppl 1 112-120 (2006).
- Ma, W., et al. Cell-extracellular matrix interactions regulate neural differentiation of human embryonic stem cells. BMC Dev Biol. 8 (90), 1-13 (2008).
- Goffredo, D., et al. Setting the conditions for efficient, robust and reproducible generation of functionally active neurons from adult subventricular zone-derived neural stem cells. Cell Death Differ. 15 (12), 1847-1856 (2008).
