Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.
apoptosis से मर कोशिकाओं के रूप में भी विनियमित कोशिका मृत्यु के लिए भेजा है, कई नई गतिविधियों है कि उन्हें आसन्न जीवित कोशिकाओं के समारोह को प्रभावित करने में सक्षम अधिग्रहण। इस तरह के अस्तित्व, प्रसार, विकास, और भेदभाव के रूप में महत्वपूर्ण गतिविधियों, apoptotic कोशिकाओं द्वारा संग्राहक कई सेलुलर कार्यों में से एक हैं। समझते हैं और apoptotic कोशिकाओं के लिए प्रतिक्रिया करने की क्षमता वंश या व्युत्पत्ति के अंग की परवाह किए बिना, सभी कोशिकाओं की एक सार्वभौमिक सुविधा प्रतीत होता है। हालांकि, विविधता और उस महान देखभाल के संकेत घटनाओं और रास्ते किसी विशेष परिणाम के लिए जिम्मेदार विदारक में लिया जाना apoptotic कोशिकाओं जनादेश के जवाब की जटिलता। विशेष रूप से, एक कई तंत्र है जिसके द्वारा apoptotic कोशिकाओं व्यवहार्य प्रत्युत्तर कोशिकाओं के भीतर intracellular संकेत दे रास्ते प्रभावित कर सकते हैं, सहित के बीच अंतर करना चाहिए: apoptotic सेल के रिसेप्टर की मध्यस्थता मान्यता, apoptotic सेल द्वारा घुलनशील मध्यस्थों की रिहाई, और / या सगाई की फागोcytic मशीनरी। यहाँ, हम intracellular संकेत घटनाओं है कि व्यवहार्य प्रत्युत्तर कोशिकाओं में apoptotic कोशिकाओं के लिए अपने जोखिम निम्नलिखित प्रेरित कर रहे हैं की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। प्रोटोकॉल का एक प्रमुख लाभ यह ध्यान व्यवस्था है जिसके द्वारा apoptotic कोशिकाओं जवाब कोशिकाओं के भीतर की घटनाओं का संकेत मिलाना के विच्छेदन के लिए भुगतान करता है में निहित है। जबकि प्रोटोकॉल एक सशर्त अमर माउस गुर्दे समीपस्थ ट्यूबलर सेल लाइन (BU.MPT कोशिकाओं) के लिए विशिष्ट है, यह आसानी से सेल लाइनों है कि मूल में गैर उपकला और / या गुर्दे के अलावा अन्य अंगों से निकाली गई हैं के लिए अनुकूल है। एक प्रोत्साहन के रूप में मृत कोशिकाओं के उपयोग के कई अनूठी कारक है कि intracellular संकेत घटनाओं का पता लगाने में बाधा कर सकते हैं परिचय। इन समस्याओं के साथ-साथ रणनीतियों को कम करने या उन्हें नाकाम करने के लिए, प्रोटोकॉल के भीतर चर्चा कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल के आवेदन दोनों के स्वास्थ्य में और disea में व्यापक प्रभाव है कि मृत या मर कोशिकाओं उनके रहते पड़ोसियों पर डालती है की हमारी विस्तार ज्ञान सहायता करनी चाहिएएसई।
Apoptosis, या विनियमित कोशिका मृत्यु 1, ऊतकों के रखरखाव और विकास के लिए एक आवश्यक ढंग से योगदान देता है। सबसे बस देखा, apoptosis परमिट, आयु वर्ग के क्षतिग्रस्त, या अतिरिक्त कोशिकाओं के आसपास के ऊतकों 2,3 लिए नुकसान के बिना समाप्त किया जा सके। ऊतक homeostasis को apoptosis के योगदान है, तथापि, काफी अधिक गतिशील और विविध है। Apoptosis से मर कोशिकाओं कई नई गतिविधियों के अधिग्रहण, दोनों स्रावित और सेल जुड़े है, जो उन्हें आसन्न जीवित कोशिकाओं 4-10 के समारोह को प्रभावित करने के लिए सक्षम है। इससे पहले apoptotic कोशिकाओं की क्षमता सूजन 11-16 को दबाने के लिए पर ध्यान केंद्रित अध्ययन, लेकिन apoptotic कोशिकाओं को भी, अस्तित्व 4,9,10, प्रसार 4,9,10, भेदभाव 17 के रूप में इस तरह के महत्वपूर्ण गतिविधियों सहित सेलुलर कार्यों की एक व्यापक रेंज मिलाना पलायन 18, और विकास के 19। इसके अलावा, इन प्रभावों, पेशेवर फ़ैगोसाइट करने के लिए ही सीमित नहीं हैं बृहतभक्षककोशिका की तरहएस, लेकिन लगभग सभी प्रकार के और प्रजातियों, इस तरह के उपकला और endothelial कोशिकाओं 7,9,10,18-21 के रूप में पारंपरिक रूप से गैर-phagocytic कोशिकाओं, सहित सेल के लिए करता हूं।
apoptotic कोशिकाओं को प्रदर्शन के बाद आसन्न जीवित कोशिकाओं के विशिष्ट प्रतिक्रिया के लिए कई कारक है कि दोनों व्यवहार्य जवाब कोशिकाओं और apoptotic कोशिकाओं को खुद से संबंधित पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, हालांकि apoptotic कोशिकाओं के लिए जोखिम दोनों murine मैक्रोफेज और गुर्दे समीपस्थ ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं (PTECs) के प्रसार को रोकता है, इन दो प्रकार की कोशिकाओं में नाटकीय रूप apoptotic कोशिकाओं 4,6,9,10 को अपने अस्तित्व के जवाब में भिन्न होते हैं। Apoptotic कोशिकाओं मैक्रोफेज के अस्तित्व को बढ़ावा देने, लेकिन PTECs 4,6,9,10 की apoptotic मौत प्रेरित। विशेष रूप से, apoptotic कोशिकाओं की प्रतिक्रिया, एक ही वंश की कोशिकाओं जवाब उत्पत्ति 10 (जैसे, स्तन उपकला बनाम गुर्दे PTECs का जवाब सेल के अंग पर निर्भर करता है के बीच भी अलग हो सकता हैकोशिकाओं) या सक्रियण के राज्य 22 (जैसे, न्यूट्रोफिल)। इसके विपरीत, apoptotic कोशिकाओं 10,23 या apoptosis 10,14 के मंच प्रोत्साहन apoptotic की प्रकृति पर निर्भर करता है बहुत ही सेल में अलग-अलग प्रतिक्रियाओं का आह्वान कर सकते हैं।
diverseness और apoptotic कोशिकाओं की प्रतिक्रिया की जटिलता को देखते हुए, महान देखभाल के संकेत घटनाओं और रास्ते किसी विशेष परिणाम के लिए जिम्मेदार विदारक में लिया जाना चाहिए। सबसे पहले, व्यवहार्य और apoptotic कोशिकाओं के बीच प्रत्यक्ष शारीरिक बातचीत की आवश्यकता प्रतिक्रियाएं जारी या apoptotic सेल 3,6-10 द्वारा उत्पन्न घुलनशील मध्यस्थों द्वारा हासिल उन से भेदभाव किया जाना चाहिए। शारीरिक संपर्क की आवश्यकता है, तो एक और भेदभाव किया जाना चाहिए। संकेत घटनाओं apoptotic सेल, बाद घिराव के स्वतंत्र, या phagocytic तेज पर, विशिष्ट रिसेप्टर के स्वतंत्र है कि apoptotic सेल बांधता के रिसेप्टर की मध्यस्थता मान्यता पर निर्भर हो सकता है 3-7,9,10,19। उदाहरण के उत्तरार्द्ध में, प्रतिक्रिया apoptotic कोशिकाओं के लिए विशिष्ट नहीं है, और किसी भी phagocytic सामग्री 4,6 से शुरू हो सकता है।
इन भेद के महत्व को फिर से मैक्रोफेज और गुर्दे PTECs की प्रतिक्रियाओं विषम द्वारा सराहना की जा सकती है। दोनों प्रकार की कोशिकाओं के लिए, apoptotic कोशिकाओं के लिए जोखिम समर्थक अस्तित्व काइनेज Akt की गतिविधि को बदल। मॉड्यूलेशन शारीरिक बातचीत पर निर्भर है, और एक 0.4 माइक्रोन पॉली कार्बोनेट झिल्ली द्वारा apoptotic कोशिकाओं जवाब की जुदाई के बाद प्रतिक्रिया 4,9,10,19 समाप्त करता है। हालांकि, PTECs की प्रतिक्रिया जबकि मैक्रोफेज की प्रतिक्रिया phagocytosis 4,9,10,19 द्वारा संचालित है, रिसेप्टर की मध्यस्थता और phagocytosis से स्वतंत्र है। यह निष्कर्ष इस तथ्य लेटेक्स मोती, एक तटस्थ phagocytic प्रोत्साहन, के लिए जोखिम PTECs में Akt गतिविधि पर कोई प्रभाव नहीं है, लेकिन mimics मैक्रोफेज 4,9 में apoptotic कोशिकाओं का असर है कि द्वारा प्रबलित है।
"कम अच्छी तरह से अध्ययन> हालांकि, गल जाना, या आकस्मिक कोशिका मृत्यु 1 से मर कोशिकाओं भी पास व्यवहार्य कोशिकाओं के समारोह 3-10,19 मिलाना। Apoptotic कोशिकाओं की तरह, परिगलित कोशिकाओं तंत्र की एक किस्म है, विशेष रूप से रिसाव के माध्यम से अपने प्रभाव डालती PTECs और मैक्रोफेज सहित कई कोशिकाओं, उनके उठी कोशिका झिल्ली 3,5,6,9,24 के माध्यम से intracellular सामग्री के।, कोशिकाओं नेक्रोसिस 5.9 से मरने के लिए अलग-अलग गैर प्रतिस्पर्धा रिसेप्टर्स के पास है। इन रिसेप्टर्स की सगाई संकेत घटनाओं हैं कि लाती है अक्सर apoptotic कोशिकाओं 4-10,19 के लिए रिसेप्टर्स की सगाई से प्रेरित उन लोगों के लिए विपरीत है। उदाहरण के लिए, PTECs में, परिगलित कोशिकाओं Akt के फोस्फोराइलेशन, जबकि बढ़ाने apoptotic कोशिकाओं फोस्फोराइलेशन 9,10,19 कमी।यहाँ, हम intracellular संकेत घटनाओं आसन्न apoptotic PTECs के रिसेप्टर की मध्यस्थता मान्यता के माध्यम से व्यवहार्य गुर्दे PTECs में प्रेरित पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन <sup> 9,10,19। जबकि प्रोटोकॉल एक सशर्त अमर PTEC सेल BU.MPT कोशिकाओं 9,10,19,25,26 रूप में जाना जाता लाइन के लिए विशिष्ट है, यह आसानी से सेल लाइनों है कि मूल में गैर उपकला और / या के अलावा अन्य अंगों से निकाली गई हैं के लिए अनुकूल है गुर्दे की। महत्वपूर्ण बात है, एक सेल प्रोत्साहन के रूप में apoptotic कोशिकाओं के उपयोग के कुछ निहित प्रयोगात्मक कठिनाइयों घुलनशील ligands के साथ मौजूद नहीं बन गया है। इनमें से सबसे महत्वपूर्ण है कि apoptotic कोशिकाओं एक निलंबन के रूप में नहीं बल्कि एक समाधान के रूप में जोड़ा जाना चाहिए। इन कठिनाइयों, साथ ही रणनीतियों को कम करने या उन्हें नाकाम करने के लिए, प्रोटोकॉल के भीतर चर्चा कर रहे हैं। लगभग तकनीक प्रोटोकॉल में वर्णित के सभी सीधा और सेल संस्कृति के लिए मानक हैं। इस प्रोटोकॉल का लाभ कई तंत्र है जिसके द्वारा apoptotic कोशिकाओं कोशिकाओं के भीतर जवाब संकेत पारगमन मिलाना पर अपना ध्यान में निहित है। ये तंत्र सतह निर्धारकों के माध्यम से बाध्यकारी या फिर पर विशिष्ट रिसेप्टर्स करने के अणुओं को पाटने में शामिलsponding सेल, घुलनशील मध्यस्थों की रिहाई, और / या phagocytic मशीनरी की सगाई की। परिगलित कोशिकाओं सभी प्रयोगों में शामिल हैं सुनिश्चित करने के लिए है कि परिणाम कोशिका मृत्यु की विधा है, और न मृत कोशिकाओं के लिए एक सामान्यीकृत प्रतिक्रिया के लिए विशिष्ट हैं। एक सावधान दृष्टिकोण, के रूप में इस प्रोटोकॉल में सिफारिश की है, कभी विस्तार प्रभाव है कि मर कोशिकाओं उनके रहते पड़ोसियों पर डालती है, दोनों के स्वास्थ्य और रोग में की हमारी समझ के लिए महत्वपूर्ण है।
हम यहाँ apoptosis, या कोशिका मृत्यु के अन्य रूपों के दौर से गुजर कोशिकाओं को उनके प्रदर्शन के बाद intracellular संकेत घटनाओं व्यवहार्य कोशिकाओं में प्रेरित निस्र्पक के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। प्रोटोकॉल क?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported, in whole or in part, by institutional funds from Dr. José A. Arruda and the Section of Nephrology, University of Illinois at Chicago (to J. S. L.); and funding from the Department of Medicine of McGill University and the Research Institute of the McGill University Health Centre (to J. R.)
Cell culture materials | |||
DMEM, 1X with [4.5 g/L] glucose, L-glutamine & sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | add 10% (v/v) to the culture medium A |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100X | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | add 100 units/mL to the culture media A and B |
γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | add 10 units/mL to the culture medium A |
Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic | Corning (Durham, NC) | 353003 | sterile, 100 mm diameter |
Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom | Corning (Durham, NC) | 352095 | sterile, 15 mL |
Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | sterile, 100 mL |
Name | Company | Catalog | Comments |
Chemicals and inhibitors | |||
Staurosporine, from Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis |
Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/ml] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | use at 50 nM to stimulate responder cells |
UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM to detach adherent cells |
Trypan blue solution, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | for dead cells staining |
Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | use 0.4% (v/v) in 1× DPBS for cell fixation |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | stock solution |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca+2- and Mg+2-free, 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | stock solution |
Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvent for cytochalasin D |
Name | Company | Catalog | Comments |
Cell lysis buffer ingredients | |||
Tris-buffered saline (TBS), 10×, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | for cell lysis buffer |
Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM for cell lysis buffer |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0.5% w/v for cell lysis buffer |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0.1% w/v for cell lysis buffer |
Glycerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% for cell lysis buffer |
Sodium fluoride | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM for cell lysis buffer |
Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% for cell lysis buffer |
Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM for cell lysis buffer |
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM for cell lysis buffer |
Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM for cell lysis buffer |
Name | Company | Catalog | Comments |
Equipment | |||
Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
Fisher Tissuemat, water bath | Fisher (Waltham, MA) | ||
Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
Miscellaneous | |||
Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis |
Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 ml | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane | Corning (Corning, NY) | 3413 | sterile, polystyrene, tissue culture treated |
Name | Company | Catalog | Comments |
Antibodies | |||
Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody | Cell Signaling Technology | 9331 | rabbit polyclonal antibody |
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | rabbit monoclonal antibody |