Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

إنشاء خلايا التكاثري رباعي الصيغة الصبغية من Nontransformed الخلايا الليفية الإنسان

Published: January 8, 2017 doi: 10.3791/55028
Automatic Translation
1, 2
1Division of Morphological Science, Biomedical Research Center, Saitama Medical University, 2Department of Pathology, International Medical Center, Saitama Medical University

Introduction

وقد لوحظ تعدد الصيغ الصبغية ليس فقط في الأنسجة المتخصصة من أنواع الثدييات ولكن أيضا في مجموعة متنوعة من الحالات المرضية، مثل السرطان والأمراض التنكسية. وغالبا ما يلاحظ المتعددة الصبغيات (ومعظمهم من رباعي الصيغة الصبغية) الخلايا في preneoplastic الآفات من الأنسجة البشرية، مثل المريء 1،2 أو الحرشفية الآفات باريت داخل الظهاري لعنق الرحم 3،4، وكان ينظر إلى أن يكون مصدرا للخلايا مختل الصيغة الصبغية الخبيثة في تلك الأنسجة 5 (6). على الرغم من أن يقترح تحويل رباعي الصيغة الصبغية إلى خلايا مختل الصيغة الصبغية يمكن أن يكون حدثا بالغ الأهمية في المراحل المبكرة من تكون الأورام، والآليات التي تشارك في هذه العملية ليست مفهومة تماما. ويرجع هذا جزئيا لا يوجد نموذج في المختبر كانت متاحة حيث nontransformed الخلايا البشرية المتعددة الصبغيات أن ينتشر.

قد يسببها بعض الباحثين الرباعي في الخلايا الظهارية الإنسان nontransformed من خلال توليد خلايا binucleated من يلعنهibiting السيتوبلازمي 7-9. في هذه الطريقة، ومع ذلك، يجب القضاء على الخلايا مضاعفا غير الضرورية التي كتبها مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) 7،8 أو الاستنساخ عن طريق الحد من تخفيف 9. لأن هذه الإجراءات هي شاقة وليس من السهل القيام بها، ابسط الطرق لإقامة المرغوب فيها خلايا رباعي الصيغة الصبغية nontransformed للبحث في هذا المجال.

في هذا التقرير، وصفنا بروتوكول لإنشاء خلايا رباعي الصيغة الصبغية التكاثري من الخلايا الليفية الإنسان العادي أو الخلايا الليفية الإنسان، خلدت التيلوميراز بإجراءات بسيطة نسبيا. إجراءات استخدام المغزل demecolcine السم (DC) إلى اعتقال خلايا مضاعفا في الانقسام، والخلايا الإنقسامية التي جمعتها تنفض تعامل مع مزيد من العاصمة. الخلايا الإنقسامية مضاعفا تعامل مع العاصمة لفترة طويلة من الوقت تحول إلى خلايا G1 رباعي الصيغة الصبغية، وهذه الخلايا تتكاثر الخلايا كما رباعي الصيغة الصبغية بعد اعتقال النمو لعدة أيام بعد إزالة المخدرات. يوفر هذا البروتوكولوسيلة فعالة لخلق نموذجا مفيدا لدراسة العلاقة بين عدم الاستقرار كروموسوم وإمكانات أنكجنيك من الخلايا البشرية المتعددة الصبغيات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. خلية ثقافة

  1. الحصول على خلايا للحث على الرباعي. ولم يتم حتى الآن التأكيد على أن هذه التقنية يمكن تطبيقها على خطوط الخلايا الليفية الإنسان TIG-1، BJ، معدل وفيات الرضع 90 وخلد التيلوميراز-TIG-1 (TIG-HT).
  2. زراعة خلايا في الدنيا والمتوسطة أساسيا مع تعديل α أو أي وسيلة زراعة الخلايا الأخرى مناسبة لنوع الخلية المراد دراستها تستكمل مع 10٪ (ت / ت) للحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS) التي يحتضنها في 5٪ (ت / ت) CO 2 الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية. خلايا مرور كل 3 أو 4 أيام لا تتجاوز كثافة subconfluent.
    ملاحظة: سكان مستوى مضاعفة (PDL) يجب حساب كل الوقت في الركض لتقييم نمو الخلايا وعمر الخلية. ويمكن حساب PDL من عدد الخلايا المصنفة في طبق (N1) وعدد الخلايا التي تحصد في الركض المقبل (N2) باستخدام الصيغة التالية (X هو PDL الأولي). PDL = X + (تسجيل N1 - تسجيل N2) / تسجيل 2

2. الحث وتهتblishment من خلايا رباعي الصيغة الصبغية من مضاعفا الخلايا الليفية

  1. حمل الرباعي دون هزة حالا.
    ملاحظة: بعض سلالات الخلايا (مثل TIG-1) يمكن أن تصبح رباعي الصيغة الصبغية تماما تقريبا عن طريق العلاج المستمر مع demecolcine (DC) على النحو التالي.
    1. خلايا مرور إلى واحد أو اثنين من 100 أطباق ملم في اليوم قبل العلاج للحث على الرباعي. عادة، وإعداد 5 × 05-1 أكتوبر × 10 6 خلايا في طبق لتحريض الخلايا رباعي الصيغة الصبغية.
    2. علاج الخلايا تنمو باطراد مع المتوسط ​​تحتوي على 0.1 ميكروغرام / مل العاصمة لمدة 4 أيام.
    3. استبدال DC-تحتوي على المتوسط مع المتوسط خال من المخدرات واحتضان الخلايا في 5٪ (ت / ت) CO 2 الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية. عادة تستأنف تكاثر الخلايا في غضون أسبوع 1.
  2. حمل الرباعي مع هزة حالا.
    ملاحظة: أصبحت معظم الخلايا خليط من السكان مضاعفا ورباعي الصيغة الصبغية نتيجة للعلاج بسيط مع العاصمة المذكورة أعلاه (2.1). لذلك، بعض التعديلات من عrocedure للقضاء ضرورية لسكان مضاعفا على النحو التالي (الشكل 1).
    1. خلايا مرور إلى عدة T75 قارورة في اليوم قبل العلاج للحث على الرباعي. عادة، وإعداد لا يقل عن 5 × 10 6 خلايا (1 × 10 6 خلايا في قارورة) لتحريض الخلايا رباعي الصيغة الصبغية.
    2. علاج الخلايا تنمو باطراد مع المتوسط ​​تحتوي على 0.1 ميكروغرام / مل العاصمة ل16-18 ساعة للقبض على الخلايا في الانقسام. الوقت اللازم لاعتقال الخلايا في الانقسام قد تعتمد على الخلايا المستهدفة وينبغي أن تحدد من خلال التجارب الأولية للحصول على العديد من الخلايا الإنقسامية وقت ممكن. على سبيل المثال، ينبغي أن يعامل نمو الخلايا أبطأ مع العاصمة لوقت أطول من خلايا تنمو بشكل أسرع.
      ملاحظة: إذا كان يتم التعامل مع الخلايا لفترة طويلة جدا في هذه الخطوة، لأنها قد تخضع انزلاق الإنقسامية والتمسك سطح الطبق، مما يجعل من المستحيل جمع الخلايا الإنقسامية عن اهتزاز حالا في الخطوة التالية.
    3. جمع الخلايا الإنقسامية القبض على العاصمة من قبل طريقة للاهتزاز قبالة، في ملحقالتراث الثقافي غير المادي يتم جمع الخلايا الإنقسامية الالتزام فضفاضة عن طريق هز لطيف قوارير وغسل المتوسطة تليها الطرد المركزي (300 x ج، 5 دقائق). عد عدد الخلايا باستخدام أسلوب المناسب في هذه الخطوة.
    4. RESEED الخلايا الإنقسامية التي تم جمعها في أطباق ثقافة 60 ملم وعلاج الخلايا مع 0.1 ميكروغرام / مل العاصمة لمدة 3 أيام إضافية. البذور أكثر من 1 × 10 6 خلايا الإنقسامية في طبق، لأن أقل من 10٪ من الخلايا يمكن أن يعيش هذا العلاج.
    5. استبدال DC-تحتوي على المتوسط ​​مع المتوسط ​​خال من المخدرات وانتظر الخلايا لاستئناف انتشار الأسلحة النووية، والذي يحدث عادة في حدود 1 في الاسبوع.
  3. خلايا مرور نحو مماثل لخلايا مضاعفا الأصلية.

3. فحص الصيغة الصبغية الحمض النووي

ملاحظة: هذا هو الإجراء راسخة ودليل تقني ينبغي أن تحال إلى إجراءات مفصلة ونصائح تقنية.

  1. حصاد الخلايا (5 × 05-01 أكتوبر × 10 6) التي يحتضنها الخلايا مع يخدع الحلtaining 0.05٪ التربسين و 0.02٪ EDTA لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وتحييد التربسين التي كتبها المتوسطة التي تحتوي على 10٪ FBS.
  2. خلايا الطرد المركزي في المتوسط ​​وغسلها عن طريق إعادة التعليق في 5 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تليها الطرد المركزي (300 x ج، 5 دقائق).
  3. إعداد الخلايا لتحليل الحمض النووي عن طريق واحدة من الطريقتين التاليتين
    1. وهناك طريقة لتحليل الخلايا غير المثبتة 10
      ملاحظة: يمكن أن يتم تنفيذ هذه الطريقة باستخدام طقم المتاحة تجاريا لتحليل دورة الخلية. وينبغي تحليل عينات أعدت مع هذا الأسلوب فورا، لأن الخلايا ليست ثابتة في الإجراء وملطخة سوف نوى أصبحت تالفة مع مرور الوقت.
      1. غسل الخلايا مع 40 ملي العازلة سيترات تحتوي على 250 ملي السكروز. وفي وقت لاحق علاج الخلايا مع 250 ميكرولتر من 0.1٪ (ت / ت) P40 Nonidet و 30 ميكروغرام / مل التربسين في 200 ميكرولتر من 40 ملي العازلة سيترات تحتوي على 250 ملي السكروز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      2. إضافة 200 ميكرولتر من 0.5 ميكروغرام / INH التربسين ملibitor و 0.1 ميكروغرام / مل ريبونوكلياز ألف في 40 ملي العازلة سيترات تحتوي على 250 ملي السكروز، واحتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      3. إضافة 200 ميكرولتر من 0.4 ملغ / مل يوديد propidium (PI) في المخزن سيترات 40MM تحتوي على 250 ملي السكروز، واحتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وصمة عار نواة الخلية.
    2. وهناك طريقة لتحليل خلايا ثابتة
      1. إصلاح الخلايا مع 80٪ من الإيثانول من خلال تعليق الخلايا في 1 مل من برنامج تلفزيوني، إضافة 4 مل من 100٪ ETOH قطرة قطرة في حين خلط تعليق خلية وتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. الخلايا في هذا مثبت ويمكن تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية لعدة أسابيع.
      2. غسل الخلايا عن طريق إعادة التعليق عليها في 5 مل من برنامج تلفزيوني تليها الطرد المركزي (300 x ج، 5 دقائق). علاج الخلايا مع 0.5 ملغ / مل ريبونوكلياز ألف وصمة عار لهم مع 50 ميكروغرام / مل يوديد propidium (PI) (475 ميكرولتر من 0.5 ملغ / مل ريبونوكلياز ألف و25 ميكرولتر من 1 ملغ / مل PI) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. تحليل محتوى الحمض النووي رانه الخلايا باستخدام تدفق عداد الكريات مع ليزر 488 نانومتر، وتصفية الانبعاثات القناة الحمراء (تمر فترة طويلة> 610 نانومتر). تحليل عينة مرجعية أعدت من الخلايا مضاعفا حقيقية في نفس الوقت لتقييم الصيغة الصبغية من الخلايا المستهدفة.
    1. بدلا من ذلك، إضافة حبات القياسية مضان لتقييم نسبة كثافة مضان من الخلايا مضاعفا مقابل الخرز. استخدام 'ارتفاع النبض عرض النبضة مقابل "خيار قياس التدفق الخلوي للتمييز بين الخلايا وكتل من الخلايا مضاعفا 11 رباعي الصيغة الصبغية واحدة.

4. فحص التهم كروموسوم وتحليل النمط النووي

ملاحظة: هذه كلها إجراءات راسخة ودليل تقني أو بروتوكولات الشركة المصنعة ينبغي أن تحال إلى إجراءات مفصلة ونصائح تقنية.

  1. علاج الخلايا تنمو باطراد مع 0.1 ميكروغرام / مل العاصمة لمدة 4 ساعات إلقاء القبض على خلايا في الطورية.
  2. إعداد الشرائح كروموسوم.
      5 خلايا) من خلال trypsinization وتعليق في المتوسط تحتوي على FBS.
    1. خلايا الطرد المركزي في المتوسط ​​(300 x ج، 5 دقائق) وعلاج مع محلول ناقص التوتر (5 مل من 0.075 M بوكل) عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    2. إصلاح وتعليق الخلايا في تثبيتي Carnoy في (الميثانول: حمض الخليك = 3: 1).
    3. انتشار الخلايا على شريحة زجاجية عن طريق إسقاط حجم صغير (25-35 ميكرولتر) من التعليق الخلية. خطوات إضافية مثل التعرض للبخار الساخن قد تكون ضرورية لزيادة كروموسوم الانتشار.
  3. خلايا وصمة عار على التهم كروموسوم أو تحليل النمط النووي أو مضان متعدد الألوان في الموقع التهجين (mFISH).
    1. التهم كروموسوم.
      1. خلايا وصمة عار مع 5٪ محلول بالغيمزا (أو 5 ميكروغرام / مل PI تحتوي على 0.5 ملغ / مل ريبونوكلياز وللفحص المجهري مضان) عن 15-20 دقيقة.
      2. رقميا تصوير لا يقل عن 50 خلايا الطورية.
      3. عد عدد الكروموسومات في كل خلية باستخدام softwa تحليل الصورإعادة بعد فصل اليدوي للمس وتداخل الكروموسومات باستخدام برامج تحرير الصور. على الرغم من أن عدد الصبغيات يمكن سجل يدويا، فمن المستحسن محوسب التهديف.
    2. تحليل النمط النووي
      ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ هذا التحليل من قبل فني مدرب أو شركة مهنية.
      1. خلايا وصمة عار وفقا لتقنية G-النطاقات القياسية 12.
      2. تحليل الكروموسومات لجعل karyograms مستوى 12.
    3. mFISH
      ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية ويجب القيام إذا لزم الأمر.
      1. خلايا وصمة عار باستخدام تحقيقات FISH متعدد الألوان للصبغيات الإنسان وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة 13.
      2. تحليل الكروموسومات باستخدام المجهر مضان مع مرشحات مناسبة وبرنامج لتحليل mFISH 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في تجربتنا، TIG-1 خلايا ويمكن إجراء رباعي الصيغة الصبغية تماما تقريبا عن طريق العلاج المستمر بسيطة مع 0.1 ميكروغرام / مل العاصمة لمدة 4 أيام (الشكل 2A). في المقابل، سلالات الخلايا الليفية الأخرى، مثل BJ أو معدل وفيات الرضع 90، والخلايا TIG-HT، أصبح خليط من مضاعفا والسكان رباعي الصيغة الصبغية التالية بنفس المعاملة، وعزل الخلايا الإنقسامية من طريقة للاهتزاز من الضروري أثناء العلاج العاصمة (عادة 16-18 ساعة بعد بدء العلاج) (الأرقام 2B، C). بعد معالجة إضافية مع العاصمة لمدة 3 أيام، خضع خلايا توقف نمو وأظهرت كبيرة، وسوت التشكل لعدة أيام. في غضون أسبوع واحد في العام، ظهرت الخلايا المتكاثرة الصغيرة بين الخلايا المسطحة الكبيرة (الشكل 3). أصبحت خلايا رباعي الصيغة الصبغية تماما تقريبا في 2-3 أسابيع بعد العلاج العاصمة. وكان عدد الصبغيات مشروط في خلايا رباعي الصيغة الصبغية أنشأت 92 في معظم الحالات، exceحزب العمال أن واحدا من خطوط الخلايا رباعي الصيغة الصبغية التي تم تأسيسها من خلايا TIG-HT كان 91 الكروموسومات في معظم الخلايا (الشكل 4). نمت الخلايا رباعي الصيغة الصبغية التي أنشئت في تقريبا نفس معدل الخلايا مضاعفا (الشكل 5). وأظهرت خطوط الخلايا رباعي الصيغة الصبغية التي تم تأسيسها من الخلايا غير مخلد على عمر تنسخي متساوية تقريبا كما الخلايا مضاعفا الأصلية، في حين أن من خلايا خلدت يبدو أن أيضا الخالد (الشكل 5). أظهرت خلايا رباعي الصيغة الصبغية التي تم تأسيسها من غير خلدت الخلايا TIG-1 النمط النووي العادي باستثناء وجود عدد الكروموسومات رباعي الصيغة الصبغية (الشكل 6 أعلى لوحة)، في حين أن من خلد TIG-1 (TIG-HT) خلايا وأظهرت الانحرافات نسيلي معقدة إلى حد ما (الشكل 6 وسط ولوحات أسفل). تردد الانحرافات نسيلي في الخلايا الأخيرة (TIG-HT-4N) ارتفع من 2.5 الانحرافات لكل خلية في 255 مستويات السكان مضاعفة (PDLs) إلى 5.2 الانحرافات لكل خلية في 450 PDLمع ثقافة فرعية المتكررة.

شكل 1
الشكل 1: توضيح تخطيطي لبروتوكول لتحريض الرباعي. للحصول على خلايا رباعي الصيغة الصبغية مع الحد الأدنى من التلوث من الخلايا مضاعفا، وهو مزيج من الإنقسامية هزة قبالة والعلاج العاصمة ضروري لمعظم سلالات الخلايا (الشكل السفلي)، في حين أن بعض سلالات الخلايا (مثل TIG-1) يمكن أن تصبح تقريبا رباعي الصيغة الصبغية تماما من علاج مستمر مع demecolcine (الشكل العلوي). 1) علاج الخلايا في قوارير T75 (لا تقل عن 5 × 10 6) مع 0.1 ميكروغرام / مل العاصمة ل16-18 ساعة (ينبغي أن تحدد هذه المرة من خلال التجارب الأولية) للقبض على الخلايا في الانقسام. 2) جمع الخلايا الإنقسامية من طريقة للاهتزاز وإيقاف RESEED في أطباق 60 ملم الثقافة. 3) علاج الخلايا مع 0.1 ميكروغرام / مل العاصمة لمدة 3 أيام إضافية. 4) احتضان الخلايا في المتوسط ​​خالية من المخدرات (عادة خلايا استئناف صroliferation حدود 1 في الاسبوع). تمثل الحانات مقياس 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: الحمض النووي المدرج الإحصائي من الخلايا الليفية قبل وبعد العلاج لتحريض الرباعي. (A) TIG-1 الخلايا. هذه السلالة الخلية يصبح رباعي الصيغة الصبغية عن طريق العلاج المستمر بسيطة مع 0.1 ميكروغرام / مل العاصمة لمدة 4 أيام. خلايا (ب) BJ. لأن هذه السلالة الخلية يصبح خليط من السكان مضاعفا ورباعي الصيغة الصبغية التالية علاج بسيط مع العاصمة (لوحات اليسار)، عزل الخلايا الإنقسامية التي تنفض ضرورية أثناء العلاج المستمر إلى إنشاء خلايا رباعي الصيغة الصبغية (لوحات اليمين). (C) TIG-HT الخلايا (TIG-1 التيلوميراز خلد). تحتاج هذه الخلايا أيضا إلى أن من مشط أعدت ination العلاج العاصمة ويهز حالا لإنشاء خلايا رباعي الصيغة الصبغية. الأرقام في رسوم بيانية تمثل ذلك الوقت (أيام) بعد إزالة المخدرات. يمثل الإحداثي السيني محتوى الحمض النووي (C، تكملة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل (3): Photomicrographs التمثيلية للخلايا BJ المعالجة مع العاصمة. خلايا (A) BJ تعامل مع 0.1 ميكروغرام / مل العاصمة لمدة 16 ساعة. العديد من الخلايا اعتقل في الانقسام يمكن أن ينظر إليه. (ب) في نهاية العلاج العاصمة. خلايا كلها تقريبا هي من القبض على النمو. (C) بعد 7 أيام العلاج العاصمة. ويمكن رؤية الخلايا المتكاثرة الصغيرة بين الخلايا المسطحة الكبيرة. (D) بعد 14 يوما العلاج العاصمة. الخلايا تنمو بنشاط. e.com/files/ftp_upload/55028/55028fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 4: Photomicrographs التمثيلية للالكروموسومات والمدرج الإحصائي لعدد كروموسوم لخلايا رباعي الصيغة الصبغية التي تأسست من كل سلالة الخلية. الأعلى، والألواح المتوسطة والسفلية تمثل خلايا رباعي الصيغة الصبغية التي تم تأسيسها من TIG-1 (2 أسابيع بعد العلاج العاصمة)، BJ (بعد 2 أسابيع العلاج العاصمة) وTIG-HT (7 أسابيع بعد العلاج العاصمة) الخلايا على التوالي. وسجل الكروموسومات في لا يقل عن 50 طور متوسط. الأرقام في رسوم بيانية أرقام كروموسوم مشروط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ftp_upload / 55028 / 55028fig5.jpg "/>
الرقم 5: ملامح النمو التمثيلية للالليفية البشرية (الخلايا مضاعفا) وخلايا رباعي الصيغة الصبغية التي تأسست من كل سلالة الخلية. اليسار والوسط واليمين لوحات تظهر ملامح النمو الأصلي TIG-1، BJ وTIG-HT خلايا (علامات مفتوحة) وهذه الخلايا رباعي الصيغة الصبغية أنشئت من كل سلالة الخلية (علامات مغلق). تم passaged خلايا مرتين في الأسبوع، وحسبت PDLs من أرقام الهواتف المحمولة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6: الممثل Karyograms التي كتبها G-النطاقات وmFISH. وتظهر اللوحة العلوية لkaryogram التي كتبها G-ربط الخلايا رباعي الصيغة الصبغية التي تم تأسيسها من TIG-1 (2 أسابيع بعد العلاج DC). تظهر لوحات الوسطى والسفلىkaryograms التي كتبها mFISH للخلايا رباعي الصيغة الصبغية التي تم تأسيسها من خلايا TIG-HT (15 و 41 أسبوعا بعد العلاج DC). واستندت كروتب] على 10 خلايا (TIG-1) أو 20 خلايا (TIG-HT). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وثمة مشكلة رئيسية في تحريض الرباعي من الخلايا مضاعفا عن عوامل كيميائية، إما عن طريق مثبطات السيتوبلازمي أو مثبطات المغزل، غير أن الخلايا غالبا ما تصبح خليط من السكان مضاعفا ورباعي الصيغة الصبغية، ويجب فصل الخلايا رباعي الصيغة الصبغية من الخلايا مضاعفا. النهج الأكثر شيوعا لعزل السكان رباعي الصيغة الصبغية خالية من الخلايا مضاعفا استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية أو الاستنساخ عن طريق الحد من التخفيف. ومع ذلك، فإن هذه الإجراءات هي شاقة وليس من السهل القيام بها. في هذا التقرير، نقدم بروتوكول جديد لإنشاء خلايا رباعي الصيغة الصبغية التكاثري خالية من السكان مضاعفا من الخلايا الليفية الإنسان العادي. يستخدم بروتوكول المغزل السم العاصمة لإلقاء القبض على خلايا مضاعفا في الانقسام، واعتقلت تكون مفصولة تهز حالا من خلايا البيني مضاعفا، التي انضمت إلى سطح الطبق الخلايا الإنقسامية. يتم التعامل مع الخلايا التي تم جمعها مع العاصمة لمدة 3 أيام إضافية، والخلايا الإنقسامية مضاعفا لتحويل خلايا G1 رباعي الصيغة الصبغية بواسطة هذا العلاج العاصمة لفترات طويلة بالأبيض ويفترضذ نقطة تفتيش تابعة للتكيف (وتسمى أيضا انزلاق الإنقسامية). هذه الخلايا بإعادة تشغيل نمو الخلايا كخلايا رباعي الصيغة الصبغية بعد اعتقال النمو لعدة أيام لإزالة المخدرات.

ومن مزايا هذا الأسلوب هو أن إجراءات بسيطة نسبيا وقابلة للمقارنة مع تلك التي تستخدم نظام مراقبة الأصول الميدانية أو استنساخ لعزل خلايا رباعي الصيغة الصبغية. القيود المفروضة على الطريقة هي ما يلي. تطبيق لأنواع أخرى من الخلايا من الخلايا الليفية، مثل الخلايا الظهارية، غير معروف في الوقت الحاضر. وينبغي تأكيد هذا في الدراسات المستقبلية. قد يبقى عدد السكان مضاعفا صغيرة في بعض الحالات. ومع ذلك، هذه الخلايا تميل إلى التقليل مع الركض التسلسلي. وإذا استمر السكان مضاعفا كبيرا بعد العلاج العاصمة، على تركيز أعلى من العاصمة (1،2-1،5 ميكروغرام / مل) أو أطول العلاج مع العاصمة بعد هزة قبالة (4 أيام بدلا من 3 أيام) قد تؤدي إلى تحسين النتيجة.

الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هي التالية. أولا، وقت العلاج مع العاصمة لrresting الخلايا في الانقسام قبل هزة قبالة أمر بالغ الأهمية. على الرغم من أن هذه المرة العلاج يجب أن تكون طويلة بما فيه الكفاية لجمع أكبر عدد ممكن من الخلايا الإنقسامية وقت ممكن، وعلاج لفترة طويلة جدا قد تتسبب في انزلاق الإنقسامية والتصاق على سطح الطبق، مما يجعل من المستحيل لجمع الخلايا الإنقسامية التي تنفض. لأنه الوقت المناسب لاسترداد الحد الأقصى من الخلايا الإنقسامية قد تعتمد على الخلايا المستهدفة، ينبغي أن تحدد من قبل التجارب الأولية. ثانيا، فإن الخطوة تنفض لفصل الخلايا الإنقسامية من البيني خلايا الأهمية بمكان أيضا. في هذه الخطوة، والخلايا الإنقسامية مضاعفا، التي انضمت فضفاضة على سطح الطبق، والتي تم جمعها عن طريق هز لطيف من قوارير تليها الطرد المركزي. هذا الإنقسامية هزة قبالة يفصل الخلايا الإنقسامية اعتقلتهم العاصمة من خلايا البيني الالتزام التي قد تكون مصدر تلوث من قبل السكان مضاعفا في وقت لاحق. يهتز بعنف قد يؤدي إلى السطح من المتوسط، والتي قد تضر الخلايا، وأيضا مفرزة من خلايا الطور البيني، صesulting في تلوث الخلايا مضاعفا. ومن العوامل الأخرى التي قد تؤثر على نجاح هذا الأسلوب هو مستنبت. لأن التحفيز النمو القوي يبدو أنها ضرورية لانتعاش الانتشار بعد العلاج العاصمة والمتوسطة الغنية بالمغذيات مثل MEM-α ينبغي أن تستخدم لدعم انتشار الخلايا رباعي الصيغة الصبغية. زيادة تركيز FBS إلى 20٪ في الخطوة الأخيرة من تحريض الخلايا رباعي الصيغة الصبغية (2.2.5) ويمكن أيضا زيادة نجاح هذا الأسلوب.

باستخدام هذا البروتوكول، لدينا حتى الآن تنتج خلايا رباعي الصيغة الصبغية من سلالات الخلايا الليفية الإنسان TIG-1، BJ، معدل وفيات الرضع 90 والتيلوميراز-خلد TIG-1 حتى الآن 14-16. ومن بين هذه السلالات الخلية، TIG-1 غير عادية إلى حد ما لأن هذه السلالة الخلية يصبح تقريبا رباعي الصيغة الصبغية تماما عندما تعامل بشكل مستمر مع العاصمة، من دون هزة حالا، لمدة 4 أيام. السبب تصبح فقط TIG-1 خلايا رباعي الصيغة الصبغية تماما نتيجة للعلاج بسيط مع DC غير معروف في الوقت الحاضر. expla الممكنقد تكون الدول أن نسبة كبيرة من خلايا الاعتقالات أنواع أخرى في المرحلة G1 مضاعفا عندما تعامل مع العاصمة ويستأنف الانتشار بعد العلاج، في حين (1) TIG-1 الخلايا لا تعتقل في G1 مع نفس المعاملة، أو (2) سكان TIG-1 خلايا تعتقل لا رجعة فيه في G1 تحت نفس المعاملة ولا استئناف الانتشار بعد ذلك. في أي حال، حساسيات مختلفة من نقطة تفتيش G1 إلى العاصمة قد يكون مسؤولا عن سلوكيات مختلفة من الخلايا بعد علاج مستمر مع العاصمة.

عند التحقيق أهمية المسببة للالرباعي في تكون الأورام، العديد من الباحثين لديهم مخاوف كبيرة حول وضع الجين p53 في خلايا رباعي الصيغة الصبغية، لأنه قد تم اقترح أن الرباعي تحرض توقف نمو تعتمد على البروتين p53 الخلايا، والذي يسمى "حاجز الرباعي" 17-20. إذا كانت هذه الفرضية صحيحة، ينبغي إبطال إشارات البروتين p53 في الخلايا المتكاثرة رباعي الصيغة الصبغية. ومع ذلك،ويبدو أن خلايا رباعي الصيغة الصبغية التي أنشأها بروتوكول لدينا أن يكون البروتين p53 وظيفي رغم تزايد في تقريبا نفس معدل الخلايا مضاعفا 15،16. ولا يعرف سبب هذا التناقض في الوقت الحاضر، وأهمية تثبيط البروتين p53 في انتشار الخلايا رباعي الصيغة الصبغية ينبغي أن تدرس بدقة في الدراسات المستقبلية. في الواقع، فإن وجود نقطة تفتيش الرباعي الذي يعمل من خلال البروتين p53 لا يزال مثيرا للجدل 21-23.

على الرغم من أن الخلايا المتعددة الصبغيات nontransformed التي يمكن أن تنتشر في المختبر لا غنى عنها لتحليل مفصل من عدم الاستقرار الكروموسومات وإمكانات أنكجنيك الخلايا المتعددة الصبغيات، هذه الخلايا لديها حتى الآن نادرا ما كانت متاحة. وينص بروتوكول لدينا طريقة بسيطة وممكنا لتأسيس خلايا رباعي الصيغة الصبغية التكاثري من الخلايا الليفية الإنسان العادي، الذي يمكن أن يكون نموذجا مفيدا لدراسة الآليات التي تؤدي إلى تحول الخلايا البشرية المتعددة الصبغيات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصلحة مالية المتنافسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MEM-α Sigma-Aldrich M8042-500ML
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4174
FBS Sigma-Aldrich 172012-500ML
Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) Sigma-Aldrich D1925-10ML
BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits BD Biosciences #340242 For examination of DNA ploidy by flow cytometry
Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte MetaSystems #D-0125-060-DI Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary
Isis imaging system with mFISH  software  MetaSystems Specialized probe kit is necessary

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rabinovitch, P., et al. Predictors of progression in Barrett's esophagus III: baseline flow cytometric variables. Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).
  2. Galipeau, P., et al. NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma. PLoS Med. 4 (2), e67 (2007).
  3. Olaharski, A., et al. Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis. Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).
  4. Liu, Y., et al. p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy. Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).
  5. Davoli, T., de Lange, T. The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
  6. Fox, D., Duronio, R. Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease. Development. 140, 3-12 (2013).
  7. Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437, 1043-1047 (2005).
  8. Ganem, N., et al. Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation. Cell. 158 (4), 833-848 (2014).
  9. Kuznetsova, A., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).
  10. Vindeløv, L., Christensen, I. Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis. Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).
  11. Darzynkiewicz, Z., Juan, G. DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis. Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5 (2001).
  12. Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. Chromosome analysis guidelines preliminary report. Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).
  13. Liehr, T., et al. Multicolor FISH probe sets and their applications. Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).
  14. Ohshima, S., Seyama, A. Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts. Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).
  15. Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Front. Oncol. 3, 198 (2013).
  16. Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts. Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).
  17. Di Leonardo, A., et al. DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function. Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).
  18. Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1. Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).
  19. Vogel, C., et al. Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy. Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).
  20. Aylon, Y., Oren, M. p53: Guardian of ploidy. Mol. Oncol. 5 (4), 315-323 (2011).
  21. Uetake, Y., Sluder, G. Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a "tetraploidy checkpoint". J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).
  22. Ganem, N., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131, 437-440 (2007).
  23. Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization. Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 119، تعدد الصيغ الصبغية، الرباعي، الخلايا الليفية، الخلايا البشرية، دورة الخلية، وعدم الاستقرار الكروموسومات
إنشاء خلايا التكاثري رباعي الصيغة الصبغية من Nontransformed الخلايا الليفية الإنسان
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ohshima, S., Seyama, A.… More

Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts. J. Vis. Exp. (119), e55028, doi:10.3791/55028 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter