Introduction
Polyploidi har observerats inte bara i specialiserade vävnader hos däggdjursarter, utan också i en mängd olika patologiska tillstånd, såsom cancer och degenerativa sjukdomar. Polyploida (mestadels tetraploida celler) observeras ofta i preneoplastiska lesioner av mänskliga vävnader, såsom Barretts esofagus 1,2 eller skivepitelcancer intraepitelial lesioner i livmoderhalsen 3,4, och har ansetts vara en källa till maligna aneuploida celler i dessa vävnader 5 , 6. Även om det föreslås att omvandlingen av tetraploid till aneuploida celler kan vara en avgörande händelse i de tidiga stadierna av tumörbildning, är de mekanismer som är involverade i denna process inte helt klarlagt. Detta beror delvis på att ingen in vitro-modell har funnits där icke-transforme polyploida humana celler kan föröka sig.
Vissa forskare har inducerat tetraploidy i icke-transforme humana epitelceller genom generering av binucleated celler genom inhibiting cytokines 7-9. I denna metod är emellertid onödiga diploida celler måste elimineras genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) 7,8 eller kloning genom begränsande spädning 9. Eftersom dessa förfaranden är arbetskrävande och inte lätt att utföra, för att enklare metoder fastställa icke-transforme tetraploida celler önskas för forskning på detta område.
I denna rapport beskriver vi ett protokoll för att etablera proliferativa tetraploida celler från normala humana fibroblaster eller telomeras-förevigat humana fibroblaster genom relativt enkla förfaranden. Procedurerna använder spindelgift demekolcin (DC) för att stoppa diploida celler i mitos och mitotiska celler som samlats in genom att skaka av ytterligare behandlas med DC. Diploida mitotiska celler som behandlats med DC för längre tid konvertera till tetraploida G1 celler, och dessa celler förökar sig som tetraploida celler efter tillväxtstopp under flera dagar efter borttagning läkemedel. Detta protokoll geren effektiv metod för att skapa en användbar modell för att studera sambandet mellan kromosom instabilitet och den onkogena potentialen hos polyploida humana celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellodling
- Skaffa cellerna att inducera tetraploidy. Hittills har det bekräftats att denna teknik kan tillämpas på de humana fibroblastcellinjer TIG-1, BJ, IMR-90 och telomeras-förevigat TIG-1 (TIG-HT).
- Odla celler i minimalt essentiellt medium med α modifiering eller någon annan cell-odlingsmedium lämpat för den celltyp som skall studeras som kompletterats med 10% (volym / volym) värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS) genom inkubering i en 5% (v / v) CO2 atmosfär vid 37 ° C. Passage celler var 3 eller 4 dagar inte överstiga subkonfluent densitet.
OBS: populationsfördubblingstid nivå (PDL) bör beräknas varje gång vid passage för att utvärdera celltillväxt och cell ålder. PDL kan beräknas från antalet celler ympades i en skål (N1) och cellantalet skördas vid nästa passaging (N2) med användning av följande formel (X är den initiala PDL). PDL = X + (log N1 - log N2) / log 2
2. Induktion och Establishment av tetraploida celler från diploidfibroblaster
- Framkalla tetraploidy utan shake-off.
OBS: Vissa cellstammar (t.ex. TIG-1) kan bli nästan helt tetraploid genom kontinuerlig behandling med demekolcin (DC) på följande sätt.- Passage celler i en eller två 100 mm-skålar på dagen före behandling för att inducera tetraploidy. Vanligtvis förbereda 5 x 10 5 till 1 x 10 6 celler per skål för induktion av tetraploida celler.
- Behandla exponentiellt växande celler med medium innehållande 0,1 mikrogram / ml DC under 4 dagar.
- Ersätta DC-innehållande medium med läkemedelsfritt medium och inkubera cellerna i en 5% (volym / volym) CO2 atmosfär vid 37 ° C. Celler återupptas vanligtvis spridning inom en vecka.
- Framkalla tetraploidy med shake-off.
OBS: De flesta celler blir en blandning av diploida och tetraploida populationer som ett resultat av den enkla behandlingen med DC som beskrivits ovan (2,1). Därför kräver vissa ändringar av pÖRFARANDE att eliminera en diploid population är nödvändiga på följande sätt (Figur 1).- Passageceller i flera T75 kolvar dagen före behandling för att inducera tetraploidy. Vanligtvis förbereda minst 5 x 10 6 celler (1 x 10 6 celler per flaska) för induktion av tetraploida celler.
- Behandla exponentiellt växande celler med medium innehållande 0,1 mikrogram / ml DC för 16 - 18 timmar för att stoppa celler i mitos. Den tid som krävs för att stoppa celler i mitos kan bero på målceller och bör bestämmas genom preliminära experiment för att erhålla så många mitotiska celler som möjligt. Till exempel bör långsammare växande celler behandlas med DC för längre tid än snabbare växande celler.
OBS: Om celler behandlas för länge i det här steget, kan de genomgå mitotisk glidning och ansluta sig till diskytan, vilket gör det omöjligt att samla mitotiska celler genom shake-off i nästa steg. - Samla DC-arreste mitotiska celler genom shake-off-metoden, i Which löst vidhäftade mitotiska celler uppsamlas genom försiktig skakning av kolvar och tvättning med medium följt av centrifugering (300 xg, 5 min). Räkna antalet celler med en lämplig metod i det här steget.
- Reseed uppsamlade mitotiska celler i 60 mm odlingsskålar och behandla cellerna med 0,1 | j, g / ml DC under ytterligare 3 dagar. Utsäde mer än 1 x 10 6 mitotiska celler per skål, eftersom mindre än 10% av cellerna kan överleva denna behandling.
- Byt DC-medium med läkemedelsfritt medium och vänta på celler för att återuppta spridning, vilket vanligtvis sker inom en vecka.
- Passage celler på liknande sätt som original diploida celler.
3. Undersökning av DNA ploidi
OBS: Detta är en väletablerad procedur och en teknisk manual bör hänvisas till för detaljerade förfaranden och tekniska tips.
- Harvest-celler (5 x 10 5 - 1 x 10 6) genom att inkubera celler med en lösning conlande 0,05% trypsin och 0,02% EDTA under 10 min vid 37 ° C, och neutralisera trypsin av medium innehållande 10% FBS.
- Centrifugera cellerna i medium och tvätta dem genom återsuspendering i 5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) följt av centrifugering (300 xg, 5 min).
- Förbereda celler för DNA-analys med en av följande två metoder
- En metod för att analysera icke-fixerade celler 10
OBS: Denna metod kan utföras med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit för cellcykelanalys. Prover framställda med denna metod bör analyseras omedelbart, eftersom cellerna inte fixeras i förfarandet och färgade kärnor blir skadade under tiden.- Tvätta celler med 40 mM citrat-buffert innehållande 250 mM sackaros. Därefter behandla cellerna med 250 mikroliter av 0,1% (volym / volym) Nonidet P40 och 30 mikrogram / ml trypsin i 200 ^ il av 40 mM citrat-buffert innehållande 250 mM sackaros under 10 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt 200 mikroliter av 0,5 mikrogram / ml trypsin inhibitor och 0,1 mikrogram / ml RNas A i 40 mM citrat-buffert innehållande 250 mM sackaros, och inkubera cellerna under 10 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt 200 | il av 0,4 mg / ml propidiumjodid (PI) i 40 mM citrat-buffert innehållande 250 mM sackaros, och inkubera cellerna under 10 min vid rumstemperatur för att färga cellkärnorna.
- En metod för att analysera fixerade celler
- Fix celler med 80% etanol genom att suspendera cellerna i 1 ml PBS, tillsätta 4 ml 100% EtOH droppvis under blandning cellsuspensionen och lämna den vid rumstemperatur under 30 minuter. Celler i denna fixativ kan lagras vid -20 ° C under flera veckor.
- Tvätta cellerna genom att återsuspendera dem i 5 mL PBS följt av centrifugering (300 xg, 5 min). Behandla celler med 0,5 mg / ml RNas A och ge fläckar dem med 50 | ig / ml propidiumjodid (PI) (475 | il av 0,5 mg / ml RNas A och 25 mikroliter av 1 mg / ml PI) under 30 min vid rumstemperatur.
- En metod för att analysera icke-fixerade celler 10
- Analysera DNA-innehållet i tHan celler med användning av en flödescytometer med en 488 nm laser och röda kanalen emissionsfilter (lång passning> 610 nm). Analysera ett referensprov framställt från äkta diploida celler på samma gång för att bedöma ploiditet av målcellerna.
- Alternativt tillfluorescensstandard pärlor att bedöma fluorescensintensitetsförhållandet av diploida celler vs. pärlorna. Använd "pulshöjden mot pulsbredd alternativet av flödescytometern att skilja mellan enskilda tetraploida celler och klumpar av diploida celler 11.
4. Undersökning av Kromosom Räknar och Karyotype Analys
OBS: Dessa är alla väletablerade förfaranden och en teknisk manual eller tillverkarens protokoll bör hänvisas till för detaljerade förfaranden och tekniska tips.
- Behandla exponentiellt växande celler med 0,1 mikrogram / ml DC under 4 h för att stoppa celler i metafas.
- Förbered kromosom diabilder.
- Centrifugera cellerna i medium (300 xg, 5 min) och behandla med hypoton lösning (5 ml 0,075 M KCl) vid 37 ° C under 10 min.
- Fixa och suspendera cellerna i Carnoys fixativ (metanol: ättiksyra = 3: 1).
- Sprida cellerna på ett objektglas, genom att tappa en liten volym (25 - 35 mikroliter) av cellsuspension. Ytterligare steg såsom exponering för het ånga kan vara nödvändigt att förbättra kromosom spridning.
- Kromosom räknas.
- Fläcken celler med 5% Giemsa-lösning (eller 5 mikrogram / ml PI innehållande 0,5 mg / ml RNas A för fluorescensmikroskopi) under 15 - 20 min.
- Digitalt fotografera minst 50 metafas celler.
- Räkna antalet kromosomer per cell med hjälp av en bildanalys software efter manuell separation av gripande och överlappande kromosomer med hjälp av ett fotoredigeringsprogram. Även om antalet kromosomer kan görs manuellt, är datoriserad poäng rekommenderas.
- karyotyp analys
OBS: Denna analys bör utföras av en utbildad tekniker eller ett professionellt företag.- Fläcken celler enligt en standard G-banding teknik 12.
- Analysera kromosomer att göra standard karyograms 12.
- mFISH
OBS: Detta steg är valfritt och bör utföras vid behov.- Fläcken celler med användning av multi FISH prober för mänskliga kromosomer enligt tillverkarens protokoll 13.
- Analysera kromosomer med användning av ett fluorescensmikroskop med lämpliga filter och en programvara för mFISH analys 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enligt vår erfarenhet kan göras TIG-1-celler nästan helt tetraploid genom enkel kontinuerlig behandling med 0,1 | ig / ml DC under 4 dagar (Figur 2A). Däremot andra fibroblaster stammar, såsom BJ eller IMR-90, och TIG-HT-celler, blev en blandning av diploida och tetraploida populationer efter samma behandling, och isolering av mitotiska celler genom shake-off-metoden är nödvändig under kursen av DC-behandling (vanligen 16-18 timmar efter behandlingens början) (fig 2B, C). Efter ytterligare behandling med DC 3 dagar, celler genomgick tillväxtstopp och uppvisade stor, tillplattad morfologi i flera dagar. Inom en vecka i allmänhet, verkade små prolifererande celler bland de stora tillplattade celler (Figur 3). Cellerna blev nästan helt tetraploid i 2 - 3 veckor efter DC behandling. Det modala kromosomantalet i etablerade tetraploida celler var 92 i de flesta fall, except att en av de tetraploida cellinjer etablerade från TIG-HT-celler hade 91 kromosomer i majoriteten av celler (Figur 4). Etablerade tetraploida celler ökade i nästan samma takt som diploida celler (Figur 5). Tetraploida cellinjer etablerade från icke-immortaliserade celler visade en ungefär lika replikativ livslängd som de ursprungliga diploida celler, medan de från immortaliserade celler tycktes vara även odödliga (Figur 5). Tetraploida celler etablerade från icke-odödliggjorda TIG-1-celler visade en normal karyotyp utom för att ha en tetraploid antalet kromosomer (Figur 6 övre panelen), medan de från förevigat TIG-1 (TIG-HT) celler visade ganska komplicerade klon avvikelser (Figur 6 mellersta och nedre paneler). Frekvensen av klonala avvikelser i de senare cellerna (TIG-HT-4n) ökade från 2,5 avvikelser per cell vid 255 populationsfördubblingstid nivåer (PDL) till 5,2 avvikelser per cell vid 450 PDLmed upprepad subkultur.
Figur 1: Schematisk illustration av protokollet för induktion av Tetraploidy. För att erhålla tetraploida celler med minimal förorening av diploida celler, är nödvändigt för de flesta cellstammar (nedre bilden) en kombination av mitotisk skaka-off och DC behandling, medan vissa cellstammar (t.ex. TIG-1) kan bli nästan helt tetraploid genom kontinuerlig behandling med demekolcin (övre bilden). 1) Behandla celler i T75-kolvar (åtminstone 5 x 10 6) med 0,1 mikrogram / ml DC för 16 - 18 timmar (tid bör bestämmas genom preliminära experiment) att stoppa celler i mitos. 2) Samla mitotiska celler vid shake-off-metoden och reseed i 60 mm odlingsskålar. 3) Behandla celler med 0,1 | ig / ml DC under ytterligare 3 dagar. 4) Inkubera cellerna i läkemedelsfritt medium (vanligtvis celler återuppta proliferation inom en vecka). Skalstrecken representerar 100 ^ m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: DNA-histogram av fibroblaster före och efter behandlingar för induktion av Tetraploidy. (A) TIG-1-celler. Denna cellstam blir tetraploida genom enkel kontinuerlig behandling med 0,1 | ig / ml DC under 4 dagar. (B) BJ-celler. Eftersom denna cellstam blir en blandning av diploida och tetraploida populationer efter enkel behandling med DC (vänster paneler) är nödvändig under DC behandling isolering av mitotiska celler genom att skaka av att etablera tetraploida celler (höger paneler). (C) TIG-HT (telomeras-immortaliserad TIG-1) celler. Dessa celler måste också framställas genom en kam nering av DC behandling och skaka-off för etablering av tetraploida celler. Siffror i histogrammen representerar tiden (dagar) efter avlägsnande drog. Abskissan representerar DNA-innehållet (C, komplement). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa mikrofotografier av BJ-celler som behandlats med DC. (A) BJ-celler behandlades med 0,1 | j, g / ml DC under 16 h. Många celler som stoppats i mitos kan ses. (B) I slutet av DC behandling. Nästan alla celler är tillväxthämmade. (C) 7 dagar efter DC behandling. Små prolifererande celler bland stora tillplattade celler kan ses. (D) 14 dagar efter DC behandling. Celler växer aktivt. e.com/files/ftp_upload/55028/55028fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa mikrofotografier av kromosomer och histogram av kromosomantalet för tetraploida celler etablerats från varje cellstam. Top, mitten och botten paneler representerar tetraploida celler etablerade från TIG-1 (2 veckor efter DC behandling), BJ (2 veckor efter DC behandling) och TIG-HT (7 veckor efter DC behandling) celler respektive. Kromosomer bedömdes i minst 50 metafaser. Siffror inom histogram är modala kromosomantal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
ftp_upload / 55.028 / 55028fig5.jpg "/>
Figur 5: representativa tillväxtprofiler för mänskliga fibroblaster (diploida celler) och tetraploid celler Etablerade från varje cellstam. Vänster, mitten och höger sida visar tillväxtprofiler för original TIG-1, BJ och TIG-HT-celler (öppna markörer) och de av tetraploida celler etablerade från varje cellstam (stängt markörer). Cellerna passe två gånger i veckan och PDL beräknades från cellantal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: representant Karyograms av G-bandning och mFISH. Ovanpanelen visar en karyogram av G-bandning av tetraploida celler etablerade från TIG-1 (2 veckor efter DC behandling). Mitten och botten fälten visarkaryograms av mFISH för tetraploida celler etablerade från TIG-HT-celler (15 och 41 veckor efter DC behandling). Karyotyper var baserade på 10-celler (TIG-1) eller 20 celler (TIG-HT). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett stort problem i induktion av tetraploidy från diploida celler genom kemiska medel, antingen genom cytokines hämmare eller spindel hämmare, är att cellerna blir ofta en blandning av diploida och tetraploida populationer, och tetraploida celler måste separeras från diploida celler. Vanligaste metoder för isolering av en tetraploid befolkning utan diploida celler använder FACS eller kloning genom begränsande utspädning. Emellertid är dessa förfaranden är arbetskrävande och inte lätt att utföra. I denna rapport presenterar vi ett nytt protokoll för att etablera proliferativa tetraploida celler fria från en diploid population från normala humana fibroblaster. Protokollet använder spindelgift DC för arresting diploida celler i mitos, och greps mitotiska celler är separerade genom skakning-off från diploida interfasceller, som vidhäftade till skålen ytan. Uppsamlade cellerna behandlas med DC för ytterligare 3 dagar, och diploida mitotiska celler omvandlas till tetraploida G1 celler genom denna långvariga DC behandling förmodligen by checkpoint anpassning (även kallad mitotisk glidning). Dessa celler starta celltillväxt som tetraploida celler efter tillväxtstopp i flera dagar för avlägsnande läkemedel.
En fördel med denna metod är att förfarandena är relativt enkel och genomförbar jämfört med de som använder FACS eller kloning för isolering av tetraploida celler. Metodens begränsningar är följande. Tillämpbarhet på celltyper andra än fibroblaster, såsom epitelceller, är för närvarande okänd. Detta bör bekräftas i framtida studier. En liten diploid population kan kvarstå i vissa fall. Men dessa celler tenderar att minska med seriepassage. Om en betydande diploid population kvarstår efter DC behandling, en högre koncentration av DC (1,2-1,5 mikrogram / ml) eller längre behandling med DC efter shake-off (4 dagar i stället för 3 dagar) kan förbättra resultatet.
De mest kritiska stegen i detta protokoll är följande. För det första, behandlingstid med DC för enrresting celler i mitos före shake-off är kritisk. Även om denna behandling Tiden bör vara tillräckligt lång för att samla så många mitotiska celler som möjligt, behandling för länge kan orsaka mitotisk glidning och vidhäftning till diskytan, vilket gör det omöjligt att samla in de mitotiska cellerna genom att skaka av. Eftersom en lämplig tidpunkt för maximal återhämtning av mitotiska celler kan bero på målceller, bör bestämmas genom preliminära experiment. För det andra att den skaka av steg separera mitotiska celler från interfasceller är också kritisk. I detta steg, diploida mitotiska celler, som är löst vidhäftade till skålen ytan, uppsamlas genom försiktig skakning av kolvarna följt av centrifugering. Detta mitotiska shake-off separerar mitotiska celler greps av DC från vidhäftade interfasceller som kan vara ursprunget till kontaminering av den diploida befolkningen senare. Skakning våldsamt kan orsaka bubbling av mediet, som kan skada celler, och även avlossning av interfasceller, resulting i förorening av diploida celler. En annan faktor som kan påverka framgången för denna metod är odlingsmediet. Eftersom robust tillväxtstimulering verkar vara nödvändigt för återvinning av proliferation efter DC behandling, bör näringsrikt medium, såsom MEM-α användas för att stödja spridning av tetraploida celler. Ökande FBS koncentration till 20% vid det sista steget av induktion av tetraploida celler (2.2.5) kan också öka framgången för denna metod.
Med hjälp av detta protokoll, har vi hittills producerat tetraploida celler från human fibroblast stammar TIG-1, BJ, IMR-90 och telomeras-förevigat TIG-1 hittills 14-16. Bland dessa cellstammar är TIG-en ganska ovanlig eftersom denna cellstam blir nästan helt tetraploid när de behandlas kontinuerligt med DC, utan shake-off, i 4 dagar. Anledningen endast TIG-1-celler bli helt tetraploid som ett resultat av enkel behandling med DC är för närvarande okänd. möjligt instuktionernanationer kan vara att en betydande andel av celler av andra typer anhållanden vid diploida G1-fasen när de behandlas med DC och återupptar proliferation efter behandling, medan (1) TIG-1-celler inte gripa vid G1 med samma behandling, eller (2) en population av TIG-1-celler arresterar irreversibelt vid G1 enligt samma behandling och inte återuppta spridning därefter. I varje fall kan olika känsligheter för G1 checkpoint till DC vara ansvariga för de olika beteenden av cellerna efter kontinuerlig behandling med DC.
När man undersöker det etiologiska betydelse tetraploidy i tumorigenes, många forskare har stora bekymmer om status för p53-genen i tetraploida celler, eftersom det har föreslagits att tetraploidy inducerar p53-beroende tillväxtstopp av celler, som kallas "tetraploidy checkpoint" 17-20. Om denna hypotes är korrekt, bör p53 signalering i prolifererande tetraploida celler inaktiveras. Dock,tetraploida celler som fastställts av våra protokoll verkar ha funktionell p53 trots växer nästan samma takt som diploida celler 15,16. Anledningen till denna diskrepans är inte känd för närvarande, och betydelsen av p53 inaktive i spridningen av tetraploida celler bör undersökas noggrant i framtida studier. I själva verket förblir närvaron av en tetraploidy kontrollpunkt som fungerar genom p53 kontroversiell 21-23.
Även om icke-transforme polyploida celler som kan utbreda in vitro är oumbärliga för detaljerad analys av kromosomal instabilitet och den onkogena potentialen hos polyploida celler, sådana celler har hittills sällan varit tillgängliga. Vår protokoll ger en enkel och genomförbar metod för att fastställa proliferativa tetraploida celler från normala humana fibroblaster, vilket skulle kunna vara en användbar modell för att studera de mekanismer som leder till omvandling av polyploida humana celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har någon konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM-α | Sigma-Aldrich | M8042-500ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | 172012-500ML | |
| Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) | Sigma-Aldrich | D1925-10ML | |
| BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits | BD Biosciences | #340242 | For examination of DNA ploidy by flow cytometry |
| Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte | MetaSystems | #D-0125-060-DI | Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary |
| Isis imaging system with mFISH software | MetaSystems | Specialized probe kit is necessary |
References
- Rabinovitch, P., et al. Predictors of progression in Barrett's esophagus III: baseline flow cytometric variables. Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).
- Galipeau, P., et al. NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma. PLoS Med. 4 (2), e67 (2007).
- Olaharski, A., et al. Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis. Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).
- Liu, Y., et al. p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy. Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).
- Davoli, T., de Lange, T. The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
- Fox, D., Duronio, R. Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease. Development. 140, 3-12 (2013).
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437, 1043-1047 (2005).
- Ganem, N., et al. Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation. Cell. 158 (4), 833-848 (2014).
- Kuznetsova, A., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).
- Vindeløv, L., Christensen, I. Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis. Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).
- Darzynkiewicz, Z., Juan, G. DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis. Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5 (2001).
- Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. Chromosome analysis guidelines preliminary report. Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).
- Liehr, T., et al. Multicolor FISH probe sets and their applications. Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).
- Ohshima, S., Seyama, A. Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts. Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).
- Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Front. Oncol. 3, 198 (2013).
- Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts. Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).
- Di Leonardo, A., et al. DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function. Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).
- Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1. Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).
- Vogel, C., et al. Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy. Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).
- Aylon, Y., Oren, M.
- Uetake, Y., Sluder, G. Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a "tetraploidy checkpoint". J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).
- Ganem, N., Pellman, D.
- Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization. Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).
