Introduction
Polyploidi er blitt observert ikke bare i spesielle vev i pattedyrarter, men også i en rekke patologiske tilstander, slik som kreft og degenerative sykdommer. Polyploide (for det meste tetraploide) celler blir ofte observert i preneoplastiske lesjoner av humane vev, såsom Barretts øsofagus 1,2 eller squamous intraepitelial kreft i livmorhalsen 3,4, og er blitt ansett for å være kilden til ondartede celler aneuploide i disse vevene 5 6. Selv om det er foreslått at omdannelsen av tetraploid til aneuploide celler kan være en viktig hendelse i de tidlige stadier av tumorgenese, er involvert i denne prosessen mekanismer ikke fullt ut forstått. Dette er delvis fordi ingen in vitro modellen har vært tilgjengelig der transformerte polyploide menneskeceller kan formere seg.
Enkelte forskere har indusert tetraploidy i transformerte humane epitelceller gjennom generasjon binucleated celler ved inhibiting cytokinese 7-9. I denne metode er imidlertid unødvendige diploide celler må elimineres ved fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) 7,8 eller kloning ved begrensende fortynning 9. Fordi disse fremgangsmåter er arbeidskrevende og er ikke lett å utføre, til enklere metoder etablere ikke-transformerte celler tetraploide er ønsket for forskning i dette feltet.
I denne rapporten beskriver vi en protokoll for å etablere proliferativ tetraploide celler fra normale humane fibroblaster eller telomerase-udødelig humane fibroblaster ved relativt enkle prosedyrer. Prosedyrene bruke spindel giften demecolcine (DC) for å arrestere diploide celler i mitose, og mitotiske celler samlet inn ved å riste av er videre behandlet med DC. Diploide mitotiske celler behandlet med DC for lengre tid konvertere til tetraploide G1 celler, og disse cellene sprer som tetraploide celler etter vekst arrest i flere dager etter narkotika fjerning. Denne protokollen giren effektiv metode for å lage en nyttig modell for å studere sammenhengen mellom kromosomet ustabilitet og den onkogene potensialet til polyploide humane celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Culture
- Skaff cellene å indusere tetraploidy. Til dags dato er det blitt bekreftet at denne teknikken kan anvendes på de humane fibroblast-cellelinjer TIG-1, BJ, IMR-90 og telomerase-udødelig TIG-1 (TIG-HT).
- Dyrke celler i minimum essensielt medium med α modifikasjon eller en hvilken som helst annen cellekulturmedium egnet for den celletype som skal studeres, supplert med 10% (v / v) varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS) ved inkubasjon i en 5% (v / v) CO 2 atmosfæren ved 37 ° C. Passasje celler hver 3 eller 4 dager til ikke å overskride Subkonfluente tetthet.
MERK: Befolkning dobling nivå (PDL) skal beregnes hver gang på aging å vurdere cellevekst og celle alder. PDL kan beregnes fra celletallet sådd ut på en tallerken (N1) og celletallet høstet ved neste aging (N2) ved hjelp av følgende formel (X er den første PDL). PDL = X + (log N1 - logg N2) / log 2
2. Induksjon og Establert Tetraploid Celler fra diploide
- Fremkall tetraploidy uten shake-off.
MERK: Noen cellestammer (f.eks TIG-1) kan bli nesten helt tetraploid ved kontinuerlig behandling med demecolcine (DC) som følger.- Passage celler i ett eller to 100 mm retter på dagen før behandling for å indusere tetraploidy. Vanligvis forberede 5 x 10 5 til 1 x 10 6 celler per parabolen for induksjon av tetraploide celler.
- Behandle eksponentielt voksende celler med medium inneholdende 0,1 ug / ml DC i 4 dager.
- Erstatte DC-inneholdende medium med medikamentfritt medium og inkuberes cellene i en 5% (v / v) CO 2 atmosfære ved 37 ° C. Celler vanligvis gjenoppta spredning innen en uke.
- Fremkall tetraploidy med shake-off.
MERK: De fleste cellene blir en blanding av diploide og tetraploide populasjoner som et resultat av den enkle behandling med like beskrevet ovenfor (2,1). Derfor, noen modifikasjoner av procedure for å eliminere en diploid befolkning er nødvendige som følger (figur 1).- Passage celler i flere T75 krukker dagen før behandling for å indusere tetraploidy. Vanligvis forberede minst 5 x 10 6 celler (1 x 10 6 celler per flaske) for induksjon av tetraploide celler.
- Unn eksponentielt voksende celler med medium som inneholder 0,1 mikrogram / ml DC i 16 - 18 timer å arrestere celler i mitose. Den tid som kreves til å stanse celler i mitose kan være avhengig av målceller og bør bestemmes ved preliminære forsøk for å oppnå så mange mitotiske celler som mulig. For eksempel bør langsommere voksende celler behandles med DC for lengre tid enn raskere voksende celler.
MERK: Hvis cellene behandles for lenge i dette trinnet, kan de gjennomgå mitotisk glidning og holder seg til parabolen overflaten, noe som gjør det umulig å samle mitotiske celler ved shake-off i neste trinn. - Samle DC-arrestert mitotiske celler med shake-off metode, which løst levd mitotiske celler samles ved forsiktig risting av kolber og vasking med medium etterfulgt av sentrifugering (300 xg, 5 min). Telle celle nummer på en hensiktsmessig måte i dette trinnet.
- Reseed oppsamlede mitotiske celler i 60 mm kulturskåler og behandle cellene med 0,1 ug / mL DC i ytterligere 3 dager. Seed mer enn 1 x 10 6 mitotiske celler pr tallerken, fordi mindre enn 10% av cellene kan overleve denne behandling.
- Erstatte DC-inneholdende medium med medikamentfritt medium og vente for cellene å gjenoppta spredning, noe som vanligvis forekommer i løpet av en uke.
- Passage celler på samme måte til opprinnelige diploide celler.
3. Undersøkelse av DNA ploidiundersøkelse
MERK: Dette er en godt etablert prosedyre og en teknisk manual bør henvises til for detaljerte prosedyrer og tekniske tips.
- Høste celler (5 x 10 5 - 1 x 10 til 6) ved å inkubere cellene med en løsning conholdende 0,05% trypsin og 0,02% EDTA i 10 minutter ved 37 ° C, og nøytralisere trypsin av medium inneholdende 10% FBS.
- Sentrifuger cellene i medium og vaskes ved resuspendering i 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS), etterfulgt av sentrifugering (300 x g, 5 min).
- Forbered celler for DNA-analyse av en av de følgende to metoder
- En fremgangsmåte for å analysere ufikserte celler 10
MERK: Denne fremgangsmåte kan utføres ved å bruke et kommersielt tilgjengelig kit for cellesyklusanalyse. Prøver fremstilt med denne fremgangsmåte skal analyseres umiddelbart, fordi cellene ikke er løst i fremgangsmåten og farget kjerner vil bli ødelagt over tid.- Vask celler med 40 mM citratbuffer inneholdende 250 mM sukrose. Deretter behandle cellene med 250 ul 0,1% (v / v) Nonidet P40 og 30 ug / ml trypsin i 200 pl av 40 mM citrat-buffer inneholdende 250 mM sukrose i 10 minutter ved romtemperatur.
- Tilsett 200 pl av 0,5 pg / ml trypsin inhibitor og 0,1 ug / ml RNase A i 40 mM citrat-buffer inneholdende 250 mM sukrose, og inkuberes cellene i 10 minutter ved romtemperatur.
- Tilsett 200 ul av 0,4 mg / ml propidiumjodid (PI) i 40 mM citrat-buffer inneholdende 250 mM sukrose, og inkuberes cellene i 10 minutter ved romtemperatur for å flekke cellekjerner.
- En fremgangsmåte for å analysere fikserte celler
- Løs celler med 80% etanol ved å suspendere cellene i 1 ml PBS, tilsetning av 4 ml 100% EtOH dråpevis under blanding av cellesuspensjonen og etterlater den ved romtemperatur i 30 min. Celler i dette fikseringsmiddel kan oppbevares ved -20 ° C i flere uker.
- Vask cellene ved resuspendering dem i 5 ml PBS, etterfulgt av sentrifugering (300 x g, 5 min). Behandle cellene med 0,5 mg / ml RNase A og beis dem med 50 ug / ml propidiumjodid (PI) (475 ul av 0,5 mg / ml RNase A og 25 ul av 1 mg / ml PI) i 30 minutter ved romtemperatur.
- En fremgangsmåte for å analysere ufikserte celler 10
- Analyser DNA innhold av tHan celler ved hjelp av et strømningscytometer med en 488 nm laser og røde kanalen utslipp filter (lang passere> 610 nm). Analyser en referanseprøve fremstilt fra ekte diploide celler på samme tid til å vurdere ploiditet av målcellene.
- Alternativt kan legge fluorescens standard-perler for å vurdere fluorescensintensiteten forholdet av diploide celler vs. perlene. Bruk 'pulshøydepulsbredde kontra alternativet av strømningscytometeret å diskriminere mellom enkelt tetraploide celler og klumper av diploide celler 11.
4. Undersøkelse av Kromosom grevene og Karyotype Analysis
MERK: Disse er alle godt etablerte prosedyrer og en teknisk manual eller produsentens protokoller bør henvises til for detaljerte prosedyrer og tekniske tips.
- Behandle eksponentielt voksende celler med 0,1 ug / mL DC i 4 timer for å stanse celler i metafase.
- Forbered kromosom lysbilder.
- Sentrifuger cellene i medium (300 xg, 5 min) og behandle med hypoton oppløsning (5 ml 0,075 M KCl) ved 37 ° C i 10 min.
- Fiks og suspendere celler i Carnoy sin fiksativ (metanol: eddiksyre = 3: 1).
- Spre celler på et objektglass ved å slippe en liten mengde (25 - 35 uL) av cellesuspensjonen. Ytterligere trinn som eksponering for varm damp kan være nødvendig for å forbedre kromosom spredning.
- Kromosom teller.
- Flekk-celler med 5% Giemsa-løsning (eller 5 mikrogram / ml PI inneholdende 0,5 mg / ml RNase A for fluorescens mikroskopi) i 15 - 20 min.
- Digitalt fotografere minst 50 metafase celler.
- Tell kromosom nummer per celle ved hjelp av en bildeanalyse software etter manuell separasjon av rørende og overlappende kromosomer ved hjelp av et bildebehandlingsprogram. Selv kromosom nummer kan scores manuelt, er datastyrt scoring anbefales.
- karyotype analyse
MERK: Denne analysen bør utføres av en utdannet tekniker eller et profesjonelt firma.- Flekke celler i henhold til en standard G-banding teknikk 12.
- Analyser kromosomer å gjøre vanlige karyograms 12.
- mFISH
MERK: Dette trinnet er valgfritt, og bør utføres om nødvendig.- Flekke celler ved hjelp av flerfarget FISH prober for menneskelige kromosomer i henhold til produsentens protokoll 13.
- Analyser kromosomer ved hjelp av en fluorescens mikroskop med passende filtre og en programvare for mFISH analyse 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vår erfaring, kan TIG-1 celler gjøres nesten helt tetraploid ved enkel kontinuerlig behandling med 0,1 mg / ml DC i 4 dager (figur 2A). I kontrast til andre fibroblast-stammer, slik som BJ eller IMR-90, og TIG-HT-celler, ble en blanding av diploid og tetraploide populasjoner etter den samme behandling, og isolering av mitotiske celler ved å riste-off-metoden er nødvendig i løpet DC behandling (vanligvis 16 - 18 timer etter begynnelsen av behandlingen) (figurene 2B, C). Etter en ytterligere behandling med DC i 3 dager, ble celler gjennomgikk vekststans og oppviste stor, flat morfologi i flere dager. I løpet av en uke generelt, først på små prolifererende celler blant de store flate-celler (figur 3). Celler ble nesten helt tetraploid i 2 - 3 uker etter DC behandling. Den modal kromosom nummer i etablerte tetraploide celler var 92 i de fleste tilfeller, except at en av de tetraploide cellelinjer etablert fra TIG-HT-celler hadde 91 kromosomer i mesteparten av cellene (figur 4). Etablerte tetraploide celler vokste på nesten samme hastighet som diploide celler (figur 5). Tetraploid cellelinjer etablert fra ikke-immortaliserte celler viste en tilnærmet lik replikative levetid som de opprinnelige diploide celler, mens de fra immortaliserte celler så ut til å være også udødelig (figur 5). Tetraploid celler etablert fra ikke-udødeliggjorte TIG-1 celler viste en normal karyotype unntak av å ha en tetraploid kromosomantall (figur 6 toppfeltet), mens de fra udødelig TIG-1 (TIG-HT) celler viste heller kompliserte klonale forstyrrelser (Figur 6 midtre og nedre paneler). Hyppigheten av klonal avvik i de siste cellene (TIG-HT-4n) økte fra 2,5 avvik per celle ved 255 befolknings dobling nivåer (PDLer) til 5,2 avvik per celle ved 450 PDLmed gjentatt subkultur.
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av protokollen for induksjon av Tetraploidy. For å få tetraploide celler med minimum forurensning av diploide celler, er nødvendig for de fleste cellestammer (lavere illustrasjon) en kombinasjon av mitotisk shake-off og DC behandling, mens noen cellestammer (f.eks TIG-1) kan bli nesten helt tetraploid ved kontinuerlig behandling med demecolcine (øverste figur). 1) Behandl celler i T75-kolber (minst 5 x 10 6) med 0,1 ug / mL DC i 16 - 18 timer (dette tidspunkt bør bestemmes ved forforsøk) for å stanse celler i mitose. 2) Samle mitotiske celler ved shake-off metode og reseed til 60 mm kultur retter. 3) Behandl celler med 0,1 ug / mL DC i ytterligere 3 dager. 4) Inkuber cellene i narkotikafritt medium (vanligvis celler gjenoppta proliferation innen 1 uke). Skala barer representerer 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: DNA-histogrammer av fibroblaster Før og etter behandlinger for Induksjon av Tetraploidy. (A) TIG-1-celler. Denne cellestamme blir tetraploid ved enkel kontinuerlig behandling med 0,1 ug / mL DC i 4 dager. (B) BJ celler. Fordi denne cellen belastningen blir en blanding av diploide og tetraploide populasjoner følgende enkle behandling med DC (venstre panel), er isolering av mitotiske celler ved å riste av nødvendig under DC behandling for å etablere tetraploide celler (høyre panel). (C) TIG-HT (telomerase-udødelig TIG-1) celler. Disse cellene må også fremstilles ved en kam ination av DC behandling og riste-off for etablering av tetraploide celler. Tall i histogrammet representerer tid (dager) etter narkotika fjerning. Abscissen representerer DNA-innhold (C, komplement). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representative Mikrofotografier av BJ celler behandlet med DC. (A) BJ-celler behandlet med 0,1 ug / mL DC i 16 timer. Mange celler stanset i mitosen kan sees. (B) Enden av DC-behandling. Nesten alle celler er vekst arrestert. (C) 7 dager etter DC behandling. Små prolifererende celler blant store flate celler kan bli sett. (D) 14 dager etter behandling DC. Cellene er aktivt voksende. e.com/files/ftp_upload/55028/55028fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Representative Mikrofotografier av kromosomer og histogrammer av kromosom nummer for Tetraploid Cells Etablert fra hver celle Strain. Top, midtre og nedre paneler representerer tetraploide celler etablert fra TIG-1 (2 uker etter DC behandling), BJ (2 uker etter DC behandling) og TIG-HT (7 uker etter DC behandling) celler henholdsvis. Kromosomer ble scoret i minst 50 meta. Tall i histogrammet er modale kromosomtall. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
ftp_upload / 55028 / 55028fig5.jpg "/>
Figur 5: Representative Vekst Profiler av humane fibroblaster (diploide celler) og Tetraploid Celler Etablert fra hver celle Strain. Venstre, midtre og høyre panel viser vekst profiler av originale TIG-en, BJ og TIG-HT celler (åpne markører) og de av tetraploide celler etablert fra hver celle stamme (stengt markører). Celler ble passert to ganger i uken og PDLer ble beregnet ut fra celletall. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Representant Karyograms av G-banding og mFISH. Top panel viser en karyogram av G-banding av tetraploide celler etablert fra TIG-1 (2 uker etter DC behandling). Midtre og nedre panelene viserkaryograms av mFISH for tetraploide celler etablert fra TIG-HT celler (15 og 41 uker etter DC behandling). Karyotyper var basert på 10 celler (TIG-1) eller 20 celler (TIG-HT). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et stort problem i induksjon av tetraploidy fra diploide celler fra kjemiske midler, enten ved cytokinese inhibitorer eller ved spindel inhibitorer, er at celler ofte bli en blanding av diploide og tetraploide populasjoner, og tetraploide celler må separeres fra diploide celler. De vanligste metoder for isolering av en tetraploid befolkning uten diploide cellene bruker FACS eller kloning av begrensende fortynning. Men disse framgangsmåter er arbeidskrevende og er ikke lett å utføre. I denne rapporten presenterer vi en ny protokoll for å etablere proliferativ tetraploide celler uten en diploid befolkningen fra normale humane fibroblaster. Protokollen bruker spindel giften DC for å arrestere diploide celler i mitose, og arresterte mitotiske celler er separert ved å riste-off fra diploide interfase celler, som følges til parabolen overflaten. Oppsamlede celler behandles med DC i ytterligere 3 dager, og diploide mitotiske celler omdannes til tetraploide G1-celler ved denne forlengede DC behandling antagelig by sjekkpunkt tilpasning (også kalt mitotisk glidning). Disse cellene starter cellevekst som tetraploide celler etter vekst arrest i flere dager for narkotika fjerning.
En fordel ved denne metoden er at fremgangsmåten er relativt enkle og gjennomførbare sammenlignet med de som anvender FACS eller kloning for å isolere tetraploide celler. Begrensninger av metoden er følgende. Anvendbarhet til andre enn fibroblaster celletyper, slik som epitelceller, er ukjent. Dette bør bekreftes i fremtidige studier. En liten diploid befolkning kan forbli i noen tilfeller. Men disse cellene har en tendens til å avta med serieaging. Hvis en vesentlig diploid populasjon vedvarer etter DC behandling, en høyere konsentrasjon av DC (1.2 til 1.5 mikrogram / ml) eller lengre behandling med DC etter riste-off (4 dager i stedet for 3 dager) kan gi bedre resultat.
De mest kritiske trinn i denne protokollen er følgende. For det første behandlingstiden med DC for enrresting celler i mitose før shake-off er kritisk. Selv om denne behandlingstiden bør være lang nok til å samle så mange mitotiske celler som mulig, behandle for lenge kan føre mitotisk glidning og heft til parabolen overflaten, noe som gjør det umulig å samle mitotiske celler ved å riste av. Fordi et passende tidspunkt for maksimal utvinning av mitotiske celler kan være avhengig av målcellene, dersom det fastslås ved forforsøk. For det andre, til risting av trinnet separere mitotiske celler fra interfase-celler er også kritisk. I dette trinn diploide mitotiske celler, som er løst festet til den skåloverflaten, blir samlet opp ved forsiktig risting av kolbene, etterfulgt av sentrifugering. Dette mitotisk shake-off skiller mitotiske celler arrestert av DC fra følges interfase celler som kan være opphavet til forurensning av diploid befolkningen senere. Risting voldsomt kan forårsake bobling i mediet, noe som kan skade cellene, og også avløsning av interfaseceller, resulting i forurensning av diploide celler. En annen faktor som kan påvirke suksess med denne metoden er kulturmediet. Fordi robust vekststimulering synes å være nødvendig for gjenvinning av proliferasjon etter DC-behandling, bør næringsrikt medium, for eksempel MEM-α brukes til å støtte proliferasjonen av tetraploide celler. Økende FBS konsentrasjonen til 20% på det siste trinnet av induksjon av tetraploide celler (2.2.5) kan også øke suksessen av denne metoden.
Ved hjelp av denne protokollen, har vi hittil produsert tetraploide celler fra menneskelige fibroblast stammer TIG-en, BJ, IMR-90 og telomerase-udødelig TIG-en til nå 14-16. Blant disse cellestammer er TIG-en heller uvanlig fordi denne cellestamme blir nesten fullstendig tetraploid når de ble behandlet fortløpende med DC, uten å riste-off, i 4 dager. Grunnen til at bare TIG-1-celler blir helt tetraploid som et resultat av enkel behandling med DC er ukjent. mulig explanasjoner kan være at en betydelig andel av celler av andre typer arrestert i diploid G1 fase når de ble behandlet med likestrøm og gjenopptar proliferasjon etter behandling, mens (1) TIG-1-celler ikke arrestere ved G1 med den samme behandling, eller (2) en befolkningen i TIG-1 celler irreversibelt arrestasjoner på G1 under samme behandling, og ikke gjenoppta spredning etterpå. I alle fall, kan følsomheten av G1 sjekkpunkt til DC være ansvarlig for de ulike atferd av celler etter kontinuerlig behandling med DC.
Når etterforsker etiologisk betydning tetraploidy i tumorigenesis, mange forskere har store bekymringer om status for p53-genet i tetraploide celler, fordi det har blitt foreslått at tetraploidy induserer p53 avhengig vekst arrest av celler, som er kalt "tetraploidy sjekkpunkt" 17-20. Dersom denne hypotesen er riktig, bør p53 signal i prolifererende tetraploide celler inaktiveres. Derimot,tetraploide celler etablert av vår protokoll synes å ha funksjonell p53 til tross for voksende på nesten samme tempo som diploide celler 15,16. Årsaken til denne uoverensstemmelse er ikke kjent i dag, og betydningen av p53 inaktivering i proliferasjon av celler tetraploide bør undersøkes nøyaktig i fremtidige studier. Faktisk tilstedeværelse av en tetraploidy sjekkpunkt som fungerer gjennom p53 fortsatt kontroversielt 21-23.
Selv om ikke-transformerte polyploide celler som kan forplante in vitro er uunnværlig for detaljert analyse av kromosomal instabilitet og onkogene potensial polyploide celler, slike celler har så langt sjelden vært tilgjengelig. Vår protokoll gir en enkel og gjennomførbar metode for å etablere proliferativ tetraploide celler fra normale humane fibroblaster, som kan være en nyttig modell for å studere mekanismene som fører til transformasjon av polyploide menneskelige celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen å konkurrere økonomisk interesse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM-α | Sigma-Aldrich | M8042-500ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | 172012-500ML | |
| Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) | Sigma-Aldrich | D1925-10ML | |
| BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits | BD Biosciences | #340242 | For examination of DNA ploidy by flow cytometry |
| Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte | MetaSystems | #D-0125-060-DI | Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary |
| Isis imaging system with mFISH software | MetaSystems | Specialized probe kit is necessary |
References
- Rabinovitch, P., et al. Predictors of progression in Barrett's esophagus III: baseline flow cytometric variables. Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).
- Galipeau, P., et al. NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma. PLoS Med. 4 (2), e67 (2007).
- Olaharski, A., et al. Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis. Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).
- Liu, Y., et al. p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy. Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).
- Davoli, T., de Lange, T. The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
- Fox, D., Duronio, R. Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease. Development. 140, 3-12 (2013).
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437, 1043-1047 (2005).
- Ganem, N., et al. Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation. Cell. 158 (4), 833-848 (2014).
- Kuznetsova, A., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).
- Vindeløv, L., Christensen, I. Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis. Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).
- Darzynkiewicz, Z., Juan, G. DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis. Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5 (2001).
- Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. Chromosome analysis guidelines preliminary report. Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).
- Liehr, T., et al. Multicolor FISH probe sets and their applications. Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).
- Ohshima, S., Seyama, A. Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts. Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).
- Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Front. Oncol. 3, 198 (2013).
- Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts. Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).
- Di Leonardo, A., et al. DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function. Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).
- Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1. Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).
- Vogel, C., et al. Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy. Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).
- Aylon, Y., Oren, M.
- Uetake, Y., Sluder, G. Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a "tetraploidy checkpoint". J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).
- Ganem, N., Pellman, D.
- Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization. Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).
