Introduction
Polyploidy se ha observado no sólo en tejidos especializados de las especies de mamíferos, sino también en una variedad de condiciones patológicas, como el cáncer y las enfermedades degenerativas. Células poliploides (en su mayoría tetraploides) se observan a menudo en lesiones preneoplásicas de tejidos humanos, tales como esófago 1,2 o escamosas lesiones intraepiteliales de Barrett del cuello del útero 3,4, y se han considerado para ser la fuente de células aneuploides en los tejidos malignos 5 , 6. Aunque se sugiere que la conversión de tetraploide a las células aneuploides podría ser un evento crucial en las primeras etapas de la tumorigénesis, los mecanismos implicados en este proceso no se entienden completamente. Esto es en parte porque no hay un modelo in vitro ha estado disponible en las células humanas no transformadas pueden propagarse poliploides.
Algunos investigadores han inducido tetraploidia en las células epiteliales humanas no transformadas a través de la generación de células binucleadas por INHibiting citocinesis 7-9. En este método, sin embargo, las células diploides innecesarios deben ser eliminados por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) 7,8 o de clonación por dilución limitante 9. Debido a que estos procedimientos son laboriosos y no es fácil de realizar, métodos más simples para establecer se desean células tetraploides no transformadas para la investigación en este campo.
En el presente informe, se describe un protocolo para establecer células tetraploides de proliferación de fibroblastos humanos normales o fibroblastos humanos telomerasa inmortalizado por procedimientos relativamente simples. Los procedimientos utilizan husillo demecolcina veneno (DC) para detener las células diploides en la mitosis, las células mitóticas y recogidos por sacudiéndose se trata adicionalmente con CC. células mitóticas diploides tratados con DC durante un tiempo prolongado se convierten en células G1 tetraploides, y estas células proliferan como células tetraploides después de la detención del crecimiento durante varios días siguientes a la retirada de drogas. Este protocolo proporcionaun método eficiente para la creación de un modelo útil para estudiar la relación entre la inestabilidad cromosómica y el potencial oncogénico de células humanas poliploides.
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Protocol
1. Cultura de la célula
- Obtener las células para inducir tetraploidia. Hasta la fecha se ha confirmado que esta técnica se puede aplicar a las líneas celulares de fibroblastos humanos TIG-1, BJ, IMR-90 y inmortalizado-telomerasa TIG-1 (TIG-HT).
- Se cultivan las células en medio esencial mínimo con modificación α o cualquier otro medio de cultivo celular adecuado para el tipo de célula para ser estudiado suplementado con 10% (v / v) de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) por incubación en un 5% (v / v) atmósfera de CO2 a 37 ° C. células de paso cada 3 o 4 días que no exceda subconfluent densidad.
NOTA: El nivel de duplicación de la población (PDL) se debe calcular cada vez que en los pases para evaluar el crecimiento celular y la edad celular. PDL puede calcularse a partir del número de células se sembraron en un plato (N1) y el número de células cosechadas en la próxima pases (N2) utilizando la siguiente fórmula (X es el PDL inicial). PDL = X + (log N1 - N2 log) / log 2
2. Inducción y Establecimiento de células tetraploides a partir de fibroblastos diploides
- Inducir tetraploidia sin que se mueva-off.
NOTA: Algunas cepas de células (por ejemplo, TIG-1) puede llegar a ser casi completamente tetraploide por tratamiento continuo con demecolcina (DC) como sigue.- células paso a una o dos 100 mm platos en el día antes del tratamiento para inducir la tetraploidía. Por lo general, preparar 5 x 10 5 a 1 x 10 6 células por placa para la inducción de células tetraploides.
- Tratar las células en crecimiento exponencial con un medio que contiene 0,1 mg / ml de CC durante 4 días.
- Reemplazar DC que contienen medio con medio libre de fármaco e incubar las células en un 5% (v / v) CO 2 atmósfera a 37 ° C. Las células normalmente reanudan la proliferación dentro de 1 semana.
- Inducir tetraploidia con batido-off.
NOTA: La mayoría de las células se convierten en una mezcla de poblaciones diploides y tetraploides como consecuencia de la sencilla tratamiento con DC descrito anteriormente (2,1). Por lo tanto, algunas modificaciones de la pPROCEDIMIENTO para eliminar son necesarias una población diploide de la siguiente manera (Figura 1).- células de paso en varios matraces T75 el día antes del tratamiento para inducir tetraploidia. Por lo general, preparar al menos 5 x 10 6 células (1 x 10 6 células por frasco) para la inducción de células tetraploides.
- Tratar las células en crecimiento exponencial con un medio que contiene 0,1 mg / ml de CC durante 16 - 18 h para detener las células en la mitosis. El tiempo necesario para detener las células en la mitosis puede depender de las células diana y debe ser determinado por experimentos preliminares para obtener el mayor número de células mitóticas como sea posible. Por ejemplo, las células de crecimiento más lento deben ser tratados con DC por el tiempo más largo que las células que crecen más rápido.
NOTA: Si las células se tratan durante demasiado tiempo en este paso, se les podrá realizar el deslizamiento mitótico y se adhieren a la superficie del plato, lo que hace imposible para recoger células mitóticas por el movimiento de compensación en el siguiente paso. - Recoger las células mitóticas detenidos-DC por el método de agitación en off, en whICH células mitóticas ligeramente adheridas se recogieron por agitación suave de frascos y lavado con medio, seguido de centrifugación (300 xg, 5 min). Contar el número de células por un método apropiado en este paso.
- Resiembre células mitóticas recogidos en placas de cultivo de 60 mm y el tratamiento de las células con 0,1 mg / ml DC durante 3 días adicionales. Semillas más de 1 x 10 6 células mitóticas por placa, porque menos de 10% de las células puede sobrevivir a este tratamiento.
- Reemplazar DC que contienen medio con medio libre de drogas y esperar a que las células para reanudar la proliferación, que generalmente ocurre dentro de 1 semana.
- células Passage de manera similar a las células diploides originales.
3. Examen de la ploidía
NOTA: Este es un procedimiento bien establecido y un manual técnico debe ser referido a los procedimientos detallados y consejos técnicos.
- Cosecha células (5 x 10 5 - 1 x 10 6) por las células de incubación con una solución conque contiene 0,05% de tripsina y 0,02% de EDTA durante 10 minutos a 37 ° C, y neutralizar la tripsina por medio que contiene 10% de FBS.
- Centrifugar las células en medio y lavar por resuspensión en 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) seguido de centrifugación (300 xg, 5 min).
- Preparar las células para el análisis de ADN por uno de los dos métodos siguientes
- Un método para el análisis de las células no fijadas 10
NOTA: Este método se puede realizar usando un kit comercialmente disponible para el análisis del ciclo celular. Las muestras preparadas con este método deben ser analizadas inmediatamente, ya que las células no están fijadas en el procedimiento y se tiñeron los núcleos se dañe con el tiempo.- Lavar las células con tampón citrato 40 mM que contenía sacarosa 250 mM. Posteriormente tratar las células con 250 l de 0,1% (v / v) de Nonidet P40 y 30 mg / ml de tripsina en tampón citrato 200 l de 40 mM que contiene sacarosa 250 mM durante 10 min a temperatura ambiente.
- Añadir 200 l de 0,5 mg / ml de tripsina inhibitor células y 0,1 mg / ml de RNasa A en tampón citrato 40 mM que contenía sacarosa 250 mM, y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir 200 l de 0,4 mg / ml de yoduro de propidio (PI) en tampón citrato 40 mM que contenía sacarosa 250 mM, y se incuban las células durante 10 minutos a temperatura ambiente para teñir los núcleos celulares.
- Un método para el análisis de células fijadas
- Fijar las células con 80% de etanol en la suspensión de células en 1 ml de PBS, la adición de 4 ml de EtOH al 100%, gota a gota mientras que se mezcla la suspensión de células y dejándolo a temperatura ambiente durante 30 min. Las células en este fijador se pueden almacenar a -20 ° C durante varias semanas.
- Lavar las células mediante resuspensión en 5 ml de PBS, seguido de centrifugación (300 xg, 5 min). Tratar las células con 0,5 mg / ml de RNasa A y manchar con 50 mg / ml de yoduro de propidio (PI) (475 l de 0,5 mg / ml de RNasa A y 25 l de 1 mg / ml PI) durante 30 min a temperatura ambiente.
- Un método para el análisis de las células no fijadas 10
- Analizar el contenido de ADN de tque las células utilizando un citómetro de flujo con un láser de 488 nm y filtro de emisión del canal rojo (pase largo> 610 nm). Analizar una muestra de referencia preparada a partir de células diploides auténticos al mismo tiempo para evaluar la ploidía de las células diana.
- Alternativamente, añadir perlas de fluorescencia estándar para evaluar la relación de intensidad de fluorescencia de las células diploides frente a las perlas. Utilice la 'de altura de impulsos de anchura de impulso vs.' opción del citómetro de flujo para discriminar entre células tetraploides individuales y grupos de células diploides 11.
4. El examen de recuentos cromosómicos y análisis de cariotipo
NOTA: Todos estos son procedimientos bien establecidos y un manual técnico o los protocolos del fabricante deben ser referidos a los procedimientos detallados y consejos técnicos.
- Tratar las células en crecimiento exponencial con 0,1 mg / ml de CC durante 4 h para detener las células en metafase.
- Preparar en otro portaobjetos cromosómicos.
- Centrifugar las células en un medio (300 xg, 5 min) y se trata con una solución hipotónica (5 ml de KCl 0,075 M) a 37 ° C durante 10 minutos.
- Fijar y suspender las células en el fijador de Carnoy (metanol: ácido acético = 3: 1).
- Extender las células sobre un portaobjetos de vidrio por dejar caer un pequeño volumen (25 - 35 l) de la suspensión celular. Los pasos adicionales tales como la exposición a vapor caliente pueden ser necesarias para mejorar la difusión de los cromosomas.
- recuentos cromosómicos.
- las células se tiñen con solución de Giemsa al 5% (o 5 mg PI / ml que contenía 0,5 mg / ml de RNasa A para microscopía de fluorescencia) para 15 a 20 min.
- fotografiar digitalmente al menos 50 células en metafase.
- Contar el número de cromosomas por célula utilizando un análisis de imágenes software después de la separación manual de los cromosomas y tocar la superposición usando un software de edición de fotos. Aunque el número de cromosomas se puede marcar de forma manual, se recomienda la puntuación computarizada.
- análisis del cariotipo
NOTA: Este análisis debe ser realizado por un técnico capacitado o una empresa profesional.- Células de tinción de acuerdo con una técnica de bandeo G estándar 12.
- Analizar los cromosomas para hacer karyograms estándar 12.
- mFISH
NOTA: Este paso es opcional y debe realizarse si es necesario.- Las células de la mancha utilizando sondas FISH multicolor para los cromosomas humanos de acuerdo con el protocolo del fabricante 13.
- Analizar los cromosomas utilizando un microscopio de fluorescencia con filtros adecuados y un software para el análisis mFISH 13.
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Representative Results
En nuestra experiencia, las células TIG-1 se pueden hacer casi completamente tetraploide con un tratamiento continuo sencilla con 0,1 mg / ml de CC durante 4 días (Figura 2 A). Por el contrario, otras cepas de fibroblastos, tales como BJ o IMR-90, y las células TIG-HT, se convirtieron en una mezcla de diploides y poblaciones tetraploides siguiendo el mismo tratamiento, y el aislamiento de las células mitóticas por el método de agitación en off es necesario durante el curso de tratamiento DC (por lo general 16 a 18 h después del inicio del tratamiento) (figuras 2B, C). Después de un tratamiento adicional con DC durante 3 días, las células se sometieron a la detención del crecimiento y exhibieron grandes, aplanadas morfología durante varios días. Dentro de una semana, en general, las pequeñas células en proliferación aparecieron entre las grandes células aplanadas (Figura 3). Las células se volvieron casi completamente tetraploide en 2 - 3 semanas después del tratamiento DC. El número cromosómico modal en las células tetraploides establecidos fue de 92 en la mayoría de los casos, except que una de las líneas celulares establecidas a partir de células tetraploides TIG-HT tenían 91 cromosomas en la mayoría de las células (Figura 4). Las células tetraploides establecidos crecieron a casi la misma velocidad que las células diploides (Figura 5). Líneas de células tetraploides establecidas a partir de células no inmortalizadas mostraron una esperanza de vida replicativa aproximadamente igual medida que las células diploides originales, mientras que los de las células inmortalizadas parecía ser también inmortal (Figura 5). Las células tetraploides establecidos a partir de células TIG-1 no inmortalizadas mostraron un cariotipo normal, excepto por que tiene un número de cromosomas tetraploide (Figura 6 panel superior), mientras que los de inmortalizada TIG-1 (TIG-HT) células mostraron aberraciones clonales bastante complicadas (Figura 6 media y paneles inferiores). La frecuencia de aberraciones clonales en las últimas células (TIG-HT-4n) aumentó de 2,5 aberraciones por célula en 255 duplicación de la población niveles (PDL) a 5,2 aberraciones por célula en 450 PDLcon subcultivo repetido.
Figura 1: Ilustración esquemática del protocolo para la inducción de tetraploidia. Para obtener células tetraploides con mínima contaminación de células diploides, es necesario para la mayoría de las cepas de células (inferior ilustración) una combinación de mitótico sacudida-off y el tratamiento DC, mientras que algunas cepas de células (por ejemplo, TIG-1) pueden llegar a ser casi completamente tetraploide por tratamiento continuo con demecolcina (ilustración superior). 1) tratar las células en matraces T75 (al menos 5 x 10 6) con 0,1 mg / ml DC durante 16 - 18 h (tiempo debe ser determinada por experimentos preliminares) para detener las células en la mitosis. 2) Recoger las células mitóticas por el método de agitación en off y volver a sembrar en placas de 60 mm de cultivo. 3) tratar las células con 0,1 mg / ml DC durante 3 días adicionales. 4) Se incuban las células en medio libre de fármaco (por lo general las células reanudan proliferation dentro de 1 semana). Las barras de escala representan 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los histogramas de ADN de fibroblastos de antes y después de los tratamientos para la inducción de tetraploidia. (A) células TIG-1. Esta cepa célula se tetraploides por tratamiento continuo simple, con 0,1 mg / ml DC durante 4 días. Células (B) BJ. Debido a que esta cepa celular se convierte en una mezcla de poblaciones diploides y tetraploides después de un tratamiento sencillo con corriente continua (paneles de la izquierda), es necesario durante el tratamiento DC aislamiento de células mitóticas por sacudirse para establecer células tetraploides (paneles de la derecha). Células (C) TIG-HT (TIG-1-telomerasa inmortalizado). Estas células también tienen que estar preparados por un peine minación del tratamiento y agitar DC-off para el establecimiento de células tetraploides. Los números en los histogramas representan el tiempo (días) después de la eliminación del fármaco. La abscisa representa el contenido de ADN (C, complemento). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Las microfotografías representativas de células BJ tratados con DC. Células (A) BJ tratados con 0,1 mg / ml DC para 16 h. Muchas células detenidas en mitosis se pueden ver. (B) al final del tratamiento DC. Casi todas las células son de detención del crecimiento. (C) 7 días después del tratamiento DC. células proliferantes pequeñas entre las grandes células aplanadas se pueden ver. (D) 14 días después del tratamiento DC. Las células están creciendo activamente. e.com/files/ftp_upload/55028/55028fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Las fotomicrografías representativas de los cromosomas y los histogramas del número de cromosomas de las células tetraploides correspondientes a cada cepa de células. Paneles superior, media e inferior representan células tetraploides establecidas a partir de TIG-1 (2 semanas después del tratamiento DC), BJ (2 semanas después del tratamiento DC) y TIG-HT (7 semanas después del tratamiento DC) células respectivamente. Los cromosomas se puntuaron en al menos 50 metafases. Números en los histogramas son números modales cromosómicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 5: Perfiles de crecimiento de fibroblastos humanos representativos (células diploides) y las células tetraploides correspondientes a cada cepa de células. A la izquierda, centro y derecha paneles muestran perfiles de crecimiento de originales TIG-1, células BJ y TIG-HT (marcadores abiertos) y los de las células tetraploides correspondientes a cada cepa de células (marcadores cerrados). Las células se pasaron dos veces a la semana y PDL se calcularon a partir del número de células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Representante Karyograms por bandeo G y mFISH. El panel superior muestra una karyogram por bandas G de células tetraploides establecidas a partir de TIG-1 (2 semanas después del tratamiento DC). paneles medio e inferior muestrankaryograms por mFISH de células tetraploides establecidos a partir de células TIG-HT (15 y 41 semanas después del tratamiento DC). Cariotipos se basaron en 10 celdas (TIG-1) o 20 células (TIG-HT). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Un problema importante en la inducción de tetraploidía a partir de células diploides por agentes químicos, ya sea por los inhibidores de citocinesis o por inhibidores del huso, es que las células se vuelven a menudo una mezcla de poblaciones diploides y tetraploides, y las células tetraploides deben separarse de las células diploides. Los métodos más comunes para el aislamiento de una población tetraploide libre de células diploides utilizan FACS o la clonación por dilución limitante. Sin embargo, estos procedimientos son laboriosos y no es fácil de realizar. En este informe, se presenta un nuevo protocolo para establecer células tetraploides proliferativas libres de una población diploide a partir de fibroblastos humanos normales. El protocolo utiliza husillo veneno DC para detener células diploides en la mitosis, y detenido células mitóticas están separados por agitación-off a partir de células en interfase diploides, que se adhirieron a la superficie del plato. células recogidas se tratan con DC durante 3 días adicionales, y las células mitóticas diploides convierten a las células G1 tetraploides por este tratamiento prolongado DC presumiblemente by la adaptación de punto de control (también llamado deslizamiento mitótico). Estas células reiniciar el crecimiento de células como células tetraploides después de la detención del crecimiento durante varios días de la eliminación del fármaco.
Una ventaja de este método es que los procedimientos son relativamente simple y factible en comparación con aquellos que emplean FACS o de clonación para aislar células tetraploides. Limitaciones del método son los siguientes. Aplicabilidad a tipos de células distintos de los fibroblastos, tales como células epiteliales, se desconoce en la actualidad. Esto debe ser confirmado en estudios futuros. Una pequeña población diploide podría permanecer en algunos casos. Sin embargo, estas células tienden a disminuir con pasos en serie. Si una población diploide significativa persiste después del tratamiento DC, una mayor concentración de DC (1.2 a 1.5 g / ml) o un tratamiento más prolongado con DC después de la sacudida-off (4 días en lugar de 3 días) podrían mejorar el resultado.
Los pasos más críticos en este protocolo son los siguientes. En primer lugar, el tiempo de tratamiento con DC para unarresting células en la mitosis antes de batido-off es crítica. Aunque esta vez el tratamiento debe ser lo suficientemente largo para recoger la mayor cantidad de células mitóticas como sea posible, el tratamiento durante demasiado tiempo podría causar el deslizamiento mitótico y la adhesión a la superficie del plato, lo que hace imposible para recoger las células mitóticas por sacudirse. Debido a que un tiempo apropiado para la recuperación máxima de células mitóticas puede depender de las células diana, que debe ser determinada por experimentos preliminares. En segundo lugar, el paso sacudiéndose para separar las células mitóticas de las células en interfase es también crítico. En este paso, las células mitóticas diploides, que se adhieren libremente a la superficie del plato, se recogen por agitación suave de los matraces, seguido de centrifugación. Este movimiento de la mitótico-off separa células mitóticas detenidos por DC a partir de células en interfase adheridas que podrían ser el origen de la contaminación por la población diploide más tarde. Sacudiendo violentamente puede causar burbujeo del medio, lo que podría dañar las células, y también el desprendimiento de las células en interfase, resulting en la contaminación de las células diploides. Otro factor que puede afectar el éxito de este método es el medio de cultivo. Debido a la estimulación del crecimiento robusto parece ser necesario para la recuperación de la proliferación después del tratamiento DC, medio rico en nutrientes tales como MEM-α se debe utilizar para apoyar la proliferación de células tetraploides. El aumento de la concentración de FBS al 20% en la etapa final de la inducción de células tetraploides (2.2.5) también podría aumentar el éxito de este método.
El uso de este protocolo, tenemos hasta la fecha produce células tetraploides a partir de las cepas de fibroblastos humanos TIG-1, BJ, IMR-90 y la telomerasa inmortalizado-TIG-1 hasta ahora 14-16. Entre estas cepas de células, TIG-1 es bastante inusual ya que esta cepa celular se convierte casi completamente tetraploide cuando se tratan continuamente con DC, sin que se mueva-off, durante 4 días. La razón por la que sólo las células TIG-1 se convierten en completamente tetraploide como resultado de un tratamiento simple con DC se desconoce en la actualidad. posible explnaciones podría ser que una proporción significativa de células de otras detenciones tipos en fase G1 diploide cuando son tratados con DC y se reanuda la proliferación después del tratamiento, mientras que (1) las células TIG-1 no se detienen en G1 con el mismo tratamiento, o (2) una población de células TIG-1 detiene irreversiblemente en G1 bajo el mismo tratamiento y no se reanuda la proliferación a partir de entonces. En cualquier caso, las diferentes sensibilidades del punto de control G1 a CC pueden ser responsables de los diferentes comportamientos de las células después del tratamiento continuo con CC.
Al investigar la importancia etiológica de tetraploidia en la tumorigénesis, muchos investigadores tienen grandes preocupaciones sobre el estado del gen p53 en células tetraploides, ya que se ha propuesto que tetraploidia induce la detención del crecimiento dependiente de p53 de las células, lo que se denomina el "punto de control tetraploidia" 17-20. Si esta hipótesis es correcta, la señalización de p53 en la proliferación de células tetraploides debe ser inactivado. Sin embargo,las células tetraploides establecidos por nuestro protocolo parecen tener p53 funcional a pesar creciendo a casi la misma velocidad que las células diploides 15,16. La razón de esta discrepancia no se conoce en la actualidad, y la importancia de la inactivación de p53 en la proliferación de células tetraploides debe examinarse precisamente en futuros estudios. De hecho, la presencia de un puesto de control tetraploidia que funciona a través de p53 sigue siendo controvertido 21-23.
Aunque las células poliploides no transformados que pueden propagarse in vitro son indispensables para el análisis detallado de la inestabilidad cromosómica y el potencial oncogénico de células poliploides, estas células tienen hasta ahora rara vez ha estado disponible. Nuestro protocolo proporciona un método simple y factible establecer células tetraploides de proliferación de los fibroblastos humanos normales, que podrían ser un modelo útil para el estudio de los mecanismos que conducen a la transformación de las células humanas poliploides.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero en competencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM-α | Sigma-Aldrich | M8042-500ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | 172012-500ML | |
| Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) | Sigma-Aldrich | D1925-10ML | |
| BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits | BD Biosciences | #340242 | For examination of DNA ploidy by flow cytometry |
| Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte | MetaSystems | #D-0125-060-DI | Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary |
| Isis imaging system with mFISH software | MetaSystems | Specialized probe kit is necessary |
References
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