Introduction
Poliploidia è stata osservata non solo in tessuti specializzati di specie di mammiferi, ma anche in una varietà di condizioni patologiche, come il cancro e malattie degenerative. Poliploidi (per lo più tetraploide), le cellule sono spesso osservate nelle lesioni preneoplastiche di tessuti umani, come l'esofago 1,2 o squamose lesioni intraepiteliali di Barrett della cervice 3,4, e sono stati considerati per essere la fonte di cellule aneuploidi maligne in quei tessuti 5 , 6. Sebbene si suggerisce che la conversione di tetraploide di cellule aneuploidi potrebbe essere un evento cruciale nelle prime fasi della tumorigenesi, i meccanismi coinvolti in questo processo non sono pienamente compresi. Questo in parte perché nessun modello in vitro è stato disponibile dove non trasformate cellule umane poliploidi possono propagarsi.
Alcuni ricercatori hanno indotto tetraploidia in cellule epiteliali umane non trasformate attraverso la generazione di cellule binucleate di inhibiting cytokinesis 7-9. In questo metodo, tuttavia, le cellule diploidi inutili devono essere eliminate mediante fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) 7,8 o la clonazione limitando la diluizione 9. Dato che queste procedure sono laboriose e non facile da eseguire, i metodi più semplici per stabilire le cellule non trasformate tetraploide si desiderano per la ricerca in questo campo.
Nella presente relazione, si descrive un protocollo per stabilire le cellule proliferative tetraploide da fibroblasti umani normali o fibroblasti umani telomerasi-immortalata da procedure relativamente semplici. Le procedure vengono utilizzate mandrino veleno demecolcine (DC) per arrestare le cellule diploidi in mitosi, e le cellule mitotiche raccolti da scrollarsi di dosso sono ulteriormente trattati con DC. cellule mitotiche diploidi trattate con corrente continua per tempo prolungato convertire in cellule G1 tetraploide, e queste cellule proliferano le cellule come tetraploide dopo l'arresto della crescita per diversi giorni dopo la rimozione di droga. Questo protocollo prevedeun metodo efficiente per la creazione di un modello utile per studiare la relazione tra il cromosoma instabilità e il potenziale oncogeno di cellule umane poliploidi.
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Protocol
Cultura 1. cellulare
- Ottenere le cellule per indurre tetraploidia. Fino ad oggi è stato confermato che questa tecnica può essere applicata alle linee cellulari di fibroblasti umani TIG-1, BJ, IMR-90 e telomerasi immortalizzate TIG-1 (TIG-HT).
- Crescere le cellule in terreno minimo essenziale con modificazione α o qualsiasi altro mezzo di coltura cellulare adatto per il tipo di cellula da studiare supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino inattivato al calore (FBS) incubando in un 5% (v / v) di CO 2 nell'atmosfera a 37 ° C. cellule di passaggio ogni 3 o 4 giorni di non superare la densità subconfluenti.
NOTA: livello di raddoppio della popolazione (PDL) deve essere calcolato di volta in volta a passaging per valutare la crescita delle cellule e l'età delle cellule. PDL può essere calcolato dal numero di cellule seminate in una piastra (N1) e il numero di cellule raccolte al successivo passaging (N2) mediante la seguente formula (X è l'iniziale PDL). PDL = X + (log N1 - N2 log) / log 2
2. Induzione e Establishment di cellule tetraploidi da diploidi fibroblasti
- Indurre tetraploidia senza shake-off.
NOTA: Alcuni ceppi di cellule (ad esempio TIG-1) può diventare quasi completamente tetraploide dal trattamento continuo con demecolcine (DC) come segue.- cellule passaggio nella uno o due piatti di 100 mm il giorno prima del trattamento per indurre tetraploidia. Di solito, preparare 5 x 10 5 a 1 x 10 6 cellule per piatto per l'induzione delle cellule tetraploidi.
- Il trattamento di cellule in crescita esponenziale con mezzo contenente 0,1 mg / ml DC per 4 giorni.
- Sostituire DC contenenti media con terreno privo di droga e incubare cellule in un 5% (v / v) di CO 2 atmosfera a 37 ° C. Le cellule di solito riprendono proliferazione entro 1 settimana.
- Indurre tetraploidia con shake-off.
NOTA: La maggior parte delle cellule diventano una miscela di popolazioni diploidi e tetraploidi come risultato del semplice trattamento con DC sopra descritto (2.1). Pertanto, alcune modifiche della pROCEDURA per eliminare sono necessarie una popolazione diploide come segue (Figura 1).- cellule Passage in diverse T75 Borraccie il giorno prima del trattamento per indurre tetraploidia. Solitamente, preparare almeno 5 x 10 6 cellule (1 x 10 6 cellule per pallone) per l'induzione di cellule tetraploidi.
- Il trattamento di cellule in crescita esponenziale con mezzo contenente 0,1 mg / ml DC per 16 - 18 h per arrestare le cellule in mitosi. Il tempo necessario per arrestare le cellule in mitosi può dipendere da cellule bersaglio e deve essere determinato da esperimenti preliminari per ottenere il maggior numero di cellule in mitosi possibile. Ad esempio, le cellule che crescono più lenti devono essere trattati con DC per un tempo più lungo di cellule in crescita più veloce.
NOTA: Se le cellule vengono trattate per troppo tempo in questa fase, potrebbero subire lo slittamento mitotico e aderire alla superficie piatto, rendendo impossibile per raccogliere le cellule in mitosi di shake-off nella fase successiva. - Raccogliere le cellule in mitosi DC-arrestati con il metodo shake-off, in which cellule mitotiche liberamente aderito sono raccolti da un leggero scuotimento di flaconi e lavaggio con media seguita da centrifugazione (300 xg, 5 min). Contare il numero di cellule in modo appropriato in questa fase.
- Reseed cellule mitotiche raccolti in capsule di Petri da 60 mm e il trattamento di cellule con 0,1 mg / ml DC per altri 3 giorni. Seed più di 1 x 10 6 cellule mitotiche per piatto, perché meno del 10% delle cellule può sopravvivere a questo trattamento.
- Sostituire DC contenenti media con media libera dalla droga e aspettare che le cellule a riprendere la proliferazione, che di solito si verifica entro 1 settimana.
- cellule di passaggio in modo simile alle cellule diploidi originali.
3. Esame del DNA Ploidia
NOTA: Questa è una procedura consolidata e un manuale tecnico deve essere affidata a procedure dettagliate e suggerimenti tecnici.
- Celle di raccolta (5 x 10 5 - 1 x 10 6) dalle cellule incubazione con una soluzione concontenente 0,05% tripsina e 0,02% EDTA per 10 min a 37 ° C, e neutralizzare tripsina da medium contenente 10% FBS.
- Centrifugare le cellule a medio e lavarli risospendendo in 5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), seguita da centrifugazione (300 xg, 5 min).
- Preparare cellule per analisi del DNA da uno dei seguenti due metodi
- Un metodo per analizzare le cellule non fissate 10
NOTA: Questo metodo può essere eseguita utilizzando un kit disponibile in commercio per l'analisi del ciclo cellulare. I campioni preparati con questo metodo dovrebbero essere analizzati immediatamente, perché le cellule non sono fissi nella procedura e colorate nuclei diventeranno danneggiato nel corso del tempo.- Lavare le cellule con 40 mm tampone citrato contenente 250 mm di saccarosio. Successivamente il trattamento di cellule con 250 ml di 0,1% (v / v) Nonidet P40 e 30 mg / ml di tripsina in 200 ml di 40 mM tampone citrato contenente 250 mM di saccarosio per 10 min a temperatura ambiente.
- Aggiungere 200 ml di 0,5 mg / ml inh tripsinacellule ibitor e 0,1 mg / ml RNasi A a 40 mm tampone citrato contenente 250 mm di saccarosio, e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 200 ml di 0,4 mg / ml di ioduro di propidio (PI) in tampone citrato 40mM, contenente 250 mM di saccarosio, e incubare le cellule per 10 min a temperatura ambiente per colorare nuclei cellulari.
- Un metodo per analizzare cellule fissate
- Fissare le cellule con 80% etanolo sospendendo cellule in 1 ml di PBS, aggiungere 4 ml di EtOH 100% goccia a goccia sotto agitazione la sospensione cellulare e lasciandolo a temperatura ambiente per 30 min. Le cellule in questo fissativo possono essere conservati a -20 ° C per diverse settimane.
- Lavare le cellule da essi risospendere in 5 ml di PBS seguita da centrifugazione (300 xg, 5 min). Trattare cellule con 0,5 mg / ml RNasi A e macchiare con 50 ug / ml di ioduro di propidio (PI) (475 ml di 0,5 mg / ml RNasi A e 25 ml di 1 mg / mL PI) per 30 min a temperatura ambiente.
- Un metodo per analizzare le cellule non fissate 10
- Analizzare contenuto di DNA di tegli cellule utilizzando un citofluorimetro con un laser 488 nm e filtro del canale rosso (passare lungo> 610 nm). Analizzare un campione di riferimento preparata da cellule diploidi originali allo stesso tempo di valutare ploidia delle cellule bersaglio.
- In alternativa, aggiungere perline standard di fluorescenza per valutare il rapporto tra intensità di fluorescenza delle cellule diploidi contro le perline. Utilizzare il 'altezza degli impulsi di larghezza di impulso contro' opzione del citofluorimetro di discriminare tra cellule tetraploide singole e gruppi di cellule diploidi 11.
4. Esame dei Conti cromosomiche e analisi del cariotipo
NOTA: Queste sono tutte le procedure consolidate e un manuale tecnico o di protocolli del produttore dovrebbero essere indicati per le procedure dettagliate e suggerimenti tecnici.
- Il trattamento di cellule in crescita esponenziale con 0,1 mg / ml DC per 4 ore per arrestare le cellule in metafase.
- Preparare vetrini cromosomiche.
- Centrifugare le cellule in terreno (300 xg, 5 min) e trattare con soluzione ipotonica (5 mL di 0,075 M KCl) a 37 ° C per 10 min.
- Fissare e di sospendere le cellule in fissativo di Carnoy (metanolo: acido acetico = 3: 1).
- Stendere le cellule su un vetrino facendo cadere un piccolo volume (25 - 35 ml) di sospensione cellulare. potrebbero essere necessarie misure aggiuntive, come l'esposizione al vapore caldo per migliorare cromosoma diffusione.
- conta cromosomiche.
- cellule macchia con soluzione Giemsa 5% (o 5 mg / mL PI contenente 0,5 mg / ml RNasi A per microscopia a fluorescenza) per 15 - 20 min.
- fotografare digitalmente almeno 50 cellule in metafase.
- Contare il numero dei cromosomi per cella utilizzando un softwa analisi delle immaginire dopo la separazione manuale di toccare e sovrapponendo i cromosomi utilizzando un software di fotoritocco. Anche se il numero dei cromosomi può essere segnata manualmente, si consiglia di punteggio computerizzato.
- analisi del cariotipo
NOTA: Questa analisi deve essere eseguita da un tecnico qualificato o di una società di professionisti.- Cellule Stain secondo una tecnica G-banding standard di 12.
- Analizzare i cromosomi per fare karyograms standard da 12.
- mFISH
NOTA: Questo passaggio è facoltativo e dovrebbe essere eseguita se necessario.- Cellule macchia con sonde FISH multicolore di cromosomi umani secondo il protocollo 13 del produttore.
- Analizzare i cromosomi utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di filtri idonei e di un software per l'analisi mFISH 13.
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Representative Results
Nella nostra esperienza, cellule TIG-1 possono essere realizzati quasi completamente tetraploid per semplice trattamento continuo con 0,1 mg / mL DC per 4 giorni (Figura 2A). Al contrario, altri ceppi di fibroblasti, come BJ o IMR-90, e le cellule TIG-HT, è diventato una miscela di diploide e popolazioni tetraploidi seguito lo stesso trattamento, e l'isolamento di cellule mitotiche con il metodo shake-off è necessario durante il corso di trattamento DC (di solito 16 - 18 h dopo l'inizio del trattamento) (figure 2B, C). Dopo un trattamento aggiuntivo con DC per 3 giorni, le cellule sottoposti arresto della crescita ed esposti grandi, appiattite morfologia per diversi giorni. Entro una settimana in generale, piccole cellule proliferanti apparvero tra le grandi cellule appiattite (Figura 3). Le cellule sono diventate quasi completamente tetraploide in 2 - 3 settimane dopo il trattamento DC. Il numero modale dei cromosomi nelle cellule tetraploide stabiliti era 92 nella maggior parte dei casi, except che una delle linee di cellule tetraploidi stabiliti dalle cellule TIG-HT aveva 91 cromosomi nella maggior parte delle cellule (Figura 4). Cellule tetraploide stabiliti sono cresciute quasi allo stesso tasso cellule diploidi (Figura 5). Linee cellulari tetraploide stabiliti dalle cellule immortalizzate non hanno mostrato una durata replicativa approssimativamente uguale come le cellule diploidi originali, mentre quelli da cellule immortalizzate sembrava essere anche immortale (Figura 5). Cellule tetraploide stabiliti da non immortalato TIG-1 le cellule hanno mostrato un cariotipo normale tranne che per avere un numero di cromosomi tetraploide (Figura 6 pannello superiore), mentre quelli da immortalati TIG-1 (TIG-HT), le cellule mostravano aberrazioni clonali piuttosto complicati (Figura 6 centrale e pannelli inferiori). La frequenza di aberrazioni clonali nelle ultime cellule (TIG-HT-4N) è aumentato da 2,5 aberrazioni per cellula a 255 popolazione raddoppiare livelli (PDL) a 5,2 aberrazioni per cellula a 450 PDLcon ripetuti sottocultura.
Figura 1: Schema Illustrazione del protocollo per l'induzione della tetraploidia. Per ottenere cellule tetraploidi di contaminazione minima di cellule diploidi, una combinazione di mitotico shake-off e il trattamento DC è necessario per la maggior parte dei ceppi cellulari (inferiore illustrazione), mentre alcuni ceppi cellulari (es TIG-1) possono diventare quasi completamente tetraploid sotto trattamento continuo con demecolcine (illustrazione in alto). 1) il trattamento di cellule in fiasche T75 (almeno 5 x 10 6) con 0,1 mg / ml DC per 16 - 18 h (questa volta dovrebbe essere determinato da esperimenti preliminari) per arrestare le cellule in mitosi. 2) Raccogliere le cellule in mitosi con il metodo shake-off e reseed in 60 capsule di Petri mm. 3) trattare cellule con 0,1 mcg / mL DC per altri 3 giorni. 4) incubare cellule in terreno drug-free (di solito le cellule riprendono proliferation entro 1 settimana). Barre di scala rappresentano il 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: DNA istogrammi dei fibroblasti Prima e dopo i trattamenti per l'induzione della tetraploidia. (A) TIG-1 cellule. Questo ceppo cellula diventa Tetraploide per semplice trattamento continuo con 0,1 mg / mL DC per 4 giorni. Cellule (B) BJ. Perché questo ceppo cellulare diventa un misto di popolazioni diploidi e tetraploidi seguente semplice trattamento con la DC (pannelli a sinistra), l'isolamento delle cellule mitotiche agitando off è necessario durante il trattamento DC per stabilire le cellule tetraploide (pannelli a destra). (C) TIG-HT (telomerasi-immortalato TIG-1), le cellule. Queste cellule devono anche essere preparato da un pettine inazione del trattamento DC e agitare-off per la creazione di cellule tetraploidi. Numeri di istogrammi rappresentano il tempo (giorni) dopo la rimozione di droga. L'ascissa rappresenta il contenuto di DNA (C, complemento). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: microfotografie rappresentativi di cellule BJ trattati con DC. Cellule (A) BJ trattati con 0,1 mg / mL DC per 16 h. Molte cellule arrestate in mitosi può essere visto. (B) La fine del trattamento DC. Quasi tutte le cellule sono la crescita arrestato. (C) 7 giorni dopo il trattamento DC. Piccole cellule proliferanti tra grandi cellule appiattite può essere visto. (D) 14 giorni dopo il trattamento DC. Le cellule sono in attiva crescita. e.com/files/ftp_upload/55028/55028fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: microfotografie rappresentativi dei cromosomi e istogrammi di cromosoma numero di celle tetraploide ricavato in ogni ceppo cellulare. Top, pannelli centrali e inferiore rappresentano le cellule tetraploidi stabiliti dal TIG-1 (2 settimane dopo il trattamento DC), BJ (2 settimane dopo il trattamento DC) e TIG-HT (7 settimane dopo il trattamento DC), le cellule rispettivamente. I cromosomi sono stati segnati in almeno 50 metafasi. Numeri a istogrammi sono numeri modale dei cromosomi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 5: Profili di crescita rappresentativi di fibroblasti umani (cellule diploidi) e le cellule tetraploide Fondata da ogni ceppo cellulare. Sinistra, centro e pannelli di destra mostrano profili di crescita di originale TIG-1, le cellule BJ e TIG-HT (marcatori aperti) e quelli delle cellule tetraploidi stabilito da ogni ceppo di cellule (chiuso marcatori). Le cellule sono state diversi passaggi due volte a settimana e PDL sono stati calcolati dal numero di cellule. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Rappresentante Karyograms da G-banding e mFISH. Pannello superiore mostra una cariogramma da G-banding di cellule tetraploidi stabiliti dal TIG-1 (2 settimane dopo il trattamento DC). pannelli centro e in basso mostranokaryograms di mFISH per celle tetraploide stabiliti dalle cellule TIG-HT (15 e 41 settimane dopo il trattamento DC). Cariotipo erano basati su 10 celle (TIG-1) o 20 celle (TIG-HT). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Un grave problema nel induzione di tetraploidia da cellule diploidi di agenti chimici, sia da inibitori Citochinesi o con inibitori del fuso, è che le cellule diventano spesso un miscuglio di popolazioni diploidi e tetraploidi, e le cellule tetraploidi devono essere separati dalle cellule diploidi. approcci più comuni per l'isolamento di una popolazione tetraploide privo di cellule diploidi utilizzano FACS o clonazione, limitando la diluizione. Tuttavia, queste procedure sono laboriosa e non facile da eseguire. In questo rapporto, vi presentiamo un nuovo protocollo per stabilire le cellule proliferative tetraploide gratuitamente una popolazione diploide da fibroblasti umani normali. Il protocollo utilizza mandrino DC veleno per arrestare cellule diploidi in mitosi, e arrestato cellule mitotiche sono separati da scuotere-off dalle cellule interfase diploide, che hanno aderito alla superficie piatto. cellule raccolte sono trattati con DC per altri 3 giorni, e le cellule in mitosi diploidi convertono alle cellule G1 tetraploide da questo trattamento DC prolungato presumibilmente by checkpoint adattamento (chiamato anche mitotico slittamento). Queste cellule riavviare la crescita delle cellule come le cellule tetraploide dopo l'arresto di crescita per diversi giorni di rimozione di droga.
Un vantaggio di questo metodo è che le procedure sono relativamente semplici e realizzabili rispetto a quelli utilizzanti FACS o clonazione per isolare le cellule tetraploidi. Limitazioni del metodo sono i seguenti. Applicabilità ai tipi di cellule diverse da fibroblasti, come le cellule epiteliali, è attualmente conosciuto. Questo dovrebbe essere confermato in studi futuri. Una piccola popolazione diploide potrebbe rimanere in alcuni casi. Tuttavia, queste cellule tendono a diminuire con passaggio in serie. Se una significativa popolazione diploide persiste dopo il trattamento DC, una maggiore concentrazione di DC (1,2 - 1.5 mg / ml) o di trattamento più lungo con DC dopo il shake-off (4 giorni invece di 3 giorni) potrebbe migliorare il risultato.
Le fasi più critiche in questo protocollo sono i seguenti. In primo luogo, tempo di trattamento con DC per unrresting cellule in mitosi prima shake-off è critica. Anche se questa volta il trattamento dovrebbe essere abbastanza a lungo per raccogliere il maggior numero cellule in mitosi possibile, trattare troppo a lungo potrebbe causare lo slittamento mitotico e l'adesione alla superficie piatto, rendendo impossibile raccogliere le cellule in mitosi agitando off. Poiché un tempo appropriato per il massimo recupero di cellule mitotiche può dipendere dalle cellule bersaglio, deve essere determinato da esperimenti preliminari. In secondo luogo, il passo scrolla di dosso per separare le cellule in mitosi da cellule in interfase è anche critico. In questa fase, le cellule mitotiche diploide, che sono liberamente aderito alla superficie piatto, sono raccolti da un leggero scuotimento dei fiaschi seguita da centrifugazione. Questo mitotico shake-off separa le cellule in mitosi arrestati dalla DC da cellule interfase aderito che potrebbero essere l'origine della contaminazione da parte della popolazione diploide tardi. Agitazione violentemente può causare gorgogliamento del mezzo, che potrebbe danneggiare le cellule, e anche il distacco delle cellule interfase, resulting contaminazione di cellule diploidi. Un altro fattore che può influenzare il successo di questo metodo è il terreno di coltura. Poiché robusta stimolazione della crescita sembra essere necessaria per il recupero di proliferazione dopo il trattamento DC, medio nutriente come MEM-α dovrebbe essere utilizzato per sostenere la proliferazione di cellule tetraploidi. Aumentando la concentrazione FBS al 20% nella fase finale di induzione di cellule tetraploidi (2.2.5) potrebbe anche aumentare il successo di questo metodo.
Usando questo protocollo, abbiamo fino ad oggi ha prodotto le cellule tetraploidi dai ceppi di fibroblasti umani TIG-1, BJ, IMR-90 e telomerasi-immortalata TIG-1 fino ad ora 14-16. Tra questi ceppi cellulari, TIG-1 è piuttosto insolito, perché questo ceppo cellulare diventa quasi completamente tetraploide se trattati continuamente con corrente continua, senza shake-off, per 4 giorni. Il motivo per cui solo le cellule TIG-1 diventano completamente tetraploid a seguito di semplice trattamento con DC è attualmente nota. a fornire i chiarimenti possibilinazioni potrebbe essere che una percentuale significativa di cellule di altri tipi arresti in fase G1 diploide quando trattati con DC e riprende proliferazione dopo il trattamento, che (1) cellule TIG-1 non arrestano in G1 con lo stesso trattamento, oppure (2) un popolazione di TIG-1 le cellule arresti irreversibilmente al G1 sotto lo stesso trattamento e non riprende la proliferazione in seguito. In ogni caso, diverse sensibilità del punto di controllo G1 a DC potrebbero essere responsabili per i diversi comportamenti delle cellule dopo il trattamento continuo con DC.
Quando si indaga il significato eziologico della tetraploidia nella tumorigenesi, molti ricercatori hanno grande preoccupazione per lo stato del gene p53 nelle cellule tetraploidi, perché è stato proposto che tetraploidia induce la crescita arresto p53-dipendente delle cellule, che viene definito il "posto di blocco tetraploidia" 17-20. Se questa ipotesi è corretta, la segnalazione di p53 in cellule proliferanti tetraploide dovrebbe essere inattivato. Però,cellule tetraploide stabiliti dal nostro protocollo sembrano avere p53 funzionale nonostante la crescente quasi allo stesso tasso cellule diploidi 15,16. La ragione di questa discrepanza non è noto al momento, e il significato di p53 inattivazione nella proliferazione delle cellule tetraploidi dovrebbe essere esaminata proprio in studi futuri. Infatti, la presenza di un punto di controllo tetraploidy che funziona attraverso p53 rimane controverso 21-23.
Anche se le cellule poliploidi non trasformate che può propagarsi in vitro sono indispensabili per l'analisi dettagliata delle instabilità cromosomica e il potenziale oncogeno di cellule poliploidi, queste cellule hanno finora raramente stato disponibile. Il nostro protocollo fornisce un metodo semplice e fattibile per stabilire le cellule proliferative tetraploide da fibroblasti umani normali, che potrebbe essere un utile modello per lo studio dei meccanismi che portano alla trasformazione di cellule umane poliploidi.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario in competizione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM-α | Sigma-Aldrich | M8042-500ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | 172012-500ML | |
| Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) | Sigma-Aldrich | D1925-10ML | |
| BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits | BD Biosciences | #340242 | For examination of DNA ploidy by flow cytometry |
| Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte | MetaSystems | #D-0125-060-DI | Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary |
| Isis imaging system with mFISH software | MetaSystems | Specialized probe kit is necessary |
References
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