Introduction
Poliploid memeli türlerinin özel dokularda değil, aynı zamanda kanser ve dejeneratif hastalıklar gibi patolojik durumlar, çeşitli sadece gözlenmiştir. Polyploid (çoğunlukla tetraploid) hücreleri genellikle serviks 3,4 Barrett özofagus 1,2 veya skuamöz intraepitelyal lezyonlar gibi insan dokularının preneoplastik lezyonlar gözlenir ve bu dokularda 5 malign anöploidi hücrelerin kaynağı olarak kabul edilmiştir 6. o Anöploid hücrelere tetraploid dönüşüm tümörigenezinin erken evrelerinde çok önemli bir olay olabileceğini öne olmasına rağmen, bu süreçte yer alan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu dönüştürülmemiş polyploid insan hücreleri yaymak nerede hiçbir in vitro model mevcut olmuştur kısmen çünkü.
Bazı araştırmacılar inh ile binükleer hücrelerin üretilmesi dönüştürülmemiş insan epitel hücrelerinde tetraploidi indüklenensitokinezi 7-9 ibiting. Bu yöntemde, bununla birlikte gereksiz diploit hücreleri 7,8 floresans ile aktive edilen hücre tasnif (FACS) ile elimine edilmelidir veya seyreltme 9 sınırlandırılmasıyla klonlama. Bu işlemler gerçekleştirmek için kolay zahmetli ve olmadığından, basit yöntemler dönüştürülmemiş tetraploid hücreler bu alanda araştırma için istenen kurmak.
Bu raporda, biz nispeten basit prosedürlerle normal insan fibroblast veya telomeraz-ölümsüzleştirilmiş insan fibroblastlar gelen proliferatif tetraploid hücreler kurmak için bir protokol açıklar. prosedürler ayrıca DC ile tedavi edilir kapalı sallayarak tarafından toplanan mitoz diploid hücreleri ve mitotik hücrelerin tutuklama mili zehir demekolsin (DC) kullanın. uzun süreli DC ile tedavi diploid mitotik hücreler tetraploid G1 hücrelere dönüştürmek ve bu hücreler ilaç çıkarılmasını takiben birkaç gün süreyle büyüme tutuklanmasının ardından da tetraploid hücreler çoğalırlar. Bu protokol sağlarkromozom istikrarsızlık ve poliploid insan hücrelerinin onkojenik potansiyeli arasındaki ilişkiyi incelemek için yararlı bir model oluşturmak için etkili bir yöntem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre Kültürü
- Tetraploidi ikna etmek için hücre elde. Bugüne kadar tekniğin insan fibroblast hücre hatları TIG 1, BJ, IMR-90 ve telomeraz-ölümsüzleştirdi TIG-1 (TIG-HT) uygulanabilir olduğu teyit edilmiştir.
- α değiştirme veya% 10 (h / h)% 5, inkübasyon yolu ile ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) (V / ile takviye incelenecek hücre tipi için uygun herhangi bir başka hücre kültür ortamı ile minimum temel ortam içinde hücreler büyümek h) CO, 37 ° C'de 2 atmosfer. Passage hücreleri SUBCONFLUENT yoğunluğunu aşmak için her 3 ya da 4 gün değil.
NOT: Nüfus katlama seviyesi (PDL) hücre büyümesini ve hücre yaşı değerlendirmek için Pasajlanması her zaman hesaplanmalıdır. PDL bir tabak (N1) ve aşağıdaki formül (X Başlangıç PDL olan) kullanılarak aşağıdaki pasaj (N2) hasat hücre sayısı tohumlanmış hücre sayısı hesaplanabilir. PDL = X + (N1 log - N2 log) / 2 log
2. İndüksiyon ve EstaDiploid fibroblastlardan Tetraploid Hücrelerin blishment
- shake-off olmadan tetraploidi neden olur.
NOT: Bazı hücre suşları (örn TIG 1) aşağıdaki gibi demekolsin (DC) ile neredeyse tamamen tetraploid sürekli tedavi ile olabilir.- İşlemden önceki gün, bir ya da iki 100 mm çanağı içine Geçiş hücreleri tetraploidi uyarılması için. Genellikle, tetraploid hücrelerin uyarılması için tabak başına 5 x 10 5 6 10 x 1 hücreleri hazırlamak.
- 4 gün boyunca 0.1 mg / ml DC ihtiva eden ortam ile üslü olarak büyüyen hücre tedavi edin.
- Ilaç barındırmayan ortam ile orta DC ihtiva takın ve 37 ° C'de (h / h) CO2 atmosferinde% 5 hücreleri inkübe edin. Hücreler genellikle 1 hafta içinde çoğalmasını devam.
- shake-off ile tetraploidi neden olur.
Not: çoğu hücre DC ile işlenerek bir sonucu olarak, diploid ve tetraploid popülasyonlarının bir karışımı, yukarıda (2.1) 'de tarif olur. p Bu nedenle, bazı modifikasyonlarrocedure (Şekil 1) şu şekilde diploid popülasyon gerekli ortadan kaldırmak için.- Birkaç T75 içine Passage hücreleri Tetraploidi ikna etmek için tedaviden önce bir gün şişeleri. Genellikle, tetraploid hücrelerin uyarılması için en az 5 x 10 6 hücre (kap başına 1 x 10 6 hücre) hazırlar.
- mitoz hücreleri yakalama 18 saat - 16 0.1 ug / mL DC ihtiva eden ortam ile üslü olarak büyüyen hücre tedavi edin. mitozda hücre durdurmak için gerekli zaman hedef hücreler üzerinde bağlı olabilir ve mümkün olduğu kadar çok mitotik hücreleri elde etmek için ön deneyler ile tespit edilmelidir. Örneğin, daha yavaş büyüyen hücreler daha hızlı büyüyen hücreler daha uzun bir süre için DC ile muamele edilmelidir.
NOT: Hücreler çok uzun bu adımda tedavisi, bunlar mitotik kaymayı tabi olabilir ve imkansız bir sonraki adımda shake-off mitotik hücreleri toplamak için yapım, çanak yüzeyine yapışır. - wh, titreme-off yöntemi ile DC-tutuklandı mitotik hücreler toplayınIch gevşek yapışmış mitotik hücre ardından santrifüj şişeleri ve ortam ile yıkama hafifçe çalkalanarak (300 xg 5 dakika) ile toplanır. Bu adımda, uygun bir yöntem ile, hücre sayısı.
- 60 mm kültür çanakları içine alınır mitotik hücre kalkarlar ve bir 3 gün daha 0.1 ug / ml DC hücreleri tedavi. Hücrelerin en az% 10 bu tedavi hayatta için, çanak başına en fazla 1 x 10 6 mitotik hücre tohumu.
- ilaçsız ortamla orta içeren-DC değiştirin ve hücreler genellikle 1 hafta içinde meydana çoğalmasını, devam etmek için bekleyin.
- Benzer orijinal diploid hücrelere geçmesine hücreleri.
DNA ploidisi 3. incelenmesi
NOT: Bu iyi kurulmuş bir prosedürdür ve bir teknik el kitabı ayrıntılı prosedürler ve teknik ipuçları için sevk edilmelidir.
- Hasat hücreleri (5 x 05-01 Ekim x 10 6) bir çözeltisi con inkübe hücrelerin37 ° C'de 10 dakika boyunca% 0.05 tripsin ve% 0.02 EDTA taining ve% 10 FBS içeren ortamda tripsin nötralize eder.
- ortam içinde Santrifüj hücreleri ve santrifüj (300 xg 5 dakika), ardından fosfat tamponlu tuz 5 mL (PBS) içinde yeniden süspanse edilerek yıkayın.
- Aşağıdaki iki yöntemden biri ile DNA analizi için hücreleri hazırlamak
- Sabitlenmemiş hücreleri 10 analiz etmek için bir yöntem olup
Not: Bu yöntem, hücre döngüsü analizi için ticari olarak mevcut bir kit kullanılarak gerçekleştirilebilir. Hücreler prosedüründe sabit ve çekirdekler zamanla hasar olacak lekeli değildir çünkü bu yöntemle hazırlanan numuneler, derhal analiz edilmelidir.- 250 mM sukroz ihtiva eden 40 mM sitrat tampon maddesi ile hücreleri yıkayın. Daha sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 mM sukroz ihtiva eden 200 uL 40 mM sitrat tamponu içerisinde% 0.1 (h / h) Nonidet P40 ve 30 ug / ml tripsin 250 uL hücre tedavisi.
- 0.5 ug / ml tripsin inh 200 mcLOda sıcaklığında 10 dakika boyunca ibitor 250 mM sukroz ihtiva eden 40 mM sitrat tampon maddesi içinde 0.1 ug / ml RNase A ve inkübe hücreleri.
- 0.4 mg, 200 uL ekleyin / 250 mM sukroz ihtiva eden 40 mM sitrat tamponu içerisinde ml propidium iodide (PI) ve hücre çekirdekleri leke, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hücreler inkübe edin.
- Sabit hücreleri analiz etmek için bir yöntem olup
- hücre süspansiyonu karıştırarak 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bırakılarak% 100 EtOH damla damla 4 mL ekleme 1 mL PBS içinde süspansiyona% 80 etanol ile hücreleri saptamak. Bu sabitleyici hücreler birkaç hafta -20 ° C'de saklanabilir.
- 5 ml PBS bunları yeniden süspanse hücreleri yıkanır, santrifüj (300 xg 5 dakika) eklenir. 0.5 mg / ml RNase A hücreleri tedavi ve 50 ug / ml propidyum iyodid (PI) (0.5 mg / ml RNase A 475 uL ve 1 mg 25 ul / ml PI), oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ile boyanır.
- Sabitlenmemiş hücreleri 10 analiz etmek için bir yöntem olup
- t DNA içeriğini analizo bir 488 nm lazer ve kırmızı kanal emisyon filtresi ile debi sitometresinde hücreleri (uzun> 610 nm pass). hedef hücrelerin ploidisi değerlendirmek için, aynı zamanda, gerçek diploid hücrelerinden hazırlanan referans bir örnek analiz edin.
- Seçenek olarak ise, diploid hücrelerin genel boncuk floresans yoğunluğu oranını değerlendirmek için floresan standart boncuk ekleyin. Sitometresi tek tetraploid hücreler ve diploid hücrelerin 11 kümeleri arasında ayrım yapmak akış seçeneği 'darbe genişliği vs darbe yüksekliği' kullanın.
Kromozom sayar ve Karyotip Analizi 4. Sınav
NOT: Bunlar köklü prosedürler ve teknik manuel veya üreticinin protokolleri ayrıntılı prosedürler ve teknik ipuçları için sevk edilmelidir.
- metafaz hücreleri yakalama 4 saat 0.1 ug / mL DC büyüyen hücreler tedavi edin.
- kromozom slaytlar hazırlayın.
- ortam içinde Santrifüj hücreleri (300 xg 5 dakika) ve 10 dakika boyunca 37 ° C'de hipotonik bir solüsyon (0.075 M KCI 5 mL) ile muamele.
- Düzeltmek ve Carnoy sabitleştirici hücrelerin süspansiyonu (metanol: asetik asit = 3: 1).
- Hücre süspansiyonu - (35 uL 25), küçük bir hacim bırakarak bir cam slayt üzerine hücreleri yayıldı. Böyle sıcak buhara maruz kalma gibi ek adımlar yayılan kromozom iyileştirmek için gerekli olabilir.
- Kromozom sayıları.
- 20 dakika -% 5 Giemsa çözeltisi (veya floresan mikroskopi için 0.5 mg / ml RNase A ihtiva eden 5 ug / ml PI) 15 ile leke hücreleri.
- Dijital en az 50 metafaz hücrelerinin fotoğraf.
- Bir görüntü analizi softwa kullanarak hücre başına kromozom sayısını sayındokunup bir fotoğraf düzenleme yazılımı kullanarak kromozom örtüşen manuel ayrılmasından sonra yeniden. kromozom sayısı el atılır de, bilgisayar puanlama önerilir.
- karyotip analizi
NOT: Bu analiz eğitimli bir teknisyen ya da profesyonel bir şirket tarafından yapılmalıdır.- Standart G-bantlama tekniği 12'ye göre Leke hücreleri.
- Standart karyograms 12 yapmak için kromozom analiz edin.
- mFISH
NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ve gerekirse yapılmalıdır.- Üreticinin protokolüne 13'e göre insan kromozomları için çok renkli FISH probları kullanılarak leke hücreleri.
- Uygun filtreler ile bir floresan mikroskobu ve mFISH analizi 13 için bir yazılım kullanılarak kromozom analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneyimlerimize göre, TIG-1 hücreleri, 4 gün boyunca 0.1 mg / ml DC (Şekil 2A) ile birlikte basit sürekli işlenerek hemen hemen tamamen tetraploid yapılabilir. Buna karşılık, BJ ve IMR-90 ve TIG-HT hücreleri gibi diğer fibroblast suşlar, çalkalama kapatma yöntemiyle diploid aynı tedavi sonrası tetraploid popülasyonları ve mitotik hücrelerin izolasyonu bir karışımı olmuştur sırasında gerekli olan (- tedavinin başlamasından sonra 18 saat, genellikle 16) (Şekil 2B, C) DC tedavi. 3 gün DC ek muameleden sonra, hücreler, büyüme durmasını uygulandı ve büyük sergilenen birkaç gün morfolojisi düzleştirilmiş. Genel olarak bir hafta içinde, küçük çoğalan hücreler büyük düzleştirilmiş hücreler arasında (Şekil 3) ortaya çıktı. DC tedaviden sonra 3 hafta - Hücreler neredeyse tamamen tetraploid 2 oldu. Kurulan tetraploid hücrelerin modal kromozom sayısı iy, çoğu durumda 92 idiPT TIG-HT hücrelerden oluşturulmuş tetraploid hücre çizgilerinin bu bir hücre çoğunda 91 kromozom (Şekil 4) vardı. Kurulmuş tetraploid hücreler diploid hücreleri gibi hemen hemen aynı oranda (Şekil 5) büyüdü. Ölümsüzleştirilmiş hücrelerin, bu, aynı zamanda, ölümsüz (Şekil 5) olduğu sonucuna varıldı ölümsüzleştirilmemiş hücrelerden oluşturulmuş tetraploid hücre çizgileri, orijinal diploid hücreler olarak yaklaşık olarak eşit replikatif ömrü göstermiştir. Olmayan ölümsüzleştirdi TIG 1 hücrelerinden oluşturulan tetraploid hücreler Şekil 6 (hücreler oldukça karmaşık klonal sapmaları gösterdi ölümsüzleştirdi TIG-1 (TIG-HT) gelenler ise bir tetraploid kromozom sayısına (Şekil 6 üst panel) olması dışında normal bir karyotip gösterdi orta ve alt paneller). İkinci hücrelerde klonal sapmaları frekansı (TIG HT-4n) 450 PDL de hücre başına 5,2 sapmaları 255 nüfusu iki katına seviyeleri (PDL'ler) de hücre başına 2,5 sapmaları yükselmiştirTekrarlanan altkültür ile.
Şekil 1: Tetraploidi İndükleme Protokolün şematik İllüstrasyon. Bazı hücre suşları (örneğin, TIG 1) sürekli tedavi ile neredeyse tamamen tetraploid olabilir ise diploid hücrelerin en az kirlenme ile tetraploid hücrelerin elde edilmesi için, mitotik çalkalama-off ve DC tedavisinin kombinasyonu, bir çok hücre suşları (alt şekil) için gerekli olan demekolsin (üst resimde) ile. Mitoz hücreleri yakalama 18 saat (bu süre, ön deneylerle tespit edilmelidir) - 1) 16 0.1 ug / mL DC T75 balonlarına (en az 5 x 10 6) hücreleri tedavi edin. 2) shake-off yöntemi ile mitoz hücreleri toplayın ve 60 mm kültür kaplarına reseed. 3) 3 gün daha 0.1 ug / ml DC hücreleri tedavi. 4) ilaç barındırmayan ortam içinde hücreler (genellikle hücreler ile yeniden inkübe1 hafta içinde roliferation). Ölçek çubukları 100 um temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Önce Fibroblast ve Tetraploidi İndükleme Tedaviler sonra DNA Histogramlar. (A), TIG 1 hücreleri. Bu hücre soyu, 4 gün boyunca 0.1 mg / ml DC basit sürekli işlenerek tetraploid olur. (B) BJ hücreleri. Bu hücre suşu DC (sol paneller) ile basit tedavi sonrası diploid ve tetraploid nüfus bir karışımını olur, çünkü, kapalı sallayarak mitotik hücrelerin izolasyonu tetraploid hücreler (sağ panel) kurmak için DC tedavisi sırasında gereklidir. (C) TIG hT hücreleri (TIG 1 telomeraz-ölümsüzleştirilmiş). Bu hücreler, aynı zamanda bir tarak ile hazırlanabilir gerek DC tedavi ve sallamak-off tetraploid hücrelerin kurulması için e. histogramlar Rakamlar uyuşturucu çıkarıldıktan sonra zaman (gün) temsil etmektedir. apsis DNA içeriği (C, tamamlayıcısı) temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: DC ile Tedavi BJ Hücreler Temsilcisi Fotomikrografları. (A), BJ hücreleri 16 saat 0.1 ug / ml DC ile muamele edilmiştir. mitoz tutuklandı birçok hücre görülebilir. (B) DC tedavisinin sonu. Hemen hemen tüm hücrelerin büyümesi durdurulmuş bulunmaktadır. 7 gün tedaviden sonra DC (C). Büyük düzleştirilmiş hücreleri arasında küçük çoğalan hücreler görülebilir. 14 gün muameleden sonra DC (D). Hücreler aktif büyüyor. e.com/files/ftp_upload/55028/55028fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Her Hücre Zorlanma itibaren kurulan Tetraploid Hücreler için Kromozomların ve Kromozom Sayısı Histogramlar Temsilcisi Fotomikrografları. Üst, orta ve alt paneller TIG 1'den kurulan tetraploid hücreler (DC tedavisinden sonra 2 hafta), BJ (2 hafta sonra DC tedavisi) ve TIG-HT (DC tedavi sonrası 7 hafta), sırasıyla hücreler temsil etmektedir. Kromozomlar en az 50 metafaz attı bulundu. histogramlar Rakamlar modal kromozom sayıları vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
ftp_upload / 55028 / 55028fig5.jpg "/>
Şekil 5: İnsan fibroblastlar (Diploid hücreler) ve her hücre Strain'den kurulan Tetraploid Hücrelerin Temsilcisi Büyüme Profilleri. Sol, orta ve sağ paneller orijinal TIG-1 büyüme profillerini göstermektedir BJ ve TIG-hT hücreleri (açık belirteçleri) ve her hücre suşundan kurulan tetraploid hücreler o (belirteçler kapalı). Hücreler haftada iki kez pasajlandı ve PDL'ler hücre sayıları hesaplandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: G-bantlama ve mFISH tarafından Temsilcisi Karyograms. Üst panel TIG 1'den kurulan tetraploid hücreler (DC tedavisinden sonra 2 hafta), G-bantlama bir karyogram gösterir. Orta ve alt paneller göstermekTIG-HT hücrelerin (DC tedaviden sonra, 15 ve 41 hafta) üzerinden de kurulabilir tetraploid hücrelerin mFISH tarafından karyograms. Karyotipler 10 hücreleri (TIG-1) veya 20 hücreleri (TIG-HT) dayandırılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
kimyasal ajanlarla diploid hücrelerinden tetraploidi indüklenmesinde önemli bir sorun, her iki sitokinez önleyicileri ya da aks önleyicileri, hücreler çoğu zaman, diploid ve tetraploid popülasyonlarının karışımı haline ve tetraploit hücreler diploid hücrelerinden ayrılmalıdır. diploid hücrelerin ücretsiz tetraploid nüfusun izolasyonu için en yaygın yaklaşım, sınırlayıcı seyrelti yoluyla FACS ya klonlamadır. Ancak, bu işlemler zahmetli ve gerçekleştirmek kolay değildir. Bu yazıda, normal insan fibroblastlar gelen diploid nüfusun ücretsiz proliferatif tetraploid hücreler kurmak için yeni bir protokol mevcut. protokol mitoz diploid hücrelerin yakalanması için mili zehir DC kullanır ve çanak yüzeye yapışık diploid interfaz hücrelerinden sallayarak-off ile ayrılmış mitotik hücreler tutuklandı. Toplanan hücreler ilave 3 gün DC ile tedavi edilir, ve diploid mitotik hücreler muhtemelen b bu uzun süreli DC tedavisi ile tetraploid G1 hücrelere dönüştürmeky kontrol noktası uyarlaması (ayrıca mitotik kayma denir). Bu hücreler, ilaç kaldırma birkaç gün büyüme tutuklanmasının ardından tetraploid hücreler gibi hücre büyümesini yeniden başlatın.
Bu yöntemin bir avantajı, işlemleri nispeten basit ve FACS kullanılarak ya tetraploit hücreleri izole etmek için klonlama kıyasla mümkün olmasıdır. Yöntemin Sınırlamalar şunlardır. epitel hücreleri gibi fibroblast başka hücre tipleri, Uygulanabilirlik, hali hazırda bilinmemektedir. Bu gelecekteki çalışmalarda teyit edilmelidir. Küçük bir diploid nüfus bazı durumlarda kalabilir. Bununla birlikte, bu hücreler bir seri pasaj ile de azaltma eğiliminde olmaktadırlar. önemli bir diploid nüfus DC tedavisi, DC yüksek konsantrasyonda sonra devam ediyorsa (1,2-1,5 mcg / ml) ya da (4 gün yerine 3 gün) titreme-off sonrasında DC uzun tedavi sonucu iyileştirebilir.
Bu protokolde en kritik adımlar şunlardır. Birincisi, için DC tedavi süresishake-off öncesi mitoz hücreleri rresting önemlidir. Bu tedavi süresi imkansız kapalı sallayarak mitotik hücreleri toplamak için yapım, çanak yüzeye mitotik kaymasına ve yapışma neden olabilir çok uzun süre tedavi, mümkün olduğunca çok sayıda mitotik hücreleri toplamak için yeterince uzun olmalıdır rağmen. mitotik hücrelerin maksimum iyileşme için uygun bir zaman hedef hücreler üzerinde bağlı olduğundan, bu, ön deneyler ile tespit edilmelidir. Hücreleri interfaz da önemlidir gelen İkincisi, kapalı sallayarak adım mitotik hücrelerin ayırmak için. Bu adımda, gevşek, bulaşık yüzeyi ile yapıştırılır diploid mitotik hücreler, santrifüj ve ardından şişe hafifçe çalkalanarak ile toplanmaktadır. Bu mitotik sallamak-off sonra diploid nüfus tarafından kontaminasyon kaynağını olabilir yapıştırılır interfaz hücrelerden DC tarafından tutuklandı mitotik hücrelerin ayırır. Ayrıca fazlar arası hücrelerinin ayrılmasını hücrelerine zarar ve olabilecek orta, köpüren neden olabilir şiddetle sallayarak rdiploid hücrelerin kirlenmesi esulting. Bu yöntemin başarısını etkileyen diğer bir faktör, kültür ortamıdır. güçlü büyüme stimülasyon DC tedaviden sonra proliferasyon geri kazanımı için gerekli gibi görünmektedir, çünkü bu MEM-a gibi besin yönünden zengin ortam tetraploid hücrelerin çoğalmasını desteklemek için kullanılır. tetraploid hücreler (2.2.5) indüksiyonu son aşamada% 20 FBS konsantrasyonunu arttırarak da bu yöntemin başarısını artırabilir.
Bu protokolü kullanarak, bugüne kadar insan fibroblast suşları TIG 1, BJ, IMR-90 ve telomeraz-ölümsüzleştirdi TIG 1 şimdi 14-16 kadar gelen tetraploid hücreler üretildi var. 4 gün boyunca, titreme-off olmadan, DC ile sürekli tedavi edildiğinde bu hücre suşu neredeyse tamamen tetraploid olur, çünkü bu hücre suşları arasında, TIG-1 oldukça sıradışı. Sadece TIG-1 hücreleri, DC ile işlenerek bir sonucu olarak tümüyle tetraploid olmuştur nedeni şu anda bilinmemektedir. olası explaUluslar diploid G1 fazında başka tip tutuklama hücrelerinin önemli bir bölümü DC ile muamele edildi ve (1) TIG-1 hücreleri, (2) aynı tedaviden G1 durdurmak veya yok iken, tedaviden sonra proliferasyonunu devam ettiğinde bu olabilir TIG-1 hücreleri nüfus geri dönülmez aynı tedavi altında G1 tutukladı ve daha sonra çoğalmayı devam etmez. Herhangi bir durumda, DC G1 kapısı farklı hassasiyetleri DC sürekli tedavi sonrası farklı hücre davranışlarından sorumlu olabilir.
tümörigenezinde Tetraploidi etiyolojik önemi araştırırken, birçok araştırmacı tetraploidi "tetraploidi denetim noktası" denir hücrelerin p53 bağımlı büyüme tutuklama, uyardığı öne sürülmüştür çünkü, tetraploid hücrelerde p53 geni durumu hakkında büyük endişeleri var 17-20. Bu hipotez doğru ise, tetraploid hücrelerin prolifere p53 sinyal inaktive edilmelidir. Ancak,Bizim protokol tarafından kurulan tetraploid hücreler diploid hücreler 15,16 hemen hemen aynı oranda büyüyen rağmen fonksiyonel p53 var gibi görünüyor. Bu çelişkinin nedeni şu anda bilinmemektedir ve tetraploid hücrelerin çoğalması p53 inaktivasyonu önemi gelecekteki çalışmalarda tam muayene edilmelidir. Aslında, p53 ile işleyen bir tetraploidi kontrol noktasının varlığı tartışmalı 21-23 kalır.
In vitro yaymak dönüştürülmemiş polyploid hücreler kromozomal istikrarsızlık ve poliploid hücrelerin onkojenik potansiyeli detaylı analiz için vazgeçilmez olmasına rağmen, bu hücreler ana kadar nadiren mevcut olmuştur var. Bizim protokol poliploid insan hücrelerinin transformasyonu neden mekanizmaları çalışmak için faydalı bir model olabilir, normal insan fibroblast'larda, gelen çoğalma tetraploid hücrelerin kurulması basit ve uygun bir yöntem sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi var olduğunu beyan ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM-α | Sigma-Aldrich | M8042-500ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | 172012-500ML | |
| Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) | Sigma-Aldrich | D1925-10ML | |
| BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits | BD Biosciences | #340242 | For examination of DNA ploidy by flow cytometry |
| Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte | MetaSystems | #D-0125-060-DI | Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary |
| Isis imaging system with mFISH software | MetaSystems | Specialized probe kit is necessary |
References
- Rabinovitch, P., et al. Predictors of progression in Barrett's esophagus III: baseline flow cytometric variables. Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).
- Galipeau, P., et al. NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma. PLoS Med. 4 (2), e67 (2007).
- Olaharski, A., et al. Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis. Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).
- Liu, Y., et al. p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy. Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).
- Davoli, T., de Lange, T. The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
- Fox, D., Duronio, R. Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease. Development. 140, 3-12 (2013).
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437, 1043-1047 (2005).
- Ganem, N., et al. Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation. Cell. 158 (4), 833-848 (2014).
- Kuznetsova, A., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).
- Vindeløv, L., Christensen, I. Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis. Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).
- Darzynkiewicz, Z., Juan, G. DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis. Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5 (2001).
- Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. Chromosome analysis guidelines preliminary report. Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).
- Liehr, T., et al. Multicolor FISH probe sets and their applications. Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).
- Ohshima, S., Seyama, A. Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts. Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).
- Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Front. Oncol. 3, 198 (2013).
- Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts. Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).
- Di Leonardo, A., et al. DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function. Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).
- Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1. Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).
- Vogel, C., et al. Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy. Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).
- Aylon, Y., Oren, M.
- Uetake, Y., Sluder, G. Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a "tetraploidy checkpoint". J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).
- Ganem, N., Pellman, D.
- Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization. Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).
