Met een GFP-gelabeld TMEM184A Construct voor bevestiging van Heparine Receptor Identity
Summary
Een construct dat codeert TMEM184A met een GFP-tag aan het carboxy-uiteinde ontworpen voor eukaryotische expressie, werd gebruikt in testen die de identificatie van TMEM184A als heparine receptor in vasculaire cellen bevestigen.
Abstract
Wanneer nieuwe eiwitten worden geïdentificeerd door middel van affiniteit gebaseerde isolatie en bioinformatica-analyse, zijn ze vaak grotendeels ongekarakteriseerd. Antilichamen tegen specifieke peptiden binnen de voorspelde sequentie toelaten dat sommige lokalisatie experimenten. Echter, andere mogelijke interacties met de antilichamen vaak niet worden uitgesloten. Deze situatie bood de gelegenheid om een reeks assays afhankelijk van de eiwitsequentie ontwikkelen. Specifiek, een construct bevattende de gensequentie gekoppeld met de GFP coderende sequentie aan het C-terminale uiteinde van het eiwit werd verkregen en gebruikt voor deze doeleinden. Experimenten te karakteriseren lokalisatie, ligand affiniteit en versterking van de functie werden oorspronkelijk ontworpen en uitgevoerd om de identificatie van TMEM184A als heparine receptor 1 bevestigen. Bovendien kan het construct worden gebruikt voor studies naar membraantopologie vragen en gedetailleerde eiwit-ligand interacties. Het voorliggende rapport presenteert arange experimentele protocollen gebaseerd op het GFP-construct TMEM184A expressie gebracht in vasculaire cellen die gemakkelijk kunnen worden aangepast voor andere nieuwe eiwitten.
Introduction
Identificatie van gegadigde eiwitten voor nieuwe functies vaak afhankelijk affiniteit gebaseerde isolatie protocollen gevolgd door een gedeeltelijke sequentiebepaling. Recente voorbeelden van nieuw geïdentificeerde eiwitten omvatten transmembraaneiwit 184A (TMEM184A), een heparine receptor geïdentificeerd na heparine-affiniteit interacties 1, en TgPH1, een pleckstrin homologie domein eiwit dat fosfoinositide PI (3,5) P2 2 bindt. Andere nieuwe proteïne-identificatie omvat directe sequentieanalyse van peptiden zoals door Vit, et al. die vroeger transmembraan peptiden aan eiwitproducten te identificeren sinds de voorgaande uncharacterized genen 3. Evenzo kan identificatie van nieuwe eiwitsequenties worden uitgevoerd met bioinformatica zoeken van eerder gekarakteriseerde eiwitten families zoals de identificatie van nieuwe eiwitten 4TM 4. Onderzoek van aquaporine familie gensequenties heeft alzo leverde de identificatie van nieuwe leden met nieuwe functies 5. Na identificatie, analyse van eiwitfunctie typisch een volgende stap die soms kunnen worden onderzocht met een specifieke assay van eiwitfunctie, zoals in het geval aquaporine.
Indien mogelijk, kan de functie van een onlangs geïdentificeerd eiwit, met specifieke enzymatische of vergelijkbare functie in vitro assays. Omdat veel functies van nieuwe eiwitten afhankelijk complexe interacties die alleen voorkomen in intacte cellen of organismen in vitro testen zijn niet altijd effectief. Wel moet de in vivo assays worden ontworpen zodanig dat deze afhankelijk gensequentie. In celcultuur en / of eenvoudig model organismen, kan knock-down bewijsmateriaal in te dienen voor het eiwit / functie identificatie 6. Met nieuwe eiwitten die zoals hierboven vermeld, is het vaak voldoende om alleen neerhalen een eiwit functie te bevestigen, eend de opzet van in vivo functionele assays die afhankelijk gensequentie wordt belangrijk voor de karakterisering van nieuwe eiwitten.
De recente identificatie van TMEM184A als heparine receptor (die moduleert proliferatie in vasculaire gladde spieren en ontstekingsreacties in endotheelcellen) middels affiniteitschromatografie en MALDI MS 1, 7 bood de gelegenheid om een verzameling assays ontwikkelen na knockdown vruchten afgeworpen in overeenstemming met de identificatie . Een recente beoordeling bevestigde dat heparine interageert specifiek met veel groeifactoren, hun receptoren, extracellulaire matrix componenten, celadhesie receptoren en andere eiwitten 8. In het vaatstelsel, heparine en heparansulfaat proteoglycanen (met heparansulfaat ketens gelijksoortige structuur heparine) interageren met honderden proteïnen 9. Om functioneel te bevestigen that TMEM184A was betrokken bij heparine opname en binding, technieken die het gen construct voor TMEM184A tewerkgesteld werden ontwikkeld. Het huidige rapport bevat een verzameling van testen op basis van een GFP-TMEM184A construct voor gebruik bij de bevestiging van de identiteit van TMEM184A als heparine receptor.
Protocol
Representative Results
Discussion
De protocollen hier vermeld zijn ontworpen om bevestiging op voor de identificatie van TMEM184A als heparine receptor in vasculaire cellen 1 leveren. Knockdown technieken worden routinematig gebruikt als een mechanisme voor de identificatie van nieuwe eiwitten te bevestigen. Sommige functionele verlies na knockdown is gewoonlijk niet voldoende bewijs dat een kandidaat eiwit is eigenlijk de juiste receptor (of ander functioneel eiwit). Het is ook belangrijk om bewijs dat de gegadigde eiwit feiteli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the Lowe-Krentz lab is supported by research grant HL54269 from the National Institutes of Health to LLK.
Materials
| GFP-TMEM184A construct | OriGene | RG213192 | |
| Rhodamine-Heparin | Creative PEGWorks | HP-204 | Light Sensitive |
| Fluorescein-Heparin | Creative PEGWorks | HP-201 | Light Sensitive |
| Mowiol | EMD Millipore | 475904-100GM | |
| Paraformaldehyde (methanol free) | Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific | PI28908 at Fisher | Use in Fume Hood |
| Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96 well dishes) | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | PI15510 at Fisher | Pay attention to shelf-life |
| Black 96 well plates | Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific | 064432 at Fisher | |
| A7r5 vascular smooth muscle cell line | ATCC | CRL 1444 | Can be exchanged into MEM medium1 |
| BAOEC bovine aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | B304-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7 |
| BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells | Cell Applications, Inc. | B354-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1 |
| RAOEC rat aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | R304-05a | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7 |
| Biotinylated anti-GFP | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | MA5-15256-BTIN | |
| Streptavidin-coated beads | Sigma | S1638 | |
| HeBS | Available from Bio-Rad | Can be prepared in the lab. The pH is 6.8 | |
| TMEM184A antibody to the N-terminus | Santa Cruz Biotechnology | sc292006 | Only known TMEM184A antibody to N-terminal region. |
| TMEM184A antibody to the C-terminus | Obtained from ProSci Inc, Poway, CA | Pro Sci 5681 | ProSci used in figure 1 |
| GFP antibodies | Santa Cruz Biotechnology | sc9996 | Used in figures 5 |
| Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA | 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3) |
Minimal cross-reactivity to minimize any non-specific staining. |
| CHAPS | Purchased from Sigma | C5849 | Note that this specific catalog number has been discontinued. Supplier will provide information regarding replacement. |
| Live imaging 35 mm dishes | MatTek (Ashland MA) | P35G-1.0 – 20 mm – C | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens | Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3 |
| Confocal Microscope | Nikon | C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens | Used for images in Figure 5 |
| Confocal Microscope | Zeiss | Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens | Used for images in Figure 2C |
| Electroporation equipment | Bio-Rad | Gene Pulser X-Cell System | |
| Electroporation cuvettes | Available from MidSci | EC2L | Can also be obtained from equipment supplier |
| Plate reader | TECAN | TECAN Infinite® m200 Pro plate reader | Readings in the middle of the wells rather than at the surface. |
| Computer program for measuring staining intensity | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ Program and information available on-line |
Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail |
| Cell Culture trypsin solution | Sigma | T4174 | purchased as a 10X solution |
References
- Pugh, R. J., et al. Transmembrane Protein 184A Is a Receptor Required for Vascular Smooth Muscle Cell Responses to Heparin. J Biol Chem. 291, 5326-5341 (2016).
- Daher, W., et al. Identification of Toxoplasma TgPH1, a pleckstrin homology domain-containing protein that binds to the phosphoinositide PI(3,5)P. Mol Biochem Parasitol. , (2016).
- Vit, O., et al. Large-scale identification of membrane proteins based on analysis of trypsin-protected transmembrane segments. J Proteomics. , (2016).
- Attwood, M. M., et al. Topology based identification and comprehensive classification of four-transmembrane helix containing proteins (4TMs) in the human genome. BMC genomics. 17, 268 (2016).
- Zou, Z., et al. Genome-Wide Identification of Jatropha curcas Aquaporin Genes and the Comparative Analysis Provides Insights into the Gene Family Expansion and Evolution in Hevea brasiliensis. Front Plant Sci. 7, 395 (2016).
- Gilotti, A. C., et al. Heparin responses in vascular smooth muscle cells involve cGMP-dependent protein kinase (PKG). J Cell Physiol. 229, 2142-2152 (2014).
- Farwell, S. L., et al. Heparin Decreases in Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha)-induced Endothelial Stress Responses Require Transmembrane Protein 184A and Induction of Dual Specificity Phosphatase 1. J Biol Chem. 291, 5342-5354 (2016).
- Xu, D., Esko, J. D. Demystifying heparan sulfate-protein interactions. Annu Rev Biochem. 83, 129-157 (2014).
- Chiodelli, P., Bugatti, A., Urbinati, C., Rusnati, M. Heparin/Heparan sulfate proteoglycans glycomic interactome in angiogenesis: biological implications and therapeutical use. Molecules. 20, 6342-6388 (2015).
- Slee, J. B., Lowe-Krentz, L. J. Actin realignment and cofilin regulation are essential for barrier integrity during shear stress. J Cell Biochem. 114, 782-795 (2013).
- Patton, W. A., et al. Identification of a heparin-binding protein using monoclonal antibodies that block heparin binding to porcine aortic endothelial cells. The Biochemical journal. 311, 461-469 (1995).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. J Vis Exp. , (2011).
- Skalamera, D., et al. Generation of a genome scale lentiviral vector library for EF1alpha promoter-driven expression of human ORFs and identification of human genes affecting viral titer. PloS one. 7, 51733 (2012).
- Castro, M., Nikolaev, V. O., Palm, D., Lohse, M. J., Vilardaga, J. P. Turn-on switch in parathyroid hormone receptor by a two-step parathyroid hormone binding mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 16084-16089 (2005).
- Albertazzi, L., Arosio, D., Marchetti, L., Ricci, F., Beltram, F. Quantitative FRET analysis with the EGFP-mCherry fluorescent protein pair. Photochem Photobiol. 85, 287-297 (2009).
- Wang, S., et al. Domain organization of the ATP-sensitive potassium channel complex examined by fluorescence resonance energy transfer. J Biol Chem. 288, 4378-4388 (2013).
- Christiansen, E., Hudson, B. D., Hansen, A. H., Milligan, G., Ulven, T. Development and Characterization of a Potent Free Fatty Acid Receptor 1 (FFA1) Fluorescent Tracer. J Med Chem. 59, 4849-4858 (2016).
- Chiang, C. F., Okou, D. T., Griffin, T. B., Verret, C. R., Green Williams, M. N. fluorescent protein rendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions. Arch Biochem Biophys. 394, 229-235 (2001).
