El uso de un TMEM184A GFP-etiquetados Constructo para la Confirmación de heparina receptor de Identidad
Summary
A TMEM184A construcción que codifica con una etiqueta GFP en el extremo carboxi-terminal diseñado para la expresión eucariótica, se empleó en ensayos diseñados para confirmar la identificación de TMEM184A como un receptor de heparina en las células vasculares.
Abstract
Cuando nuevas proteínas se identifican mediante el aislamiento y la bioinformática análisis basado en afinidad, que a menudo son en gran parte no caracterizado. Los anticuerpos contra péptidos específicos dentro de la secuencia predicha permiten algunos experimentos de localización. Sin embargo, otras posibles interacciones con los anticuerpos a menudo no pueden ser excluidas. Esta situación proporciona una oportunidad para desarrollar un conjunto de ensayos que dependen de la secuencia de la proteína. Específicamente, se obtuvo un constructo que contiene la secuencia del gen acoplado a la secuencia que codifica GFP en el extremo C-terminal de la proteína y emplea para estos fines. Los experimentos para caracterizar la localización, la afinidad del ligando, y la ganancia de la función se diseñaron y llevaron a cabo para confirmar la identificación de TMEM184A como un receptor de heparina 1 en un principio. Además, el constructo se puede emplear para estudios relacionados con preguntas topología de la membrana y de las interacciones proteína-ligando detalladas. El presente informe se presenta arange de protocolos experimentales basados en el constructo GFP-TMEM184A expresado en las células vasculares que podrían ser fácilmente adaptado para otras proteínas novedosas.
Introduction
Identificación de proteínas candidatas para nuevas funciones a menudo depende de protocolos de aislamiento basados en afinidad seguido por determinación de la secuencia parcial. Ejemplos recientes de proteínas recientemente identificados incluyen la proteína transmembrana 184A (TMEM184A), un receptor de heparina identificado después de interacciones de afinidad de heparina 1, y TgPH1, una proteína de dominio de homología pleckstrin que se une PI phosphoinositide (3,5) P 2 2. Otros novela identificación de proteínas implica el análisis de secuencia directa de péptidos como la que por Vit, et al. que se utiliza para identificar péptidos transmembrana productos proteicos de genes previamente caracterizados 3. Del mismo modo, la identificación de nuevas secuencias de proteínas se puede lograr usando la bioinformática en busca de familias de proteínas previamente caracterizadas, como la identificación de nuevas proteínas 4TM 4. El examen de las secuencias de genes de la familia de acuaporina tiene alasí producido la identificación de nuevos miembros con nuevas funciones 5. Después de la identificación, el análisis de la función de proteínas es típicamente un siguiente paso, que a veces puede ser examinada usando un ensayo específico de la función de proteínas, tales como en el caso de acuaporina.
Cuando sea posible, la función de una proteína recientemente identificada puede ser examinado con enzimático específico o ensayos de la función similares in vitro. Debido a que muchas funciones de nuevas proteínas dependen de interacciones complejas que ocurren sólo en las células intactas o los organismos, en ensayos in vitro no siempre son eficaces. Sin embargo, los ensayos in vivo deben ser diseñados de tal manera que dependen de la secuencia del gen. En el cultivo de células y / o organismos modelo simples, desmontables puede aportar elementos de prueba para la identificación de proteínas / función 6. Con nuevas proteínas identificadas como se señaló anteriormente, a menudo es insuficiente para simplemente derribar una proteína para confirmar la función, unad el diseño de ensayos funcionales in vivo que dependen de la secuencia del gen se convierte en importante para la caracterización de nuevas proteínas.
La reciente identificación de TMEM184A como un receptor de heparina (que modula la proliferación en el músculo liso vascular y las respuestas inflamatorias en las células endoteliales) utilizando cromatografía de afinidad y MALDI MS 1, 7 proporcionan una oportunidad para desarrollar una colección de ensayos después de caída produjeron resultados coherentes con la identificación . Una revisión reciente confirmó que la heparina interactúa específicamente con muchos factores de crecimiento, sus receptores, componentes de matriz extracelular, receptores de adhesión celular, y otras proteínas 8. En el sistema vascular, la heparina y proteoglicanos heparán sulfato (que contiene cadenas de heparán sulfato similares en estructura a la heparina) interactuar con varios cientos de proteínas 9. Para confirmar funcionalmente that TMEM184A estaba involucrado con la absorción de la heparina y vinculante, se han desarrollado técnicas que emplean para la construcción del gen TMEM184A. El presente informe incluye una colección de ensayos basados en un GFP-TMEM184A construir para su uso en la confirmación de la identidad de TMEM184A como un receptor de heparina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los protocolos divulgados aquí fueron diseñados para proporcionar evidencia confirmatoria para la identificación de TMEM184A como un receptor de heparina en las células vasculares 1. técnicas desmontables se utilizan habitualmente como un mecanismo para confirmar la identificación de nuevas proteínas. Sin embargo, una cierta pérdida funcional después de la caída no suele ser suficiente prueba de que una proteína candidata es en realidad el receptor correcto (u otra proteína funcional)…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the Lowe-Krentz lab is supported by research grant HL54269 from the National Institutes of Health to LLK.
Materials
| GFP-TMEM184A construct | OriGene | RG213192 | |
| Rhodamine-Heparin | Creative PEGWorks | HP-204 | Light Sensitive |
| Fluorescein-Heparin | Creative PEGWorks | HP-201 | Light Sensitive |
| Mowiol | EMD Millipore | 475904-100GM | |
| Paraformaldehyde (methanol free) | Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific | PI28908 at Fisher | Use in Fume Hood |
| Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96 well dishes) | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | PI15510 at Fisher | Pay attention to shelf-life |
| Black 96 well plates | Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific | 064432 at Fisher | |
| A7r5 vascular smooth muscle cell line | ATCC | CRL 1444 | Can be exchanged into MEM medium1 |
| BAOEC bovine aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | B304-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7 |
| BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells | Cell Applications, Inc. | B354-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1 |
| RAOEC rat aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | R304-05a | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7 |
| Biotinylated anti-GFP | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | MA5-15256-BTIN | |
| Streptavidin-coated beads | Sigma | S1638 | |
| HeBS | Available from Bio-Rad | Can be prepared in the lab. The pH is 6.8 | |
| TMEM184A antibody to the N-terminus | Santa Cruz Biotechnology | sc292006 | Only known TMEM184A antibody to N-terminal region. |
| TMEM184A antibody to the C-terminus | Obtained from ProSci Inc, Poway, CA | Pro Sci 5681 | ProSci used in figure 1 |
| GFP antibodies | Santa Cruz Biotechnology | sc9996 | Used in figures 5 |
| Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA | 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3) |
Minimal cross-reactivity to minimize any non-specific staining. |
| CHAPS | Purchased from Sigma | C5849 | Note that this specific catalog number has been discontinued. Supplier will provide information regarding replacement. |
| Live imaging 35 mm dishes | MatTek (Ashland MA) | P35G-1.0 – 20 mm – C | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens | Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3 |
| Confocal Microscope | Nikon | C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens | Used for images in Figure 5 |
| Confocal Microscope | Zeiss | Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens | Used for images in Figure 2C |
| Electroporation equipment | Bio-Rad | Gene Pulser X-Cell System | |
| Electroporation cuvettes | Available from MidSci | EC2L | Can also be obtained from equipment supplier |
| Plate reader | TECAN | TECAN Infinite® m200 Pro plate reader | Readings in the middle of the wells rather than at the surface. |
| Computer program for measuring staining intensity | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ Program and information available on-line |
Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail |
| Cell Culture trypsin solution | Sigma | T4174 | purchased as a 10X solution |
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