Utilizzando un TMEM184A GFP-tagged Construct per la conferma della Eparina Receptor Identità
Summary
Un TMEM184A codifica costrutto con un tag GFP al carbossi-terminale progettato per l'espressione eucariotica, è stato impiegato in saggi progettati per confermare l'identificazione di TMEM184A come recettore eparina in cellule vascolari.
Abstract
Quando nuove proteine vengono identificati attraverso l'isolamento e la bioinformatica market basket analysis-based, sono spesso in gran parte indefinita. Gli anticorpi contro peptidi specifici all'interno della sequenza prevista consentono alcuni esperimenti di localizzazione. Tuttavia, spesso non possono essere escluse altre interazioni possibili con gli anticorpi. Questa situazione ha offerto l'opportunità di sviluppare una serie di saggi dipendenti dalla sequenza della proteina. In particolare, un costrutto contenente la sequenza genica accoppiato alla sequenza codificante GFP all'estremità C-terminale della proteina è stata ottenuta e utilizzata per questi scopi. Gli esperimenti per caratterizzare la localizzazione, ligando di affinità, e guadagno di funzione sono stati originariamente progettati e realizzati per confermare l'identificazione di TMEM184A come recettore eparina 1. Inoltre, il costrutto può essere impiegato per studi che riguardano domande topologia di membrana e le interazioni proteina-ligando dettagliate. La presente relazione presenta arange di protocolli sperimentali basati sul costrutto GFP-TMEM184A espresso in cellule vascolari che potrebbe essere facilmente adattato per altre nuove proteine.
Introduction
L'identificazione di proteine candidate per le funzioni nuove, spesso dipende da protocolli di isolamento di affinità basata seguita da determinazione sequenza parziale. Esempi recenti di nuove proteine identificate sono proteine transmembrana 184A (TMEM184A), un recettore eparina identificato dopo interazioni eparina affinità 1, e TgPH1, una proteina dominio pleckstrin omologia che lega phosphoinositide PI (3,5) P2 2. Altro novel identificazione delle proteine attraverso analisi di sequenza diretta dei peptidi come quello di Vit, et al. che ha usato peptidi transmembrana per identificare i prodotti proteici da geni precedentemente non caratterizzate 3. Allo stesso modo, l'identificazione di nuove sequenze di proteine può essere realizzato utilizzando la bioinformatica alla ricerca di famiglie di proteine precedentemente caratterizzati come l'identificazione di nuove proteine 4TM 4. L'esame delle sequenze di geni della famiglia aquaporin ha alcosì ceduto l'identificazione di nuovi membri caratterizzati da nuove funzioni 5. Dopo l'identificazione, l'analisi della funzione della proteina è tipicamente un passo successivo, che a volte può essere esaminato utilizzando un dosaggio specifico della funzione proteica come nel caso aquaporin.
Quando possibile, la funzione di una proteina di recente identificazione può essere esaminato con particolare enzimatici o simili saggi funzionali in vitro. Poiché molte funzioni delle nuove proteine dipendono complesse interazioni che si verificano solo in cellule intatte o organismi, in vitro non sono sempre efficaci. Tuttavia, i saggi in vivo devono essere progettati in modo tale che essi dipendono dalla sequenza del gene. In coltura cellulare, e / o organismi modello semplici, atterramento in grado di fornire elementi di prova per l'identificazione delle proteine / funzione 6. Con nuove proteine identificate come notato sopra, è spesso insufficiente a battere semplicemente verso il basso una proteina per confermare la funzione, und progettazione di saggi in vivo funzionali che dipendono sequenza genetica diventa importante per la caratterizzazione di nuove proteine.
La recente individuazione di TMEM184A come recettore eparina (che modula la proliferazione in muscolatura liscia vascolare e le risposte infiammatorie nelle cellule endoteliali) mediante cromatografia di affinità e MALDI MS 1, 7 fornito l'opportunità di sviluppare una collezione di saggi dopo atterramento prodotto risultati coerenti con l'identificazione . Una recente revisione ha confermato che l'eparina interagisce specificamente con molti fattori di crescita, i loro recettori, i componenti della matrice extracellulare, recettori di adesione cellulare, e altre proteine 8. Nel sistema vascolare, eparina e proteoglicani eparan solfato (contenente catene eparan solfato di struttura simile a eparina) interagire con diverse centinaia di proteine 9. Per confermare funzionalmente that TMEM184A è stato coinvolto con l'eparina assorbimento e vincolante, sono state sviluppate tecniche che hanno impiegato il costrutto gene per TMEM184A. La presente relazione comprende una raccolta di saggi sulla base di un GFP-TMEM184A costrutto per l'uso nel confermare l'identità di TMEM184A come recettore eparina.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protocolli qui riportati sono stati progettati per fornire la prova di conferma per l'identificazione di TMEM184A come recettore eparina in cellule vascolari 1. tecniche Knockdown sono abitualmente utilizzati come uno meccanismo per confermare l'identificazione di nuove proteine. Tuttavia, qualche perdita funzionale dopo atterramento non è tipicamente una prova sufficiente che una proteina candidato è effettivamente il recettore corretta (o altra proteina funzionale). E 'anche imp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the Lowe-Krentz lab is supported by research grant HL54269 from the National Institutes of Health to LLK.
Materials
| GFP-TMEM184A construct | OriGene | RG213192 | |
| Rhodamine-Heparin | Creative PEGWorks | HP-204 | Light Sensitive |
| Fluorescein-Heparin | Creative PEGWorks | HP-201 | Light Sensitive |
| Mowiol | EMD Millipore | 475904-100GM | |
| Paraformaldehyde (methanol free) | Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific | PI28908 at Fisher | Use in Fume Hood |
| Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96 well dishes) | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | PI15510 at Fisher | Pay attention to shelf-life |
| Black 96 well plates | Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific | 064432 at Fisher | |
| A7r5 vascular smooth muscle cell line | ATCC | CRL 1444 | Can be exchanged into MEM medium1 |
| BAOEC bovine aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | B304-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7 |
| BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells | Cell Applications, Inc. | B354-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1 |
| RAOEC rat aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | R304-05a | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7 |
| Biotinylated anti-GFP | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | MA5-15256-BTIN | |
| Streptavidin-coated beads | Sigma | S1638 | |
| HeBS | Available from Bio-Rad | Can be prepared in the lab. The pH is 6.8 | |
| TMEM184A antibody to the N-terminus | Santa Cruz Biotechnology | sc292006 | Only known TMEM184A antibody to N-terminal region. |
| TMEM184A antibody to the C-terminus | Obtained from ProSci Inc, Poway, CA | Pro Sci 5681 | ProSci used in figure 1 |
| GFP antibodies | Santa Cruz Biotechnology | sc9996 | Used in figures 5 |
| Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA | 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3) |
Minimal cross-reactivity to minimize any non-specific staining. |
| CHAPS | Purchased from Sigma | C5849 | Note that this specific catalog number has been discontinued. Supplier will provide information regarding replacement. |
| Live imaging 35 mm dishes | MatTek (Ashland MA) | P35G-1.0 – 20 mm – C | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens | Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3 |
| Confocal Microscope | Nikon | C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens | Used for images in Figure 5 |
| Confocal Microscope | Zeiss | Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens | Used for images in Figure 2C |
| Electroporation equipment | Bio-Rad | Gene Pulser X-Cell System | |
| Electroporation cuvettes | Available from MidSci | EC2L | Can also be obtained from equipment supplier |
| Plate reader | TECAN | TECAN Infinite® m200 Pro plate reader | Readings in the middle of the wells rather than at the surface. |
| Computer program for measuring staining intensity | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ Program and information available on-line |
Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail |
| Cell Culture trypsin solution | Sigma | T4174 | purchased as a 10X solution |
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