एक GFP टैग TMEM184A का प्रयोग हेपरिन रिसेप्टर पहचान की पुष्टि के लिए निर्माण
Summary
carboxy टर्मिनस यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति के लिए डिजाइन पर एक GFP टैग के साथ एक निर्माण एन्कोडिंग TMEM184A, नाड़ी कोशिकाओं में एक हेपरिन रिसेप्टर के रूप में TMEM184A की पहचान की पुष्टि करने के लिए डिज़ाइन किया गया assays में कार्यरत था।
Abstract
उपन्यास प्रोटीन समानता के आधार पर अलगाव और जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के माध्यम से पहचान कर रहे हैं, वे अक्सर काफी हद तक uncharacterized हैं। भविष्यवाणी अनुक्रम के भीतर विशिष्ट पेप्टाइड्स के खिलाफ एंटीबॉडी कुछ स्थानीयकरण प्रयोगों अनुमति देते हैं। हालांकि, एंटीबॉडी के साथ अन्य संभावित बातचीत अक्सर बाहर नहीं किया जा सकता है। इस स्थिति में प्रोटीन अनुक्रम पर निर्भर assays का एक सेट विकसित करने का अवसर प्रदान किया। विशेष रूप से, एक निर्माण जीन अनुक्रम प्रोटीन के सी टर्मिनल अंत में GFP अनुक्रम कोडन करने के लिए मिलकर युक्त प्राप्त की और इन उद्देश्यों के लिए नियुक्त किया गया था। प्रयोगों स्थानीयकरण, ligand समानता को चिह्नित करने के लिए, और समारोह के लाभ मूल रूप से डिजाइन और बाहर ले एक हेपरिन रिसेप्टर 1 के रूप में TMEM184A की पहचान की पुष्टि करने के लिए किया गया। इसके अलावा, निर्माण झिल्ली टोपोलॉजी सवाल और विस्तृत प्रोटीन ligand बातचीत को संबोधित अध्ययन के लिए नियोजित किया जा सकता है। वर्तमान रिपोर्ट प्रस्तुत की गिरफ्तारीGFP-TMEM184A निर्माण नाड़ी कोशिकाओं में व्यक्त की है कि आसानी से अन्य उपन्यास प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है पर आधारित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का Ange।
Introduction
उपन्यास कार्यों के लिए उम्मीदवार प्रोटीन की पहचान अक्सर समानता के आधार पर अलगाव आंशिक अनुक्रम दृढ़ संकल्प के द्वारा पीछा प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है। नव पहचान प्रोटीन के हाल के उदाहरण transmembrane प्रोटीन 184A (TMEM184A), एक हेपरिन रिसेप्टर हेपरिन समानता बातचीत के बाद 1 की पहचान की है, और TgPH1, एक pleckstrin अनुरूपता डोमेन प्रोटीन है कि phosphoinositide पीआई (3,5) पी 2 2 बांधता शामिल हैं। अन्य उपन्यास प्रोटीन की पहचान ऐसी है कि विटामिन से, एट अल के रूप में पेप्टाइड्स के प्रत्यक्ष अनुक्रम विश्लेषण शामिल है। जो transmembrane पेप्टाइड्स इस्तेमाल किया पहले से uncharacterized जीन 3 से प्रोटीन उत्पादों की पहचान करने के लिए। इसी तरह, उपन्यास प्रोटीन दृश्यों की पहचान ऐसे नए 4TM प्रोटीन 4 की पहचान के रूप में पहले की विशेषता प्रोटीन परिवारों की खोज जैव सूचना विज्ञान का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है। aquaporin परिवार जीन दृश्यों की परीक्षा अल हैइसलिए उपन्यास कार्यों 5 के साथ नए सदस्यों की पहचान के सामने आए। पहचान के बाद, प्रोटीन समारोह के विश्लेषण आम तौर पर एक अगला कदम है जो कभी कभी ऐसी aquaporin मामले के रूप में प्रोटीन समारोह की एक विशिष्ट परख का उपयोग कर जांच की जा सकती है।
जब संभव हो, एक नव पहचान प्रोटीन के समारोह में विशिष्ट enzymatic या इसी तरह इन विट्रो समारोह assays के साथ जांच की जा सकती है। क्योंकि उपन्यास प्रोटीन के कई कार्यों जटिल बातचीत है कि केवल बरकरार कोशिकाओं या जीवों में पाए जाते हैं, इन विट्रो assays में पर निर्भर हमेशा प्रभावी नहीं हैं। हालांकि, इन विवो assays के इस तरह है कि वे जीन क्रम पर निर्भर में तैयार किया जाना चाहिए। सेल संस्कृति, और / या साधारण मॉडल जीवों में, पछाड़ना प्रोटीन / समारोह पहचान 6 के लिए साक्ष्य का समर्थन प्रदान कर सकते हैं। पहचान के रूप में ऊपर उल्लेख किया उपन्यास प्रोटीन के साथ, यह समारोह पुष्टि करने के लिए अक्सर बस एक प्रोटीन नीचे दस्तक करने के लिए अपर्याप्त है एकविकास में विवो कार्यात्मक assays कि जीन क्रम पर निर्भर की डिजाइन उपन्यास प्रोटीन के लक्षण वर्णन के लिए महत्वपूर्ण हो जाता है।
एक हेपरिन रिसेप्टर के रूप में TMEM184A की हाल की पहचान (कि संवहनी चिकनी मांसपेशियों और endothelial कोशिकाओं में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं में प्रसार modulates) आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी और MALDI एमएस 1 का उपयोग, 7 assays के एक संग्रह को विकसित करने का अवसर पछाड़ना झुकेंगे पहचान के साथ अनुरूप परिणाम के बाद प्रदान की । हाल ही में एक समीक्षा पुष्टि की है कि हेपरिन कई वृद्धि कारक है, उनके रिसेप्टर्स, बाह्य मैट्रिक्स घटकों, कोशिका आसंजन रिसेप्टर्स, और अन्य प्रोटीन 8 के साथ विशेष रूप से सूचना का आदान प्रदान। नाड़ी तंत्र, हेपरिन और Heparan सल्फेट प्रोटेयोग्लाईकैन्स में (हेपरिन के लिए संरचना में समान Heparan सल्फेट चेन युक्त) कई सौ प्रोटीन 9 के साथ बातचीत। कार्यात्मक Tha पुष्टि करने के लिएटी TMEM184A हेपरिन तेज और बंधन के साथ शामिल किया गया था, तकनीक है कि TMEM184A के लिए जीन का निर्माण कार्यरत विकसित किए गए। वर्तमान रिपोर्ट एक GFP-TMEM184A पर आधारित assays का एक संग्रह एक हेपरिन रिसेप्टर के रूप में TMEM184A की पहचान की पुष्टि के लिए उपयोग में निर्माण भी शामिल है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां बताया प्रोटोकॉल नाड़ी कोशिकाओं 1 में एक हेपरिन रिसेप्टर के रूप में TMEM184A की पहचान के लिए पुष्टि सबूत प्रदान करने के लिए डिजाइन किए गए थे। पछाड़ना तकनीक को नियमित उपन्यास प्रोटीन की पहचान की…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the Lowe-Krentz lab is supported by research grant HL54269 from the National Institutes of Health to LLK.
Materials
| GFP-TMEM184A construct | OriGene | RG213192 | |
| Rhodamine-Heparin | Creative PEGWorks | HP-204 | Light Sensitive |
| Fluorescein-Heparin | Creative PEGWorks | HP-201 | Light Sensitive |
| Mowiol | EMD Millipore | 475904-100GM | |
| Paraformaldehyde (methanol free) | Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific | PI28908 at Fisher | Use in Fume Hood |
| Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96 well dishes) | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | PI15510 at Fisher | Pay attention to shelf-life |
| Black 96 well plates | Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific | 064432 at Fisher | |
| A7r5 vascular smooth muscle cell line | ATCC | CRL 1444 | Can be exchanged into MEM medium1 |
| BAOEC bovine aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | B304-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7 |
| BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells | Cell Applications, Inc. | B354-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1 |
| RAOEC rat aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | R304-05a | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7 |
| Biotinylated anti-GFP | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | MA5-15256-BTIN | |
| Streptavidin-coated beads | Sigma | S1638 | |
| HeBS | Available from Bio-Rad | Can be prepared in the lab. The pH is 6.8 | |
| TMEM184A antibody to the N-terminus | Santa Cruz Biotechnology | sc292006 | Only known TMEM184A antibody to N-terminal region. |
| TMEM184A antibody to the C-terminus | Obtained from ProSci Inc, Poway, CA | Pro Sci 5681 | ProSci used in figure 1 |
| GFP antibodies | Santa Cruz Biotechnology | sc9996 | Used in figures 5 |
| Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA | 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3) |
Minimal cross-reactivity to minimize any non-specific staining. |
| CHAPS | Purchased from Sigma | C5849 | Note that this specific catalog number has been discontinued. Supplier will provide information regarding replacement. |
| Live imaging 35 mm dishes | MatTek (Ashland MA) | P35G-1.0 – 20 mm – C | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens | Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3 |
| Confocal Microscope | Nikon | C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens | Used for images in Figure 5 |
| Confocal Microscope | Zeiss | Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens | Used for images in Figure 2C |
| Electroporation equipment | Bio-Rad | Gene Pulser X-Cell System | |
| Electroporation cuvettes | Available from MidSci | EC2L | Can also be obtained from equipment supplier |
| Plate reader | TECAN | TECAN Infinite® m200 Pro plate reader | Readings in the middle of the wells rather than at the surface. |
| Computer program for measuring staining intensity | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ Program and information available on-line |
Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail |
| Cell Culture trypsin solution | Sigma | T4174 | purchased as a 10X solution |
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