باستخدام TMEM184A GFP الموسومة نبني لتأكيد الهيبارين مستقبلات الهوية
Summary
وTMEM184A ترميز بناء مع علامة GFP في-محطة كربوكسي مصممة للتعبير حقيقية النواة، كان يعمل في فحوصات تهدف إلى التأكد من تحديد TMEM184A بمثابة مستقبلات الهيبارين في خلايا الأوعية الدموية.
Abstract
عندما يتم تحديد البروتينات الرواية من خلال العزلة والمعلوماتية الحيوية التحليل القائم على تقارب، فإنها غالبا ما تكون uncharacterized إلى حد كبير. الأجسام المضادة ضد الببتيدات محددة ضمن تسلسل توقع تسمح بعض التجارب التعريب. ومع ذلك، في كثير من الأحيان لا يمكن استبعاد التفاعلات الأخرى المحتملة مع الأجسام المضادة. وقد وفر هذا الوضع فرصة لتطوير مجموعة من فحوصات تعتمد على تسلسل البروتين. على وجه التحديد، تم الحصول على التركيبة التي تحتوي على التسلسل الجيني بالإضافة إلى تسلسل الترميز GFP في نهاية C-محطة من البروتين ويعمل لهذه الأغراض. تجارب لتميز الترجمة، وتقارب يجند، وتحقيق مكاسب من وظيفة صممت في الأصل وتجرى للتأكد من تحديد TMEM184A بمثابة مستقبلات الهيبارين 1. وبالإضافة إلى ذلك، فإن بناء يمكن استخدامها للدراسات معالجة المسائل طوبولوجيا الغشاء والتفاعلات مفصلة البروتين يجند. ويعرض هذا التقرير عآنج من البروتوكولات التجريبية على أساس بناء GFP-TMEM184A أعرب في خلايا الأوعية الدموية التي يمكن بسهولة أن تتكيف للبروتينات جديدة أخرى.
Introduction
تحديد البروتينات مرشح لوظائف جديدة غالبا ما يعتمد على بروتوكولات العزلة القائمة على تقارب تليها الجزئي تحديد التسلسل. ومن الأمثلة الأخيرة من البروتينات التي تم تحديدها حديثا بروتين الغشاء 184A (TMEM184A)، ومستقبلات الهيبارين التي تم تحديدها بعد التفاعلات الهيبارين تقارب 1، وTgPH1، وهو بروتين نطاق pleckstrin التماثل الذي يربط PI فسفوإينوزيتيد (3،5) ف 2 2. يشمل باقي تحديد البروتين رواية تحليل تسلسل مباشر من الببتيدات مثل تلك التي فيت، وآخرون. الذين استخدموا الببتيدات عبر الغشاء إلى التعرف على المنتجات البروتين من الجينات uncharacterized سابقا 3. وبالمثل، وتحديد تسلسل البروتين جديدة يمكن إنجازه باستخدام المعلوماتية الحيوية البحث الأسر بروتين يتميز سابقا مثل تحديد البروتينات 4TM 4 الجديدة. فحص تسلسل الجينات الأسرة aquaporin له اللهحتى أسفرت عن تحديد أعضاء جدد مع وظائف جديدة 5. بعد تحديد وتحليل وظيفة البروتين هو عادة الخطوة التالية التي يمكن في بعض الأحيان أن تدرس باستخدام فحص معين من وظيفة البروتين مثل في حالة aquaporin.
عندما يكون ذلك ممكنا، وظيفة بروتين تم اكتشافه حديثا يمكن فحص مع الأنزيمية محددة أو ما شابه ذلك في فحوصات المختبر وظيفة. لأن العديد من وظائف بروتينات جديدة تعتمد على التفاعلات المعقدة التي تحدث فقط في خلايا سليمة أو الكائنات الحية، في فحوصات المختبر ليست دائما فعالة. ومع ذلك، يجب أن تكون مصممة لفحوصات في الجسم الحي في مثل هذه الطريقة التي تعتمد على تسلسل الجين. في زراعة الخلايا، و / أو الكائنات نموذج بسيط، يمكن ضربة قاضية تقديم الأدلة الداعمة لتحديد بروتين / وظيفة 6. مع البروتينات الجديدة التي تم تحديدها على النحو المشار إليه أعلاه، فإنه غالبا ما يكون غير كاف لمجرد هدم البروتين لتأكيد وظيفة، وهود تصميم في الجسم الحي المقايسات الفنية التي تعتمد على تسلسل الجين يصبح من المهم لتوصيف البروتينات الرواية.
تحديد مؤخرا TMEM184A بمثابة مستقبلات الهيبارين (أن ينظم انتشار في العضلات الملساء الوعائية والاستجابات الالتهابية في الخلايا البطانية) باستخدام اللوني تقارب وMALDI MS 1، شريطة 7 فرصة لتطوير مجموعة من فحوصات بعد أسفرت ضربة قاضية نتائج متسقة مع تحديد . وأكد الاستعراض الأخير أن الهيبارين يتفاعل بشكل خاص مع العديد من عوامل النمو، مستقبلاتها، مكونات المصفوفة خارج الخلية، مستقبلات الخلايا الالتصاق، وغيرها من البروتينات 8. في الأوعية الدموية، الهيبارين والبروتيوغليكان كبريتات heparan (التي تحتوي على سلاسل كبريتات heparan مماثلة في الهيكل للهيبارين) تتفاعل مع عدة مئات من البروتينات 9. لتأكيد وظيفيا ثاوقد ت TMEM184A تشارك مع امتصاص الهيبارين وملزمة، وضعت التقنيات التي استخدمت التركيبة الجينية للTMEM184A. ويتضمن هذا التقرير مجموعة من فحوصات على أساس GFP-TMEM184A بناء لاستخدامها في تأكيد هوية TMEM184A بمثابة مستقبلات الهيبارين.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تصميم بروتوكولات ذكرت هنا لتقديم أدلة مؤكدة لتحديد TMEM184A بمثابة مستقبلات الهيبارين في خلايا الأوعية الدموية 1. وتستخدم تقنيات ضربة قاضية بشكل روتيني كآلية لتأكيد تحديد البروتينات الرواية. ومع ذلك، بعض الخسائر الوظيفية بعد ضربة قاضية هي عادة ليست دليل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the Lowe-Krentz lab is supported by research grant HL54269 from the National Institutes of Health to LLK.
Materials
| GFP-TMEM184A construct | OriGene | RG213192 | |
| Rhodamine-Heparin | Creative PEGWorks | HP-204 | Light Sensitive |
| Fluorescein-Heparin | Creative PEGWorks | HP-201 | Light Sensitive |
| Mowiol | EMD Millipore | 475904-100GM | |
| Paraformaldehyde (methanol free) | Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific | PI28908 at Fisher | Use in Fume Hood |
| Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96 well dishes) | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | PI15510 at Fisher | Pay attention to shelf-life |
| Black 96 well plates | Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific | 064432 at Fisher | |
| A7r5 vascular smooth muscle cell line | ATCC | CRL 1444 | Can be exchanged into MEM medium1 |
| BAOEC bovine aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | B304-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7 |
| BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells | Cell Applications, Inc. | B354-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1 |
| RAOEC rat aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | R304-05a | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7 |
| Biotinylated anti-GFP | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | MA5-15256-BTIN | |
| Streptavidin-coated beads | Sigma | S1638 | |
| HeBS | Available from Bio-Rad | Can be prepared in the lab. The pH is 6.8 | |
| TMEM184A antibody to the N-terminus | Santa Cruz Biotechnology | sc292006 | Only known TMEM184A antibody to N-terminal region. |
| TMEM184A antibody to the C-terminus | Obtained from ProSci Inc, Poway, CA | Pro Sci 5681 | ProSci used in figure 1 |
| GFP antibodies | Santa Cruz Biotechnology | sc9996 | Used in figures 5 |
| Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA | 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3) |
Minimal cross-reactivity to minimize any non-specific staining. |
| CHAPS | Purchased from Sigma | C5849 | Note that this specific catalog number has been discontinued. Supplier will provide information regarding replacement. |
| Live imaging 35 mm dishes | MatTek (Ashland MA) | P35G-1.0 – 20 mm – C | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens | Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3 |
| Confocal Microscope | Nikon | C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens | Used for images in Figure 5 |
| Confocal Microscope | Zeiss | Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens | Used for images in Figure 2C |
| Electroporation equipment | Bio-Rad | Gene Pulser X-Cell System | |
| Electroporation cuvettes | Available from MidSci | EC2L | Can also be obtained from equipment supplier |
| Plate reader | TECAN | TECAN Infinite® m200 Pro plate reader | Readings in the middle of the wells rather than at the surface. |
| Computer program for measuring staining intensity | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ Program and information available on-line |
Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail |
| Cell Culture trypsin solution | Sigma | T4174 | purchased as a 10X solution |
References
- Pugh, R. J., et al. Transmembrane Protein 184A Is a Receptor Required for Vascular Smooth Muscle Cell Responses to Heparin. J Biol Chem. 291, 5326-5341 (2016).
- Daher, W., et al. Identification of Toxoplasma TgPH1, a pleckstrin homology domain-containing protein that binds to the phosphoinositide PI(3,5)P. Mol Biochem Parasitol. , (2016).
- Vit, O., et al. Large-scale identification of membrane proteins based on analysis of trypsin-protected transmembrane segments. J Proteomics. , (2016).
- Attwood, M. M., et al. Topology based identification and comprehensive classification of four-transmembrane helix containing proteins (4TMs) in the human genome. BMC genomics. 17, 268 (2016).
- Zou, Z., et al. Genome-Wide Identification of Jatropha curcas Aquaporin Genes and the Comparative Analysis Provides Insights into the Gene Family Expansion and Evolution in Hevea brasiliensis. Front Plant Sci. 7, 395 (2016).
- Gilotti, A. C., et al. Heparin responses in vascular smooth muscle cells involve cGMP-dependent protein kinase (PKG). J Cell Physiol. 229, 2142-2152 (2014).
- Farwell, S. L., et al. Heparin Decreases in Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha)-induced Endothelial Stress Responses Require Transmembrane Protein 184A and Induction of Dual Specificity Phosphatase 1. J Biol Chem. 291, 5342-5354 (2016).
- Xu, D., Esko, J. D. Demystifying heparan sulfate-protein interactions. Annu Rev Biochem. 83, 129-157 (2014).
- Chiodelli, P., Bugatti, A., Urbinati, C., Rusnati, M. Heparin/Heparan sulfate proteoglycans glycomic interactome in angiogenesis: biological implications and therapeutical use. Molecules. 20, 6342-6388 (2015).
- Slee, J. B., Lowe-Krentz, L. J. Actin realignment and cofilin regulation are essential for barrier integrity during shear stress. J Cell Biochem. 114, 782-795 (2013).
- Patton, W. A., et al. Identification of a heparin-binding protein using monoclonal antibodies that block heparin binding to porcine aortic endothelial cells. The Biochemical journal. 311, 461-469 (1995).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. J Vis Exp. , (2011).
- Skalamera, D., et al. Generation of a genome scale lentiviral vector library for EF1alpha promoter-driven expression of human ORFs and identification of human genes affecting viral titer. PloS one. 7, 51733 (2012).
- Castro, M., Nikolaev, V. O., Palm, D., Lohse, M. J., Vilardaga, J. P. Turn-on switch in parathyroid hormone receptor by a two-step parathyroid hormone binding mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 16084-16089 (2005).
- Albertazzi, L., Arosio, D., Marchetti, L., Ricci, F., Beltram, F. Quantitative FRET analysis with the EGFP-mCherry fluorescent protein pair. Photochem Photobiol. 85, 287-297 (2009).
- Wang, S., et al. Domain organization of the ATP-sensitive potassium channel complex examined by fluorescence resonance energy transfer. J Biol Chem. 288, 4378-4388 (2013).
- Christiansen, E., Hudson, B. D., Hansen, A. H., Milligan, G., Ulven, T. Development and Characterization of a Potent Free Fatty Acid Receptor 1 (FFA1) Fluorescent Tracer. J Med Chem. 59, 4849-4858 (2016).
- Chiang, C. F., Okou, D. T., Griffin, T. B., Verret, C. R., Green Williams, M. N. fluorescent protein rendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions. Arch Biochem Biophys. 394, 229-235 (2001).
