Summary

باستخدام TMEM184A GFP الموسومة نبني لتأكيد الهيبارين مستقبلات الهوية

Published: February 17, 2017
doi:

Summary

وTMEM184A ترميز بناء مع علامة GFP في-محطة كربوكسي مصممة للتعبير حقيقية النواة، كان يعمل في فحوصات تهدف إلى التأكد من تحديد TMEM184A بمثابة مستقبلات الهيبارين في خلايا الأوعية الدموية.

Abstract

عندما يتم تحديد البروتينات الرواية من خلال العزلة والمعلوماتية الحيوية التحليل القائم على تقارب، فإنها غالبا ما تكون uncharacterized إلى حد كبير. الأجسام المضادة ضد الببتيدات محددة ضمن تسلسل توقع تسمح بعض التجارب التعريب. ومع ذلك، في كثير من الأحيان لا يمكن استبعاد التفاعلات الأخرى المحتملة مع الأجسام المضادة. وقد وفر هذا الوضع فرصة لتطوير مجموعة من فحوصات تعتمد على تسلسل البروتين. على وجه التحديد، تم الحصول على التركيبة التي تحتوي على التسلسل الجيني بالإضافة إلى تسلسل الترميز GFP في نهاية C-محطة من البروتين ويعمل لهذه الأغراض. تجارب لتميز الترجمة، وتقارب يجند، وتحقيق مكاسب من وظيفة صممت في الأصل وتجرى للتأكد من تحديد TMEM184A بمثابة مستقبلات الهيبارين 1. وبالإضافة إلى ذلك، فإن بناء يمكن استخدامها للدراسات معالجة المسائل طوبولوجيا الغشاء والتفاعلات مفصلة البروتين يجند. ويعرض هذا التقرير عآنج من البروتوكولات التجريبية على أساس بناء GFP-TMEM184A أعرب في خلايا الأوعية الدموية التي يمكن بسهولة أن تتكيف للبروتينات جديدة أخرى.

Introduction

تحديد البروتينات مرشح لوظائف جديدة غالبا ما يعتمد على بروتوكولات العزلة القائمة على تقارب تليها الجزئي تحديد التسلسل. ومن الأمثلة الأخيرة من البروتينات التي تم تحديدها حديثا بروتين الغشاء 184A (TMEM184A)، ومستقبلات الهيبارين التي تم تحديدها بعد التفاعلات الهيبارين تقارب وTgPH1، وهو بروتين نطاق pleckstrin التماثل الذي يربط PI فسفوإينوزيتيد (3،5) ف 2 2. يشمل باقي تحديد البروتين رواية تحليل تسلسل مباشر من الببتيدات مثل تلك التي فيت، وآخرون. الذين استخدموا الببتيدات عبر الغشاء إلى التعرف على المنتجات البروتين من الجينات uncharacterized سابقا 3. وبالمثل، وتحديد تسلسل البروتين جديدة يمكن إنجازه باستخدام المعلوماتية الحيوية البحث الأسر بروتين يتميز سابقا مثل تحديد البروتينات 4TM 4 الجديدة. فحص تسلسل الجينات الأسرة aquaporin له اللهحتى أسفرت عن تحديد أعضاء جدد مع وظائف جديدة 5. بعد تحديد وتحليل وظيفة البروتين هو عادة الخطوة التالية التي يمكن في بعض الأحيان أن تدرس باستخدام فحص معين من وظيفة البروتين مثل في حالة aquaporin.

عندما يكون ذلك ممكنا، وظيفة بروتين تم اكتشافه حديثا يمكن فحص مع الأنزيمية محددة أو ما شابه ذلك في فحوصات المختبر وظيفة. لأن العديد من وظائف بروتينات جديدة تعتمد على التفاعلات المعقدة التي تحدث فقط في خلايا سليمة أو الكائنات الحية، في فحوصات المختبر ليست دائما فعالة. ومع ذلك، يجب أن تكون مصممة لفحوصات في الجسم الحي في مثل هذه الطريقة التي تعتمد على تسلسل الجين. في زراعة الخلايا، و / أو الكائنات نموذج بسيط، يمكن ضربة قاضية تقديم الأدلة الداعمة لتحديد بروتين / وظيفة 6. مع البروتينات الجديدة التي تم تحديدها على النحو المشار إليه أعلاه، فإنه غالبا ما يكون غير كاف لمجرد هدم البروتين لتأكيد وظيفة، وهود تصميم في الجسم الحي المقايسات الفنية التي تعتمد على تسلسل الجين يصبح من المهم لتوصيف البروتينات الرواية.

تحديد مؤخرا TMEM184A بمثابة مستقبلات الهيبارين (أن ينظم انتشار في العضلات الملساء الوعائية والاستجابات الالتهابية في الخلايا البطانية) باستخدام اللوني تقارب وMALDI MS شريطة 7 فرصة لتطوير مجموعة من فحوصات بعد أسفرت ضربة قاضية نتائج متسقة مع تحديد . وأكد الاستعراض الأخير أن الهيبارين يتفاعل بشكل خاص مع العديد من عوامل النمو، مستقبلاتها، مكونات المصفوفة خارج الخلية، مستقبلات الخلايا الالتصاق، وغيرها من البروتينات 8. في الأوعية الدموية، الهيبارين والبروتيوغليكان كبريتات heparan (التي تحتوي على سلاسل كبريتات heparan مماثلة في الهيكل للهيبارين) تتفاعل مع عدة مئات من البروتينات 9. لتأكيد وظيفيا ثاوقد ت TMEM184A تشارك مع امتصاص الهيبارين وملزمة، وضعت التقنيات التي استخدمت التركيبة الجينية للTMEM184A. ويتضمن هذا التقرير مجموعة من فحوصات على أساس GFP-TMEM184A بناء لاستخدامها في تأكيد هوية TMEM184A بمثابة مستقبلات الهيبارين.

Protocol

1. تصميم لتعبيد GFP البروتين شراء، أو تصميم وبناء، وبناء GFP الموسومة على أساس البروتين في السؤال. ملاحظة: للحصول بناء شراؤها، هي ناقلات القياسية المتوفرة من المختبرات التجارية التي تشمل بعض أو كل الاقتراحات التالية:…

Representative Results

في حين، من الناحية النظرية، ترنسفكأيشن من أي الحمض النووي بناء في الخلايا يمكن أن يتحقق مع الكواشف ترنسفكأيشن محبة للدهون، وتشير التقارير السابقة ترنسفكأيشن أكثر فعالية من GFP يبني في الخلايا البطانية باستخدام Electroporation لل12. بروتوكول ال…

Discussion

تم تصميم بروتوكولات ذكرت هنا لتقديم أدلة مؤكدة لتحديد TMEM184A بمثابة مستقبلات الهيبارين في خلايا الأوعية الدموية 1. وتستخدم تقنيات ضربة قاضية بشكل روتيني كآلية لتأكيد تحديد البروتينات الرواية. ومع ذلك، بعض الخسائر الوظيفية بعد ضربة قاضية هي عادة ليست دليل…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Research in the Lowe-Krentz lab is supported by research grant HL54269 from the National Institutes of Health to LLK.

Materials

GFP-TMEM184A construct OriGene RG213192
Rhodamine-Heparin Creative PEGWorks HP-204 Light Sensitive
Fluorescein-Heparin Creative PEGWorks HP-201 Light Sensitive
Mowiol EMD Millipore 475904-100GM
Paraformaldehyde (methanol free) Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific PI28908 at Fisher Use in Fume Hood
Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96 well dishes) Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific PI15510 at Fisher Pay attention to shelf-life
Black 96 well plates Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific 064432 at Fisher
A7r5 vascular smooth muscle cell line ATCC CRL 1444 Can be exchanged into MEM medium1
BAOEC bovine aortic endothelial cells Cell Applications, Inc. B304-05 Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7
BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells Cell Applications, Inc. B354-05 Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1
RAOEC rat aortic endothelial cells Cell Applications, Inc. R304-05a Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7
Biotinylated anti-GFP Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific MA5-15256-BTIN
Streptavidin-coated beads Sigma S1638
HeBS Available from Bio-Rad Can be prepared in the lab.  The pH is 6.8
TMEM184A antibody to the N-terminus Santa Cruz Biotechnology sc292006 Only known TMEM184A antibody to N-terminal region.
TMEM184A antibody to the C-terminus Obtained from ProSci Inc, Poway, CA  Pro Sci 5681 ProSci used in figure 1
GFP antibodies Santa Cruz Biotechnology sc9996 Used in figures 5
Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC)
715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3)
Minimal cross-reactivity to minimize any non-specific staining.
CHAPS Purchased from Sigma C5849 Note that this specific catalog number has been discontinued.  Supplier will provide information regarding replacement.
Live imaging 35 mm dishes MatTek (Ashland MA) P35G-1.0 – 20 mm – C
Confocal Microscope Zeiss LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3
Confocal Microscope Nikon C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens Used for images in Figure 5
Confocal Microscope Zeiss Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens Used for images in Figure 2C
Electroporation equipment Bio-Rad Gene Pulser X-Cell System
Electroporation cuvettes Available from MidSci EC2L Can also be obtained from equipment supplier
Plate reader TECAN TECAN Infinite® m200 Pro plate reader Readings in the middle of the wells rather than at the surface.
Computer program for measuring staining intensity Image J https://imagej.nih.gov/ij/
Program and information available on-line
Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail  
Cell Culture trypsin solution Sigma T4174 purchased as a 10X solution

References

  1. Pugh, R. J., et al. Transmembrane Protein 184A Is a Receptor Required for Vascular Smooth Muscle Cell Responses to Heparin. J Biol Chem. 291, 5326-5341 (2016).
  2. Daher, W., et al. Identification of Toxoplasma TgPH1, a pleckstrin homology domain-containing protein that binds to the phosphoinositide PI(3,5)P. Mol Biochem Parasitol. , (2016).
  3. Vit, O., et al. Large-scale identification of membrane proteins based on analysis of trypsin-protected transmembrane segments. J Proteomics. , (2016).
  4. Attwood, M. M., et al. Topology based identification and comprehensive classification of four-transmembrane helix containing proteins (4TMs) in the human genome. BMC genomics. 17, 268 (2016).
  5. Zou, Z., et al. Genome-Wide Identification of Jatropha curcas Aquaporin Genes and the Comparative Analysis Provides Insights into the Gene Family Expansion and Evolution in Hevea brasiliensis. Front Plant Sci. 7, 395 (2016).
  6. Gilotti, A. C., et al. Heparin responses in vascular smooth muscle cells involve cGMP-dependent protein kinase (PKG). J Cell Physiol. 229, 2142-2152 (2014).
  7. Farwell, S. L., et al. Heparin Decreases in Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha)-induced Endothelial Stress Responses Require Transmembrane Protein 184A and Induction of Dual Specificity Phosphatase 1. J Biol Chem. 291, 5342-5354 (2016).
  8. Xu, D., Esko, J. D. Demystifying heparan sulfate-protein interactions. Annu Rev Biochem. 83, 129-157 (2014).
  9. Chiodelli, P., Bugatti, A., Urbinati, C., Rusnati, M. Heparin/Heparan sulfate proteoglycans glycomic interactome in angiogenesis: biological implications and therapeutical use. Molecules. 20, 6342-6388 (2015).
  10. Slee, J. B., Lowe-Krentz, L. J. Actin realignment and cofilin regulation are essential for barrier integrity during shear stress. J Cell Biochem. 114, 782-795 (2013).
  11. Patton, W. A., et al. Identification of a heparin-binding protein using monoclonal antibodies that block heparin binding to porcine aortic endothelial cells. The Biochemical journal. 311, 461-469 (1995).
  12. Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. J Vis Exp. , (2011).
  13. Skalamera, D., et al. Generation of a genome scale lentiviral vector library for EF1alpha promoter-driven expression of human ORFs and identification of human genes affecting viral titer. PloS one. 7, 51733 (2012).
  14. Castro, M., Nikolaev, V. O., Palm, D., Lohse, M. J., Vilardaga, J. P. Turn-on switch in parathyroid hormone receptor by a two-step parathyroid hormone binding mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 16084-16089 (2005).
  15. Albertazzi, L., Arosio, D., Marchetti, L., Ricci, F., Beltram, F. Quantitative FRET analysis with the EGFP-mCherry fluorescent protein pair. Photochem Photobiol. 85, 287-297 (2009).
  16. Wang, S., et al. Domain organization of the ATP-sensitive potassium channel complex examined by fluorescence resonance energy transfer. J Biol Chem. 288, 4378-4388 (2013).
  17. Christiansen, E., Hudson, B. D., Hansen, A. H., Milligan, G., Ulven, T. Development and Characterization of a Potent Free Fatty Acid Receptor 1 (FFA1) Fluorescent Tracer. J Med Chem. 59, 4849-4858 (2016).
  18. Chiang, C. F., Okou, D. T., Griffin, T. B., Verret, C. R., Green Williams, M. N. fluorescent protein rendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions. Arch Biochem Biophys. 394, 229-235 (2001).

Play Video

Cite This Article
Farwell, S. L. N., Slee, J. B., Li, Y., Lowe-Krentz, L. J. Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity. J. Vis. Exp. (120), e55053, doi:10.3791/55053 (2017).

View Video