Ved hjælp af en GFP-mærket TMEM184A Construct til Bekræftelse af Heparin receptor Identity
Summary
En konstruktion, der koder TMEM184A med et GFP-tag ved carboxyterminalen designet til eukaryot ekspression, blev anvendt i assays designet til at bekræfte identifikationen af TMEM184A som heparin receptor i vaskulære celler.
Abstract
Når nye proteiner identificeres gennem affinitet-baserede isolation og bioinformatik analyse, er de ofte stort set ikke-karakteriserede. Antistoffer mod specifikke peptider inden den forudsagte sekvens tillade nogle localization eksperimenter. Men andre mulige interaktioner med antistofferne ofte kan ikke udelukkes. Denne situation gav mulighed for at udvikle et sæt af analyser afhængig af protein sekvens. Specifikt blev en konstruktion, der indeholder gensekvensen koblet til GFP-kodende sekvens ved den C-terminale ende af proteinet opnået og anvendt til disse formål. Forsøg at karakterisere lokalisering, ligand affinitet, og gevinst på funktion blev oprindeligt udviklet og gennemført for at bekræfte identifikationen af TMEM184A som heparin receptor 1. Desuden kan konstruktionen anvendes til undersøgelser vedrørende membran topologi spørgsmål og detaljerede protein-ligand-interaktioner. Nærværende rapport præsenterer arange af eksperimentelle protokoller baseret på GFP-TMEM184A konstrukt udtrykkes i vaskulære celler, der let kan tilpasses til andre hidtil ukendte proteiner.
Introduction
Identifikation af kandidat proteiner til nye funktioner ofte afhænger affinitet-baserede isolation protokoller efterfulgt af delsekvens beslutsomhed. Nylige eksempler på nyligt identificerede proteiner indbefatter transmembranprotein 184A (TMEM184A), en heparin-receptor identificeret efter heparin affinitetsvekselvirkninger 1, og TgPH1, et pleckstrin homologi domæne protein, der binder phosphoinositid PI (3,5) P2 2. Andre hidtil ukendte protein identifikation indebærer direkte sekvensanalyse af peptider som den, Vit, et al. der brugte transmembrane peptider til at identificere proteinprodukter fra tidligere karakteriserede gener 3. På samme måde kan identificere nye proteinsekvenser opnås ved hjælp af bioinformatik søger af tidligere karakteriserede protein familier såsom identifikation af nye 4TM proteiner 4. Undersøgelse af aquaporin familie gensekvenser har alså gav identifikation af nye medlemmer med nye funktioner 5. Efter identifikation, analyse af proteinfunktion er typisk et næste skridt, der undertiden kan undersøges ved anvendelse af et specifikt assay for proteinfunktion såsom i aquaporin tilfældet.
Når det er muligt, kan funktionen af en nyligt identificerede protein undersøges med specifikke enzymatiske eller lignende in vitro-funktion analyser. Fordi mange funktioner af hidtil ukendte proteiner afhænger komplekse vekselvirkninger, der forekommer kun i intakte celler eller organismer, in vitro assays er ikke altid effektive. Dog skal de in vivo-assays designes på en sådan måde, at de er afhængige af gensekvensen. I cellekultur og / eller simple modelorganismer, kan knockdown fremlægge dokumentation for proteinet / funktion identifikation 6. Med hidtil ukendte proteiner identificeret som bemærket ovenfor, er det ofte utilstrækkelig til blot vælte et protein for at bekræfte funktionen, end udformningen af in vivo funktionelle assays, der afhænger af gensekvens bliver vigtig for karakterisering af hidtil ukendte proteiner.
Den nylige identifikation af TMEM184A som heparin receptor (der modulerer proliferation i vaskulær glat muskulatur og inflammatoriske reaktioner i endotelceller) ved hjælp af affinitetskromatografi og MALDI MS 1, 7 gav mulighed for at udvikle en samling af analyser efter knockdown givet resultater i overensstemmelse med identifikationen . En nylig gennemgang bekræftede, at heparin interagerer specifikt med mange vækstfaktorer, deres receptorer, ekstracellulære matrixkomponenter, celleadhæsionsreceptorer, og andre proteiner 8. I det vaskulære system, heparin og heparansulfatproteoglycaner (indeholdende heparansulfat kæder samme struktur som heparin) interagerer med flere hundrede proteiner 9. At funktionelt bekræfte that TMEM184A var involveret med heparin optagelse og binding blev teknikker, der er ansat genkonstruktionen for TMEM184A udviklet. Nærværende rapport indeholder en samling af analyser baseret på en GFP-TMEM184A konstruere til brug i at bekræfte identiteten af TMEM184A som heparin receptor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollerne rapporteret her blev designet til at give bekræftende bevis for identifikation af TMEM184A som heparin receptor i vaskulære celler 1. Knockdown teknikker anvendes rutinemæssigt som en mekanisme til at bekræfte identifikationen af hidtil ukendte proteiner. Men nogle funktionelle resultat efter knockdown er typisk ikke tilstrækkeligt bevis for, at en kandidat protein er faktisk den korrekte receptor (eller andre funktionelle protein). Det er også vigtigt at have dokumentat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the Lowe-Krentz lab is supported by research grant HL54269 from the National Institutes of Health to LLK.
Materials
| GFP-TMEM184A construct | OriGene | RG213192 | |
| Rhodamine-Heparin | Creative PEGWorks | HP-204 | Light Sensitive |
| Fluorescein-Heparin | Creative PEGWorks | HP-201 | Light Sensitive |
| Mowiol | EMD Millipore | 475904-100GM | |
| Paraformaldehyde (methanol free) | Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific | PI28908 at Fisher | Use in Fume Hood |
| Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96 well dishes) | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | PI15510 at Fisher | Pay attention to shelf-life |
| Black 96 well plates | Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific | 064432 at Fisher | |
| A7r5 vascular smooth muscle cell line | ATCC | CRL 1444 | Can be exchanged into MEM medium1 |
| BAOEC bovine aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | B304-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7 |
| BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells | Cell Applications, Inc. | B354-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1 |
| RAOEC rat aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | R304-05a | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7 |
| Biotinylated anti-GFP | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | MA5-15256-BTIN | |
| Streptavidin-coated beads | Sigma | S1638 | |
| HeBS | Available from Bio-Rad | Can be prepared in the lab. The pH is 6.8 | |
| TMEM184A antibody to the N-terminus | Santa Cruz Biotechnology | sc292006 | Only known TMEM184A antibody to N-terminal region. |
| TMEM184A antibody to the C-terminus | Obtained from ProSci Inc, Poway, CA | Pro Sci 5681 | ProSci used in figure 1 |
| GFP antibodies | Santa Cruz Biotechnology | sc9996 | Used in figures 5 |
| Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA | 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3) |
Minimal cross-reactivity to minimize any non-specific staining. |
| CHAPS | Purchased from Sigma | C5849 | Note that this specific catalog number has been discontinued. Supplier will provide information regarding replacement. |
| Live imaging 35 mm dishes | MatTek (Ashland MA) | P35G-1.0 – 20 mm – C | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens | Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3 |
| Confocal Microscope | Nikon | C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens | Used for images in Figure 5 |
| Confocal Microscope | Zeiss | Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens | Used for images in Figure 2C |
| Electroporation equipment | Bio-Rad | Gene Pulser X-Cell System | |
| Electroporation cuvettes | Available from MidSci | EC2L | Can also be obtained from equipment supplier |
| Plate reader | TECAN | TECAN Infinite® m200 Pro plate reader | Readings in the middle of the wells rather than at the surface. |
| Computer program for measuring staining intensity | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ Program and information available on-line |
Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail |
| Cell Culture trypsin solution | Sigma | T4174 | purchased as a 10X solution |
References
- Pugh, R. J., et al. Transmembrane Protein 184A Is a Receptor Required for Vascular Smooth Muscle Cell Responses to Heparin. J Biol Chem. 291, 5326-5341 (2016).
- Daher, W., et al. Identification of Toxoplasma TgPH1, a pleckstrin homology domain-containing protein that binds to the phosphoinositide PI(3,5)P. Mol Biochem Parasitol. , (2016).
- Vit, O., et al. Large-scale identification of membrane proteins based on analysis of trypsin-protected transmembrane segments. J Proteomics. , (2016).
- Attwood, M. M., et al. Topology based identification and comprehensive classification of four-transmembrane helix containing proteins (4TMs) in the human genome. BMC genomics. 17, 268 (2016).
- Zou, Z., et al. Genome-Wide Identification of Jatropha curcas Aquaporin Genes and the Comparative Analysis Provides Insights into the Gene Family Expansion and Evolution in Hevea brasiliensis. Front Plant Sci. 7, 395 (2016).
- Gilotti, A. C., et al. Heparin responses in vascular smooth muscle cells involve cGMP-dependent protein kinase (PKG). J Cell Physiol. 229, 2142-2152 (2014).
- Farwell, S. L., et al. Heparin Decreases in Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha)-induced Endothelial Stress Responses Require Transmembrane Protein 184A and Induction of Dual Specificity Phosphatase 1. J Biol Chem. 291, 5342-5354 (2016).
- Xu, D., Esko, J. D. Demystifying heparan sulfate-protein interactions. Annu Rev Biochem. 83, 129-157 (2014).
- Chiodelli, P., Bugatti, A., Urbinati, C., Rusnati, M. Heparin/Heparan sulfate proteoglycans glycomic interactome in angiogenesis: biological implications and therapeutical use. Molecules. 20, 6342-6388 (2015).
- Slee, J. B., Lowe-Krentz, L. J. Actin realignment and cofilin regulation are essential for barrier integrity during shear stress. J Cell Biochem. 114, 782-795 (2013).
- Patton, W. A., et al. Identification of a heparin-binding protein using monoclonal antibodies that block heparin binding to porcine aortic endothelial cells. The Biochemical journal. 311, 461-469 (1995).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. J Vis Exp. , (2011).
- Skalamera, D., et al. Generation of a genome scale lentiviral vector library for EF1alpha promoter-driven expression of human ORFs and identification of human genes affecting viral titer. PloS one. 7, 51733 (2012).
- Castro, M., Nikolaev, V. O., Palm, D., Lohse, M. J., Vilardaga, J. P. Turn-on switch in parathyroid hormone receptor by a two-step parathyroid hormone binding mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 16084-16089 (2005).
- Albertazzi, L., Arosio, D., Marchetti, L., Ricci, F., Beltram, F. Quantitative FRET analysis with the EGFP-mCherry fluorescent protein pair. Photochem Photobiol. 85, 287-297 (2009).
- Wang, S., et al. Domain organization of the ATP-sensitive potassium channel complex examined by fluorescence resonance energy transfer. J Biol Chem. 288, 4378-4388 (2013).
- Christiansen, E., Hudson, B. D., Hansen, A. H., Milligan, G., Ulven, T. Development and Characterization of a Potent Free Fatty Acid Receptor 1 (FFA1) Fluorescent Tracer. J Med Chem. 59, 4849-4858 (2016).
- Chiang, C. F., Okou, D. T., Griffin, T. B., Verret, C. R., Green Williams, M. N. fluorescent protein rendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions. Arch Biochem Biophys. 394, 229-235 (2001).
