Summary

Ved hjælp af en GFP-mærket TMEM184A Construct til Bekræftelse af Heparin receptor Identity

Published: February 17, 2017
doi:

Summary

En konstruktion, der koder TMEM184A med et GFP-tag ved carboxyterminalen designet til eukaryot ekspression, blev anvendt i assays designet til at bekræfte identifikationen af ​​TMEM184A som heparin receptor i vaskulære celler.

Abstract

Når nye proteiner identificeres gennem affinitet-baserede isolation og bioinformatik analyse, er de ofte stort set ikke-karakteriserede. Antistoffer mod specifikke peptider inden den forudsagte sekvens tillade nogle localization eksperimenter. Men andre mulige interaktioner med antistofferne ofte kan ikke udelukkes. Denne situation gav mulighed for at udvikle et sæt af analyser afhængig af protein sekvens. Specifikt blev en konstruktion, der indeholder gensekvensen koblet til GFP-kodende sekvens ved den C-terminale ende af proteinet opnået og anvendt til disse formål. Forsøg at karakterisere lokalisering, ligand affinitet, og gevinst på funktion blev oprindeligt udviklet og gennemført for at bekræfte identifikationen af TMEM184A som heparin receptor 1. Desuden kan konstruktionen anvendes til undersøgelser vedrørende membran topologi spørgsmål og detaljerede protein-ligand-interaktioner. Nærværende rapport præsenterer arange af eksperimentelle protokoller baseret på GFP-TMEM184A konstrukt udtrykkes i vaskulære celler, der let kan tilpasses til andre hidtil ukendte proteiner.

Introduction

Identifikation af kandidat proteiner til nye funktioner ofte afhænger affinitet-baserede isolation protokoller efterfulgt af delsekvens beslutsomhed. Nylige eksempler på nyligt identificerede proteiner indbefatter transmembranprotein 184A (TMEM184A), en heparin-receptor identificeret efter heparin affinitetsvekselvirkninger 1, og TgPH1, et pleckstrin homologi domæne protein, der binder phosphoinositid PI (3,5) P2 2. Andre hidtil ukendte protein identifikation indebærer direkte sekvensanalyse af peptider som den, Vit, et al. der brugte transmembrane peptider til at identificere proteinprodukter fra tidligere karakteriserede gener 3. På samme måde kan identificere nye proteinsekvenser opnås ved hjælp af bioinformatik søger af tidligere karakteriserede protein familier såsom identifikation af nye 4TM proteiner 4. Undersøgelse af aquaporin familie gensekvenser har alså gav identifikation af nye medlemmer med nye funktioner 5. Efter identifikation, analyse af proteinfunktion er typisk et næste skridt, der undertiden kan undersøges ved anvendelse af et specifikt assay for proteinfunktion såsom i aquaporin tilfældet.

Når det er muligt, kan funktionen af en nyligt identificerede protein undersøges med specifikke enzymatiske eller lignende in vitro-funktion analyser. Fordi mange funktioner af hidtil ukendte proteiner afhænger komplekse vekselvirkninger, der forekommer kun i intakte celler eller organismer, in vitro assays er ikke altid effektive. Dog skal de in vivo-assays designes på en sådan måde, at de er afhængige af gensekvensen. I cellekultur og / eller simple modelorganismer, kan knockdown fremlægge dokumentation for proteinet / funktion identifikation 6. Med hidtil ukendte proteiner identificeret som bemærket ovenfor, er det ofte utilstrækkelig til blot vælte et protein for at bekræfte funktionen, end udformningen af in vivo funktionelle assays, der afhænger af gensekvens bliver vigtig for karakterisering af hidtil ukendte proteiner.

Den nylige identifikation af TMEM184A som heparin receptor (der modulerer proliferation i vaskulær glat muskulatur og inflammatoriske reaktioner i endotelceller) ved hjælp af affinitetskromatografi og MALDI MS 1, 7 gav mulighed for at udvikle en samling af analyser efter knockdown givet resultater i overensstemmelse med identifikationen . En nylig gennemgang bekræftede, at heparin interagerer specifikt med mange vækstfaktorer, deres receptorer, ekstracellulære matrixkomponenter, celleadhæsionsreceptorer, og andre proteiner 8. I det vaskulære system, heparin og heparansulfatproteoglycaner (indeholdende heparansulfat kæder samme struktur som heparin) interagerer med flere hundrede proteiner 9. At funktionelt bekræfte that TMEM184A var involveret med heparin optagelse og binding blev teknikker, der er ansat genkonstruktionen for TMEM184A udviklet. Nærværende rapport indeholder en samling af analyser baseret på en GFP-TMEM184A konstruere til brug i at bekræfte identiteten af ​​TMEM184A som heparin receptor.

Protocol

1. Design af en GFP-protein Construct Indkøb, eller design og opbygning, et GFP-mærket konstruktion baseret på det pågældende protein. BEMÆRK: en købt konstrukt, standard vektorer er tilgængelige fra kommercielle laboratorier, der omfatter alle eller nogle af følgende forslag: For et membranprotein, vælg C-terminale placering af GFP, fordi det er mindre sandsynligt, at forstyrre membranprotein trafficking. Overvej en forlængelse mellem genet af interesse og GFP hvis der er grund til at antag…

Representative Results

Mens i teorien transfektion af enhver DNA-konstruktion i celler kunne opnås med lipofile transfektionsreagenser, tidligere rapporter indikerer mere effektiv transfektion af GFP-konstruktioner i endotelceller under anvendelse af elektroporering 12. Protokollen tilvejebragt her typisk opnået GFP-konstruktion ekspression i mere end 80% af de primære-afledte endotelceller og glatte muskelceller anvendte. Design af konstruktionen anvendte anvendt et kommercielt tilg…

Discussion

Protokollerne rapporteret her blev designet til at give bekræftende bevis for identifikation af TMEM184A som heparin receptor i vaskulære celler 1. Knockdown teknikker anvendes rutinemæssigt som en mekanisme til at bekræfte identifikationen af ​​hidtil ukendte proteiner. Men nogle funktionelle resultat efter knockdown er typisk ikke tilstrækkeligt bevis for, at en kandidat protein er faktisk den korrekte receptor (eller andre funktionelle protein). Det er også vigtigt at have dokumentat…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Research in the Lowe-Krentz lab is supported by research grant HL54269 from the National Institutes of Health to LLK.

Materials

GFP-TMEM184A construct OriGene RG213192
Rhodamine-Heparin Creative PEGWorks HP-204 Light Sensitive
Fluorescein-Heparin Creative PEGWorks HP-201 Light Sensitive
Mowiol EMD Millipore 475904-100GM
Paraformaldehyde (methanol free) Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific PI28908 at Fisher Use in Fume Hood
Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96 well dishes) Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific PI15510 at Fisher Pay attention to shelf-life
Black 96 well plates Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific 064432 at Fisher
A7r5 vascular smooth muscle cell line ATCC CRL 1444 Can be exchanged into MEM medium1
BAOEC bovine aortic endothelial cells Cell Applications, Inc. B304-05 Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7
BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells Cell Applications, Inc. B354-05 Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1
RAOEC rat aortic endothelial cells Cell Applications, Inc. R304-05a Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7
Biotinylated anti-GFP Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific MA5-15256-BTIN
Streptavidin-coated beads Sigma S1638
HeBS Available from Bio-Rad Can be prepared in the lab.  The pH is 6.8
TMEM184A antibody to the N-terminus Santa Cruz Biotechnology sc292006 Only known TMEM184A antibody to N-terminal region.
TMEM184A antibody to the C-terminus Obtained from ProSci Inc, Poway, CA  Pro Sci 5681 ProSci used in figure 1
GFP antibodies Santa Cruz Biotechnology sc9996 Used in figures 5
Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC)
715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3)
Minimal cross-reactivity to minimize any non-specific staining.
CHAPS Purchased from Sigma C5849 Note that this specific catalog number has been discontinued.  Supplier will provide information regarding replacement.
Live imaging 35 mm dishes MatTek (Ashland MA) P35G-1.0 – 20 mm – C
Confocal Microscope Zeiss LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3
Confocal Microscope Nikon C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens Used for images in Figure 5
Confocal Microscope Zeiss Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens Used for images in Figure 2C
Electroporation equipment Bio-Rad Gene Pulser X-Cell System
Electroporation cuvettes Available from MidSci EC2L Can also be obtained from equipment supplier
Plate reader TECAN TECAN Infinite® m200 Pro plate reader Readings in the middle of the wells rather than at the surface.
Computer program for measuring staining intensity Image J https://imagej.nih.gov/ij/
Program and information available on-line
Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail  
Cell Culture trypsin solution Sigma T4174 purchased as a 10X solution

References

  1. Pugh, R. J., et al. Transmembrane Protein 184A Is a Receptor Required for Vascular Smooth Muscle Cell Responses to Heparin. J Biol Chem. 291, 5326-5341 (2016).
  2. Daher, W., et al. Identification of Toxoplasma TgPH1, a pleckstrin homology domain-containing protein that binds to the phosphoinositide PI(3,5)P. Mol Biochem Parasitol. , (2016).
  3. Vit, O., et al. Large-scale identification of membrane proteins based on analysis of trypsin-protected transmembrane segments. J Proteomics. , (2016).
  4. Attwood, M. M., et al. Topology based identification and comprehensive classification of four-transmembrane helix containing proteins (4TMs) in the human genome. BMC genomics. 17, 268 (2016).
  5. Zou, Z., et al. Genome-Wide Identification of Jatropha curcas Aquaporin Genes and the Comparative Analysis Provides Insights into the Gene Family Expansion and Evolution in Hevea brasiliensis. Front Plant Sci. 7, 395 (2016).
  6. Gilotti, A. C., et al. Heparin responses in vascular smooth muscle cells involve cGMP-dependent protein kinase (PKG). J Cell Physiol. 229, 2142-2152 (2014).
  7. Farwell, S. L., et al. Heparin Decreases in Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha)-induced Endothelial Stress Responses Require Transmembrane Protein 184A and Induction of Dual Specificity Phosphatase 1. J Biol Chem. 291, 5342-5354 (2016).
  8. Xu, D., Esko, J. D. Demystifying heparan sulfate-protein interactions. Annu Rev Biochem. 83, 129-157 (2014).
  9. Chiodelli, P., Bugatti, A., Urbinati, C., Rusnati, M. Heparin/Heparan sulfate proteoglycans glycomic interactome in angiogenesis: biological implications and therapeutical use. Molecules. 20, 6342-6388 (2015).
  10. Slee, J. B., Lowe-Krentz, L. J. Actin realignment and cofilin regulation are essential for barrier integrity during shear stress. J Cell Biochem. 114, 782-795 (2013).
  11. Patton, W. A., et al. Identification of a heparin-binding protein using monoclonal antibodies that block heparin binding to porcine aortic endothelial cells. The Biochemical journal. 311, 461-469 (1995).
  12. Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. J Vis Exp. , (2011).
  13. Skalamera, D., et al. Generation of a genome scale lentiviral vector library for EF1alpha promoter-driven expression of human ORFs and identification of human genes affecting viral titer. PloS one. 7, 51733 (2012).
  14. Castro, M., Nikolaev, V. O., Palm, D., Lohse, M. J., Vilardaga, J. P. Turn-on switch in parathyroid hormone receptor by a two-step parathyroid hormone binding mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 16084-16089 (2005).
  15. Albertazzi, L., Arosio, D., Marchetti, L., Ricci, F., Beltram, F. Quantitative FRET analysis with the EGFP-mCherry fluorescent protein pair. Photochem Photobiol. 85, 287-297 (2009).
  16. Wang, S., et al. Domain organization of the ATP-sensitive potassium channel complex examined by fluorescence resonance energy transfer. J Biol Chem. 288, 4378-4388 (2013).
  17. Christiansen, E., Hudson, B. D., Hansen, A. H., Milligan, G., Ulven, T. Development and Characterization of a Potent Free Fatty Acid Receptor 1 (FFA1) Fluorescent Tracer. J Med Chem. 59, 4849-4858 (2016).
  18. Chiang, C. F., Okou, D. T., Griffin, T. B., Verret, C. R., Green Williams, M. N. fluorescent protein rendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions. Arch Biochem Biophys. 394, 229-235 (2001).

Play Video

Cite This Article
Farwell, S. L. N., Slee, J. B., Li, Y., Lowe-Krentz, L. J. Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity. J. Vis. Exp. (120), e55053, doi:10.3791/55053 (2017).

View Video