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Genetics

GFPタグTMEM184Aを使用すると、ヘパリン受容体のアイデンティティの確認のために構築します

doi: 10.3791/55053 Published: February 17, 2017

Summary

真核生物の発現のために設計されたカルボキシ末端にGFPタグを有する構築物をコードするTMEM184Aは、血管細胞中のヘパリン受容体としてTMEM184Aの同定を確認するために設計されたアッセイに使用しました。

Abstract

新規タンパク質は、親和性に基づく分離やバイオインフォマティクス解析によって識別されると、彼らはしばしば、主に特徴付けられていないです。予測される配列内の特定のペプチドに対する抗体は、いくつかのローカライズ実験を可能にします。しかし、抗体と他の可能な相互作用は、多くの場合、除外することはできません。この状況は、タンパク質配列に依存するアッセイのセットを開発する機会を提供しました。具体的には、タンパク質のC末端にGFPコード配列に連結された遺伝子配列を含む構築物が得られ、これらの目的のために使用しました。局在化、リガンド親和性、および機能の利得を特徴付けるための実験は、最初に設計し、ヘパリン受容体1としてTMEM184Aの同定を確認するために行きました。さらに、構築物は膜トポロジーの問題に取り組む研究および詳細なタンパク質 - リガンド相互作用のために使用することができます。本報告書は、ARを提示します簡単に他の新規タンパク質のために適合させることができる血管細胞で発現したGFP-TMEM184A構築に基づいて実験プロトコルのアンジュ。

Introduction

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新規な機能のための候補タンパク質の同定は、多くの場合、部分配列決意が続く親和性に基づく分離プロトコルに依存します。新たに同定されたタンパク質の最近の例は、膜貫通タンパク質184A(TMEM184A)、ヘパリン親和性相互作用1後に同定ヘパリン受容体、およびTgPH1、ホスホイノシチドPI(3,5)P 2 2を特異的に結合するプレクストリン相同ドメインタンパク質が含まれます。その他の新規タンパク質の同定は、このような、 ビタミンによって、そのようなペプチドの直接配列分析を必要とします人は、以前に特徴付けられていない遺伝子3からタンパク質産物を識別するために、膜貫通ペプチドを使用していました。同様に、新規のタンパク質配列の同定は、このような新しい4TMタンパク質4の識別として以前に特徴付けられるタンパク質ファミリーの探索バイオインフォマティクスを用いて達成することができます。アクアポリンファミリー遺伝子配列の検査は、Alを有しますそのように新しい機能5と新メンバーの同定をもたらしました。識別後、タンパク質機能の解析は、しばしば、このようなアクアポリンの場合のように、タンパク質機能の特異的なアッセイを用いて試験することができる次のステップは、典型的には。

可能な場合は、新たに同定されたタンパク質の機能は、特定の酵素または類似のインビトロ機能アッセイを用いて調べることができます。新規タンパク質の多くの機能が唯一無傷の細胞または生物で発生する複雑な相互作用に依存しているため、in vitroアッセイは、必ずしも有効ではありません。しかし、 インビボアッセイは、それらが遺伝子配列に依存するように設計されなければなりません。細胞培養、および/または単純なモデル生物では、ノックダウンは、タンパク質/機能同定6のための証拠を提供することができます。上記のように同定された新規のタンパク質と、単に機能を確認するために、タンパク質をノックダウンすることがしばしば不十分です、D遺伝子配列に依存してin vivoでの機能アッセイの設計は、新規タンパク質の特徴付けのために重要になります。

ノックダウンは、識別と一致する結果が得られた後、ヘパリンレセプターとしてTMEM184Aの最近の同定は、アフィニティークロマトグラフィーおよびMALDI MS 1を使用して(すなわち、血管平滑筋および内皮細胞における炎症応答において増殖を調節する)、7は、アッセイのコレクションを開発する機会を提供し。最近のレビューは、ヘパリンは、多くの増殖因子、それらの受容体、細胞外マトリックス成分、細胞接着受容体、および他のタンパク質8と特異的に相互作用することが確認されました。血管系では、ヘパリンおよびヘパラン硫酸プロテオグリカン(ヘパリンと同様の構造でヘパラン硫酸鎖を含む)は、数百のタンパク質9と相互作用します。機能的に股関節を確認するために、トンTMEM184Aはヘパリンの取り込みと結合に関与していた、TMEM184Aための遺伝子構築物を使用される技術が開発されました。本レポートでは、GFP-TMEM184Aに基づくアッセイのコレクションはヘパリン受容体としてTMEM184Aの身元を確認するのに使用するための構築物が含まれます。

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Protocol

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GFPタンパク質構築物の1デザイン

  1. 購入、または設計および構築、問題のタンパク質に基づいたGFPタグ付きコンストラクト。
    注:購入した構造物については、標準的なベクターには、次の提案の一部またはすべてを含む商業研究所から入手可能である:膜タンパク質の場合、膜タンパク質輸送に干渉しにくいので、GFPのC末端の場所を選択します。問題のタンパク質のC末端をコンパクトタンパク質のドメインに折り畳まれていると信じる理由がある場合には、目的の遺伝子とGFPの間の延長を考えてみましょう。一般的な真核細胞発現のための構築物を選択したが、細菌系での生産を構築することができます。 GFPは、タンパク質の活性を妨害する可能性がいくつかの実験のために必要であれば、GFPを除去することができることによって(例えばTEVプロテアーゼのような)の切断部位が含まれます。このような局在や親和性のための追加のタグとして他のインサートを追加teractions( 例えば、のHis6)。これは、本明細書に記載のアッセイのために必要ではなかったが、GFPの前に、GFPの除去が望まれる場合には、他のアッセイを容易にする、または遺伝子に直接隣接する便利かもしれません。

血管細胞における2 GFP-TMEM184A式

  1. 0.2%のゼラチンコーティングした組織培養皿上で培養内皮細胞又は血管平滑筋細胞を、以前に報告されているように1、6、7。
  2. リンス100ミリメートル、またはそれ以上、細胞のコンフルエント皿に5mLの細胞培養トリプシン溶液(w / vの0.5%)を加えます。細胞は単にプレートから放出されるまで、37℃でインキュベートし、滅菌ポリプロピレン遠心チューブに細胞を移します。
  3. トリプシン活性を制限するために、細胞/トリプシン溶液に、ルーチンの培養に使用されるように、トリプシンインヒビター( 例えば、定期的な培地の等量)を加えます。 approximで5分間細胞をペレットately 600 XG(または適切な速度と時間は標準的な組織培養のための細胞をペレット化するために)。上清を吸引除去します。
  4. 時間の細胞の量を制限するHEBS(Hepes緩衝生理食塩水)、エレクトロポレーション緩衝液1mlに再懸濁細胞は、ペレットまたは懸濁液です。氷上で細胞懸濁液を置き、氷上で残りの手順を実行します。
    注:ペレットは、前の再懸濁にHEBSで1回洗浄することができます。
  5. 20μg/ mLのDNAの最終濃度を達成するために、細胞にGFPタグTMEM184Aプラスミドの十分な量を加えます。 GFP構築物のために同一のプロトコルを使用してください。
  6. エレクトロポレーションキュベットにHEBS中の細胞溶液の約0.4ミリリットルを置きます。使用前にキュベットを予め冷やし。
  7. 以下の条件を用いて、細胞をエレクトロポレーション:指数関数的減衰、500μF、∞オーム、および170 Vを
    注:所定の細胞型のための電圧を最適化する必要があります。内皮細胞および平滑筋セルを用いた予備的研究Lタイプは、例えば 図10に示すように 、ここで留意最適電圧値を決定するために、GFP-ビンキュリンコンストラクトを用いて達成しました。
    1. エレクトロポレーションを最適化するには、(いくつかの標準的な細胞タイプのための条件を含む)機器メーカーの推奨で始まります。希望の構築物のサイズおよび蛍光特性に類似の構築目的の構築物または対照の蛍光タンパク質を使用してください。
      注:小さな核酸は、大きな構成よりも容易に細胞に侵入するように見えるので、唯一の蛍光タンパク質を有する構築物は、1より大きく表現しやすいかもしれません。
    2. 細胞生存率、蛍光構築物は24および48時間後に発現している細胞の割合、および発現強度を決定するために、蛍光顕微鏡を使用してください。
      注:生存率が低い場合には、わずかに電圧および/または時間を減らします。培養表面から細胞の放出および復帰の間の最短時間を目指します培養の細胞生存を強化します。生存率が高く、発現が低い場合、時間または第二のパルスのわずかな増加は、構築物の取り込みを改善することができます。最適条件および発現は、細胞型間で変化します。構築物を発現する細胞の割合が高いが、強度が低く、DNA濃度を増加させ、タンパク質の半減期ならびに発現に基づいて変化する最適な強度、時間かけてトランスフェクトされた細胞を監視する場合、強度を向上させることができます。染色強度は、抗GFP抗体を用いたGFPの免疫蛍光染色によって、必要に応じて、いくつかのアッセイのために拡大することができ
  8. エレクトロポレーション後、イメージングまたは組織培養皿にカバースリップと6の30mm組織培養ウェルに細胞を播種します。培養細胞を、標準的な細胞培養法を用いて。
  9. オプション:任意のHEBSエレクトロポレーションバッファーを除去するために、24時間後に培養液を交換してください。

GFP-TMEMの3可視化184Aのローカライズ

  1. 少なくとも24時間培養した後、PBSで穏やかに振盪しながら細胞を洗い流します。 GFPの退色を避けるために、明るい光への露出を制限します。
  2. 穏やかに振盪しながら室温で15分間、PBS中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)で細胞を固定してください。細胞を透過性にすることができる任意のメタノールを含有する試薬を使用しないでください。リガンド相互作用を評価する必要がない場合はメタノールで固定を使用することができます。
    注意:パラホルムアルデヒドは有毒です。適切な個人保護具を着用します。注意して、ドラフト内で使用し、適切に廃棄します。
  3. 上記のようにPBSですすいでください。抗体ベースの染色のために、3.6以下を参照してください。
  4. マウントモヴィオールまたは他の適切なマウンティング培地を用いてスライドにカバースリップ。
  5. 画像は、GFPの励起および発光スペクトルのための適切なフィルターセットを用いて、共焦点または蛍光顕微鏡を用いてスライドします。共焦点顕微鏡法があるため、z平面内のサンプルを分離する能力で好ましいです。 quのためのグレースケールで画像を保存TIF形式のantitation目的(イラストフルカラー画像に加えて)。
  6. 細胞によって発現されるWT TMEM184Aとの比較のために、 例えば TMEM184A配列からのペプチド(複数可)に調製した一次抗体を用いて免疫蛍光のために他の細胞を、調製1。 GFP-TEMEM184Aの同定はまた、GFPに対する抗体を用いて達成することができます。同一の顕微鏡技術により、両方の細胞サンプルを評価します。

4.ローダミンヘパリンGFP-TMEM184Aトランスフェクト細胞との結合と共局在

  1. 100μg/ mLのローダミン - ヘパリンとGFP-TMEM184A発現処置細胞は、培養培地に添加し、そして細胞はのA7r5細胞を、10分より典型的には一定時間、インキュベートすることを可能にします。すすぎ、3.1と3.2のように修正します。
    注:最適な時間とリガンドの濃度は、細胞応答、得られたリガンドおよび画像強度の蛍光強度に依存します。このconcentratそれは他のアッセイ11において50%以上の応答をもたらすためのヘパリンのイオンを使用しました。この濃度は、標準的な蛍光顕微鏡法を用いて可視化することができるので、それを増加させる必要はなかったです。細胞中の下、蛍光の非標識ヘパリンの結果とローダミンヘパリンの希釈は、このように画像および定量化することはより困難です。
  2. GFP-TMEM184Aトランスフェクションに結合するローダミン - ヘパリンを定量するために、トランスフェクトされたGFP-TMEM184Aせずに同一の細胞を調製。
  3. 画像に適切なGFP(488 nm)をローダミン(543 nm)の励起および発光と共焦点顕微鏡を用いて細胞(500 - GFPのための530 nmおよびローダミンのためのより大きい560 nm)の値は、共局在を決定します。統計情報を取得するために、少なくとも3つの別々の実験からの少なくとも50個の細胞の画像を得ます。実験内で同一の設定を維持し、コントロールサンプル(複数可)(無処理で例えば、トランスフェクトされた細胞)を採用番目複数の実験の分析のためのデータを標準化するために使用することができます。
  4. 結合の定量化のために各セルに/取り込みを結合相対ローダミンを決定するためのコンピュータプログラムを用いて画像を調べます。
    注:彼らは分析のために便利であり、彼らが最初にその形式で保存されなかった場合、多くのコンピュータプログラムにグレースケールに変換することができるようにTIF画像が採用されるべきです。画像J(フリーウェア)は、本分析で用いられると、画像内の任意のユーザ定義領域について測定すべき領域とピクセル強度を可能にしました。
    1. 蛍光画像内の細胞を一周し、その空間内の強度を決定するための対策ツールを使用するためにフリーハンドツールを使用します。
      注:これらの測定値は異なる形状と異なるセルを比較する方法を提供し、ユーザ定義領域(全細胞、核など )のための全強度を計算するために必要な情報を提供しています。背景の領域にわたって強度が報告されることを意味し、その促進分析のためのバックグラウンド強度のSコレクション。
    2. 強度を乗じた面積を計算し、地域の同じ量のバックグラウンドを減算するスプレッドシートにエクスポートします。統計的有意性を得るために十分な細胞/実験用の蛍光/細胞を平均化。

ローダミンヘパリンへのGFP-TMEM184Aから5.蛍光共鳴エネルギー移動

  1. トランスフェクトされた細胞を調製し、3.1のように200μg/ mLのローダミンタグ付きリガンドとインキュベートします。蛍光リガンドとのインキュベーション時間は細胞型に依存することに注意してください。唯一のPFAで固定し、イメージングのためのスライドをマウントします。
  2. ( - ; FRET 685 nmの566)まず、ローダミン発光のための405 nmおよび画像で励起します。第二に、GFP(493の画像 - 530)のために488で励起し、第三、( - 685 566の画像)ローダミンのために561で励起します。 GFP-TMEM184Aなしまたはローダミンヘパリンなしのコントロールが重要です。

ローダミンHepariの6ライブセルイメージングn個の取り込み

  1. 生細胞イメージングのために設計された個々の皿にGFP-TMEM184Aトランスフェクト細胞をシードし、プロトコル3のように扱います。
    注:必要な細胞の数は、所望の細胞型及び密度に依存します。懸濁液中にある時間の細胞の量を最小限に抑えるために、細胞をカウントされません。 48時間でコンフルエント近くの細胞を得るために、6 35 mmのライブイメージング皿に100mMのコンフルエント皿から種子細胞。
  2. 48時間後、フェノールレッドを含まない培地で培地を交換してください。
  3. 温度を維持するために加温ステージを共焦点顕微鏡への細胞のディッシュに移し、顕微鏡の焦点を合わせます。
  4. 皿にピペットを100μg/ mLのローダミン - ヘパリン、穏やかに混合します。
  5. すぐにライブ映像の記録を開始します。ヘパリンのない細胞取り込みは、ビュー領域内で発生しない場合は、ローダミン標識を含む少なくとも1つの緑色の小胞を有する細胞を同定するためにわずかに皿を動かします。
    注:イメージング励起および発光仕様がありますヘパリン取り込みプロトコル(セクション5)と同じ。画像間の時間は約16秒でした。実験や顕微鏡の条件は、典型的には、画像を得ることができる速度を決定します。

培養細胞からのGFP-TMEM184AとGFPの7の単離

  1. 培地を除去し、PBSで洗浄した後、2mLの0.2%(対照結合アッセイのために)GFP-TMEM184AまたはGFPを発現する細胞のの150mmプレートに、プロテアーゼ阻害剤と(w / v)のCHAPS、1×PBS溶液を加えます。 、皿から細胞をこすり取る氷上で15 mLのポリプロピレンチューブに細胞/ CHAPSソリューションを配置し、タップしてよく混ぜます。 GFPタグは以下の結合アッセイのために漂白されていることを確認するために、明るい光の中ですべてのステップを完了します。
  2. 具体的にGFP-TMEM184A(または適切なGFPコントロール)をバインドするには、ソリューションに2μgの/ mLのビオチン化抗GFP抗体を追加し、揺り動かしながら4℃で一晩インキュベートします。
  3. 500μLを追加3〜5分間、約600×gで少なくとも5 mLの0.2%CHAPS / PBSと遠心機にストレプトアビジン - アガロースビーズの。上清を取り除きます。毎回新鮮なCHAPS / PBSでさらに2回繰り返します。抗体と細胞液にビーズを加え、ビーズがGFPまたはGFP-TMEM184Aに結合したビオチン化抗GFP抗体に結合することができるように揺らしながら4℃で一晩インキュベートします。
  4. (7.3のように)遠心分離することにより、ビーズをペレット化し、非結合物質を除去します。洗浄するために、少なくとも5 mLの0.2%CHAPS / PBS /プロテアーゼ阻害剤を加えます。効果的に未結合タンパク質を除去するために、少なくとも3回繰り返して洗浄し、遠心分離。
  5. 最終洗浄を除去した後、自由GFP-TMEM184Aまたはフリーの結果(抗体結合-GFPを解離させるために0.2 Mグリシン/ 3分間、氷上でPBS中0.2%のCHAPS(HClを用いて2.0のpH)1mLでビーズをインキュベートGFP)。 30秒ごとをタップして穏やかに混合します。
  6. 約600×gで遠心分離し、精製Pを含む上清を転送5 mLの1 M重炭酸ナトリウム(pHを7にもたらす)と直接中和し、新しい15mLのチューブにrotein。
  7. 万ダルトンの分子量カットオフ遠心濃縮器を用いてサンプルを濃縮(供給業者が推奨する遠心分離速度を採用)。体積は約0.5ミリリットルに達すると、0.2%CHAPS / PBSを加えます。 0.2%CHAPS / PBSの少なくとも10巻(回開始サンプル容量)までより0.2%CHAPS / PBSを集中し、追加を続行追加されました。
  8. 、単離されたGFPまたはGFPタグ付きタンパク質の量の推定値を決定する280 nmでの吸光度読みを取得し、同じ緩衝液中のウシ血清アルブミンまたは他の制御タンパク質から作成した標準曲線と比較することができます。
    注:吸光係数の差に起因は、この濃度は推定値であるが、試料を無駄にすることなく、更なる分析を容易にするためのおおよそのタンパク質濃度を提供することができます。正確なタンパク質濃度を抑止することができますサンプルと同じ緩衝液中で、標準的なタンパク質を調製する特定の製造マイクロローリー法を用いて、採掘。単離されたタンパク質のさらなる分析は、予測された分子量と比較(抗体GFPの検出を使用して)単離されたタンパク質のウェスタンブロッティングによって達成することができます。また、TMEM184A抗体の使用は、予測構造物の大きさのバンドを生じるはずであるが、二量体(またはより高次のオリゴマー)は、試料中に存在する場合も、WT TMEM184Aバンドになることがあります。純度の推定値は、出発物質のアリコートからの全タンパク質対単離されたサンプルからの全タンパク質についてブロットを染色することによって得ることができます。

8. インビトロヘパリン結合アッセイ

  1. 振盪しながら、200μLの0.2%CHAPS / PBSで5分間3回洗浄することにより、黒アビジン被覆96ウェルプレートを準備します。同じ洗浄手順を用いて、同一の黒色非被覆96ウェルプレートを準備します。準備します(三連で)実験試料のレイアウトは、アッセイの間に従います。 GFPの漂白を確認するために、標準ヘパリン濃度用井戸、バッファ制御、およびヘパリンなしのGFPサンプルをウェルの中に含まれます。
    注:最適化された単離またはリガンド相互作用のバッファが問題のタンパク質のために異なっている場合は、最適な緩衝系でプレートの準備や洗濯のすべてを行います。
  2. GFPは結合が所望されるアビジンコートプレート内のすべてのウェルに60ピコモル/ウェルのビオチン化抗GFPの100μLを加えます。抗体の量はわずかウェルに高親和性アビジンを飽和するのに十分です。
    1. 唯一の制御目的のために使用されるすべてのウェル(無GFPまたはGFP-TMEM184Aが所望の結合)にバッファを追加します。蒸発を防ぐために、プレートカバーでウェルを密閉します。振盪しながら、室温で2時間インキュベートします。
      注:ボリュームをウェルに加え、インキュベーション時間は、プロバイダからの推奨に基づいています。
  3. 全てのウェルを3回洗浄200μLの0.2%CHAPS / PBSで5分間。
  4. アビジンコートプレートのウェルを適切かつ振とうしながら室温で1時間インキュベートする5ナノモル/ウェルGFP-TMEM184AまたはGFPの100μLを加えます。 8.3のように再び洗浄します。
    注記:タンパク質のこの濃度は、すべてのサイトが過剰GFPまたはGFP-TMEM184Aで飽和させたことを確実にするために選択しました。これは、同量のタンパク質を各ウェルに結合されることを保証することが重要です。タンパク質の低い量はまた、プレートでのタンパク質のいくつかの濃度をインキュベートし、結合アッセイを、未結合タンパク質とリガンドを比較した後、残りの未結合タンパク質を評価することにより調べることができた可能性部位を飽和することがあります。
  5. 0.2%CHAPS / PBSで、フルオレセイン標識ヘパリンの種々の濃度を調製し、 例えば 、10、25、50、75、100、200 / mlの。暗闇の中で、この残りのすべての作業を行います。
    注:前の濃度を調製すること、他のリガンドのための特定の濃度はproteiのために決定されるべきです問題のn個のターゲット。最低濃度は、プレートリーダーで検出可能であるべきです。したがって、最初の使用の緩衝系で正確に検出することができる範囲を決定することが重要です。その後、測定可能な結合を得るために必要な範囲を決定します。 10μg/ mLの下のフルオレセインヘパリンの濃度は一貫して使用されるバッファー条件の下でプレートリーダーに登録しませんでした。ローダミンヘパリン他のアッセイにおいて使用されるような、緩衝液条件および結合のために必要な濃度で、プレートリーダーで視覚化することができるが、同様に、標準の蛍光読み取り値は、フルオロフォアで再現差はなかったです。
  6. 両方アビジン被覆および非コートプレートにアビジンコートプレートと濃度の標準ウェル中で適切な試験ウェルにフルオレセイン - ヘパリンの100μLを加えます。振盪しながら室温で10分間インキュベートします。暗い(またはホイル覆われた)でプレートを保管してください。
  7. プレートレアを使用デルは、両プレートの対照ウェル中のヘパリンおよびアビジンコートプレートで固定化されたGFP-TMEM184AまたはGFPを有するウェルからの初期蛍光(合計)排出量から初期蛍光発光を記録します。必要であれば、最低と最高濃度と蛍光ヘパリンの検出を確実にするために、機器のゲインを調整します。
    注:特定のプレートリーダーは、上から井戸を読み取り、それが調整可能である場合、ウェルに最適な場所で読み込みしてください。問題の研究のために、最適な場所をウェルダウン約75%でした。プレートリーダーを用いて入手可能な情報には、黒のプレートに結合されたサンプルのアッセイを読み取るための問題のプレートリーダーに固有な提案を提供する必要があります。
  8. 固定化されたGFP-TMEM184AまたはGFPを有するウェルから未結合の蛍光ヘパリンを削除し、非コート黒色プレートの対応するウェルに配置します。すぐに蛍光発光をお読みください。
  9. int型の新鮮な0.2%CHAPS / PBS 100μLをバックに追加Oウェルは、そこからフルオレセインヘパリンを除去し、蛍光発光を読み取りました。
  10. 8.9 3X - 繰り返して、8.8を繰り返します。
    注:塗装板からのこれらの測定値は、GFPまたはGFP-TMEM184Aウェル内に残っているフルオレセインヘパリンを示しています。かなりの蛍光が第三の結合していないサンプルで発見された場合は、追加の洗浄が発生する必要があります。蛍光は各洗浄で除去され続ける場合は、リガンドの結合は、低親和性であるかもしれない、との条件が再評価されるべきです。最後の読み出しは、結合したヘパリンの読み取りを構成しています。
  11. 各洗浄のための番号を取得する非被覆プレートで削除された、結合していない、試料からのレコード蛍光発光、。これらは、「未結合」の読みです。
  12. 各ウェルに加え、ヘパリンの正しいレベルを確認するために8.7で得られた全ヘパリン排出値を使用します。値から平均バックグラウンド測定値を引きます。
    注:ウェルズ任意のフルオレセインヘパリンなしによる抗体、GFPおよびバッファに背景としての役割を果たす。 AveragE背景は、背景値を得るために繰り返されます。実際の値を取得するために結合および非結合の測定値からバックグラウンドの平均測定値を引きます。
  13. 総フルオレセインヘパリンはヘパリンの量対放出の規模を決定するために追加された対放射のプロットを採用しています。
    注:抗体単独で、または抗体と抗原は、蛍光の一部消光をもたらしました。したがって、総ヘパリンは、8.7で述べたように、総追加ヘパリンに基づいて決定されました。
  14. GFP-TMEM184AケースとGFPの場合の両方で三連のために追加されたヘパリン対に補正バインドヘパリンをプロットします。
  15. 特定の濃度のためにすべての洗浄から未結合の測定値を追加することにより、遊離リガンドを決定します。

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Representative Results

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、理論的には、任意のDNAのトランスフェクション細胞への構築物は、親油性のトランスフェクション試薬を用いて達成することができるが、これまでの報告は、GFPのより効果的なトランスフェクションはエレクトロポレーション12を使用して、内皮細胞への構築物を示します。ここに提供されたプロトコルは、一般的に使用される主要由来内皮細胞および平滑筋細胞の80%以上でGFP構築物の発現を達成しました。採用コンストラクトのデザインが急速にこの構築物を提供できる市販のシステムを使用していました。主な目的とする用途には最適な真核生物のタンパク質発現および継続的な構築物の生産に伴って、膜に従って正しい配信、場所の問題に焦点を当てた第一に考慮しました。含めることができますその他の考慮事項:折り畳まれた領域の一部であるC末端、wantiの可能性と異なって局在するタンパク質またはタンパク質のためのGFPの別の場所(プロテアーゼ切断部位を追加)、GFPを除去するためのngの、および二次親和性部位。後者は、GFP構築物を精製し、結合アッセイのために表面上でそれを安定化させる別の方法を提供します。 TMEM184Aに対する異なる市販の抗体のための染色パターンを確認するために、GFP-TMEM184Aを発現する血管細胞は、市販の抗体で染色した同じ細胞と比較しました。少なくとも72時間にわたって蓄積して見えたGFP-TMEM184Aのトランスフェクションの影響分布後の時間の長さ。最適な発現をもたらすトランスフェクション後の時間の長さは、細胞の種類によって異なり、それぞれの技術のために最適化されるべきです。時間が経つにつれて、より多くのGFPラベルは、核周囲の領域でした。取り扱いに応じて、GFP漂白も発生しました。結果は、細胞表面およびTMEM184A抗体染色( 図1)で観察された局在と類似核周囲および他の小胞構造においてGFP-TMEM184Aを示しました。初代細胞で図5に示されています。

蛍光リガンド(ローダミンヘパリン)の使用は、経時的なリガンドおよびレセプターの共局在の評価を容易にし、そして2つのラベルは、ライブ画像( 図2およびムービー1)を実行することが可能となります。 図2Cは、405 nmで励起したGFPによって撮像されたが、ローダミン(中央画像)からの発光を捕捉しました。 GFPの励起は、同様に制限された放出を生じる405nmで限定されるものではなく、これは、ローダミンの励起および偽のFRETシグナルを防止しています。同様に、FRET-induc編ローダミン発光はかすかでした。唯一のローダミンヘパリンとGFP-TMEM184A発現とコントロール、ないローダミンヘパリン、および他では405 nm励起とのローダミン発光はありませんでした。その後、総GFP(左画像)および総ローダミン(右の画像)は、各フルオロフォアのための標準的な励起/発光波長を用いて測定しました。 Cのデータはさらに、リガンドとGFP-TMEM184Aの共局在をサポートしています。次いで、A7r5細胞と比較してRAOECにおけるローダミンヘパリン取り込みは長いインキュベーションを必要としました。 FRETのための証拠はローダミンヘパリンなしまたは非トランスフェクト細胞中の細胞では観察されませんでした。理想的な実験は、リガンドとの共局在を持つべきではない別の表面GFP構築物を含むであろう。

獲得または機能の回復はまた、GFPタンパク質構築物およびローダミンヘパリンで達成することができます。これは、発現レベルおよびリガンドに対する証拠としてGFPを使用する機会を提供したコローカライズとの相互作用を定量化します。具体的には、ヘパリンの取り込みを構成するトランスフェクトのA7r5細胞( 図3)GFP-TMEM184Aで増加しました。非常に限られたローダミンヘパリンを取る安定したノックダウン細胞は、1を作製し、これらの関数のゲインを評価することができたシステムを提供します。 GFP-TMEM184A構築物のトランスフェクションは、再び、野生型細胞のレベルで、または( 図3)ローダミンヘパリンを内在化可能性の細胞をもたらしました。 「ノーヘパリン」の画像がノックダウン構築のためのレポーターとしてGFPを発現しない安定したノックダウン細胞のものであることに留意すべきです。示す画像で観察されるバックグラウンド蛍光は、これらの細胞において高かったです。

リガンドと相互作用する他のタンパク質の可能性を減少させるためにリガンド特異性を決意するための単離された受容体を使用することが一般的に有用です。 GFP-proteiの使用n個の構築物は、タンパク質の単離のためのハンドルとして機能することができるGFPタグとしてこの点で重要な利点を提供し、追加のタンパク質と抗体または他の親和性試薬の相互作用の可能性を回避できます。 GFPは、細胞の同じ集団において発現され、同じGFPアフィニティー手順を用いて単離することができます。これは、リガンド相互作用の研究のための対照タンパク質を提供します。 TMEM184Aシステムでは、GFP-TMEM184A抗GFP抗体の親和性の手順を用いて単離した対照GFP任意ヘパリン( 図4)に結合しなかったが、特異的結合、飽和ヘパリンをもたらしました。

典型的には、構築物のGFPタグは、タンパク質の端部に配置されています。 C末端の位置は、膜への正しいタンパク質輸送を容易にします。フォールディングおよびトポロジでない場合はそのため、膜の特定の側にGFPの可用性は、膜タンパク質の特定のトポロジのための証拠を提供することができますlreadyは知られています。 (例えば図5のように)GFPに対する抗体を使用した単純な免疫蛍光染色は、非透過性細胞での抗体のアクセスに基づいて、GFPの場所の証拠を提供することができます。抗GFP抗体は、漂白した場合でも、GFPを認識する。 図5に示す免疫蛍光染色は、細胞膜におけるGFPが細胞外であるという予備的証拠を提供GFP-TMEM184Aトランスフェクトされた細胞の透過化せず、有意な抗GFP染色を示唆しています。明らかに、小胞における細胞内タンパク質はまた、透過処理した細胞で染色してしまいます。 図2CにおけるFRETの画像は、この提案されたトポロジと一致しています。

図1
図1:細胞におけるGFP-TEMEM184AローカリゼーションはTMEM184Aローカリゼーションは免疫蛍光により決定されます確認します。 A)BAOECs GFP-TMEM1をトランスフェクトしました84Aは、4%PFAで固定しました。非トランスフェクト細胞を、氷冷メタノール(MeOH)で固定し、透過処理または4%(述べたように)トリトンX-100の透過処理に続いPFAで処理しました。非トランスフェクト細胞はTMEM184A(CTD)のC末端ペプチドに対する抗体またはTMEM184A(NTD)のN末端ペプチド及びTRITCでタグ付けされた二次抗ウサギ抗体を用いて染色しました。 B)としては、(のA7r5)クローン化され、一次(BAOSMC)平滑筋細胞を同様に処理しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:ローダミンヘパリンとGFP-TMEM184Aのイメージング。 A)GFP-TMEM184AでエレクトロA7r5sは用を100μg/ mLのローダミン-ヘパリンで処理しました時間が示され、次いで、4%PFAで固定しました。画像は、2つの別々の実験の代表です。 B)のA7r5細胞をGFP-TMEM184Aでトランスフェクトし、ローダミンヘパリンは即時のライブイメージングを加えました。映画の選択されたフレームは、ローダミンヘパリンを含むGFP-コーティングされた小胞の初期ローカライゼーションを指す白い縦線で示されています。 GFPラベルおよびローダミンが一緒に移動します。スケールバー=2μmです。 Aのように扱わC)RAOECsは、プロトコル3.5を参照して、(405で励起して蛍光共鳴エネルギー移動のためのFRETのためのGFPを、撮像された)と標準設定と比較しました。パネルAおよびBにおける2つの時点は、もともとバイオロジカルケミストリー誌に掲載されました。ピュー、RP ら。 1。著作権生化学・分子生物学のためのアメリカの社会。 Vにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版をIEW。

図3
図3:GFP-TMEM184Aトランスフェクションは、関数のゲインを提供します。 A)大幅にローダミンヘパリンの低いレベルは、例えば画像を参照して、野生型A7r5sに比べて安定したノックダウンのA7r5細胞に見られます。 「いいえヘパリン」の画像は、構造の存在のマーカーとしてGFPを発現する安定なノックダウン細胞です。スケールバー=10μmです。 B)野生型および安定したノックダウン細胞の両方へのGFP-TMEM184Aのトランスフェクションは、有意に、3つの独立した実験で/条件50以上の細胞の分析に基づいて、これらの細胞においてローダミンヘパリン信号を増加させます。エラーバーはSEMを表します。 Tukey検定に基づいたp <0.0001。この図は、もともとバイオロジカルケミストリー誌に掲載されました。ピュー、RP ら。 1。著作権生化学・分子生物学のためのアメリカの社会。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4:単離されたGFP-TMEM184Aバインドヘパリン。 GFP-TMEM184AまたはGFPを単離し、アビジンコートアッセイプレートに結合させました。フルオレセインヘパリンは1.111ナノモルを通して0.056ナノモルの濃度で添加しました。ヘパリン結合したが、519 nmでの発光を測定することにより決定しました。 GFP-TMEM184A(四角)。 GFPコントロール(丸)。この図は、もともとバイオロジカルケミストリー誌に掲載されました。ピュー、RP ら。 1。著作権生化学・分子生物学のためのアメリカの社会。 _blank ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
5:GFP-TMEM184A および膜トポロジー。 GFP-TMEM184Aトランスフェクトされた細胞を、4%PFA(上部)で固定し4%PFAで固定し、トリトンX-100(下)を使用して透過処理しました。細胞を抗GFP一次抗体およびCy3標識二次抗体で同じ染色しました。スケールバー=10μmです。 2つの異なる実験が示されています。二次のみ染色された細胞は、本質的染色を示しませんでした。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

映画1
PLOAD / 55053 / movie.mp4 "ターゲット=" _空白">ムービー1:ローダミンヘパリン(右クリックしてダウンロード)とGFP-TMEM184AのライブイメージングのA7r5細胞は、映画は、GFPを示し、図2(b)のように処理しました一緒に移動上部にTMEM184Aとローダミン - ヘパリン小胞。映画のマージされたバージョンに加えて、個別のカラーバージョンが示されている。GFPと小胞およびローダミンが丸で囲まれている含みます。

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Discussion

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ここで報告されたプロトコルは、血管細胞1におけるヘパリン受容体としてTMEM184Aの同定のための確証的な証拠を提供するように設計されました。ノックダウン技術は、日常的に、新規なタンパク質の同定を確認するための1つのメカニズムとして使用されます。しかし、ノックダウン後のいくつかの機能の損失は、典型的には、候補タンパク質が実際に正しい受容体(または他の機能性タンパク質)であることを十分な証拠はありません。候補タンパク質が実際に機能を発揮するという証拠を持っていることも重要です。 GFPでタグ付けされた新規遺伝子ための構築物を採用することにより機能実験の利得を可能にし、GFPの親和性に基づいて、タグ付けされたタンパク質の単離を容易にします。このプロトコルに用いられるエレクトロポレーションは、(細胞の80%以上は、構築物を発現)構築物の非常に高いトランスフェクション効率を促進しました。エレクトロポレーションが使用可能かどうか、所望でない場合は、他のトランスフェクション機構を使用することができます。新規タンパク質の機能を確認するためにGFPタグ付き構築物を選択するいくつかの利点があります。まず、GFPをトランスフェクションし、遺伝子発現のためのレポーターとして機能し、タンパク質の発現なしに細胞株が利用できない場合には、過剰発現は、GFPを介して監視することを可能にします。第二に、GFPタグは、ペプチドに対してリガンド親和性または抗体のいずれかに依存しないタンパク質の精製のためのツールを提供しています。第三に、GFPタグは、複雑な免疫蛍光局在化を調べるためのツールを提供し、実際の遺伝子産物も同様に局在しているかどうかを決定するために、標的タンパク質配列中のユニークなペプチドに対して生成された抗体を用いて可視化しました。

遺伝子構築物で機能アッセイの利得は、新規タンパク質機能13を同定するためのハイスループットスクリーニングを含む、多くの目的のために使用されています。理想的には、機能アッセイのゲインはよく研究クローン化されたセルリチウムを採用するだろう(細胞はまだ新たに発現した遺伝子の機能を可能にする遺伝子産物を、協働発現しなければならない)問題の遺伝子を発現しませんね。本アッセイにおけるような特定のGFPタグ付き構築物を使用する場合には、GFPタンパク質が機能可能な細胞を使用することが重要です。したがって、細胞の選択は、機能が正常に協働するタンパク質が存在していることを確認するために起こる細胞型に、機能に依存して、可能性が高いです。 GFP-タグ付け( 例えば、 図2および 3を参照)GFPタグ化タンパク質の蛍光は、機能アッセイの一部として追跡することができる場合の監視機能の追加方法を可能にします。 GFPは、何らかの形でタンパク質の機能を変化させる場合、これらの研究の一つの制限は次のようになります。タンパク質のC末端にGFPを連結することによって、タンパク質の多くは既に明らか機能そのまま研究されているが、そのような可能性が存在します。

RadioisotopicaLLY標識リガンドは、多くの場合、無傷の細胞11に結合するリガンドを研究するために使用されています。しかし、これらのアッセイは、結合した後、リガンドの場所の簡単な決意を許可していない、また彼らは一緒に存在し、レポートのように、リガンドと受容体の比較を容易ありません。 GFP構築物はまた、ここで標識された膜タンパク質を調べるためにさらなる機会を提供します。なぜならGFPタグのC末端位置で、アッセイを通してトランスフェクトされた細胞におけるGFPタグの位置を調べることができます。 GFPに対する抗体を用いた免疫蛍光( 図5)とし、透過処理なしで抗体にアクセス可能なGFPの比較を可能にします。 GFP-TMEM184Aのさらなる用途は、ローダミン-ヘパリン( 図2)との共局在としてGFPイメージングの利点を取ります。図2Cに示すように、ローダミンヘパリンを励起するためにGFPからの発光を可能にするためにFRETを使用することは、結合および細胞内TRAを評価するための興味深い方法を提供しますfficking。また、FRETのデータは、GFPが励起を転送するローダミン - リガンドへの十分な(10ナノメートル以内)の近くであることを示しています。リガンドの作品へのGFPから、このような転送はテトラメチルローダミン14でタグ付けされた副甲状腺ホルモンのために公開されているという証拠。代替FRET技術(光漂白および/またはコンピュータ駆動撮像パターン)は、ここでは例として示されているものよりも複雑な分析のために使用することができます。同様に、候補と他のタンパク質の相互作用がAlbertazzi によって報告されたEGFP / mCherryをシステムのように、FRETのために最適化された蛍光タグでFRETを用いて調べている可能性があります。 15と王とその同僚16によって、カリウムチャネルの研究に使用CFP / YFPとGFPのペア。多くの新しい小型の蛍光分子は、例えば17のために、設計されています。これらの分子は、GFPタグ付きタンパク質間の相互作用をFRETケースの数を増やすと、fますluorescentリガンドを調べることができます。今後の研究ではまた、構築物が遺伝子機能の配列特異的な側面を決定するのを助けるためにできるように、遺伝子への変更を対象とすることを含むことができます。タンパク質のC末端は、通常、内部にあるときにGFPタグ付きの膜タンパク質の1つの制限はあります。このような場合には、蛍光水溶性リガンドとのFRETアッセイは、可能ではないかもしれません。しかし、構築物中の他の場所にGFPを配置するための代替メカニズムは、まだいくつかのこのようなタンパク質のために可能であるかもしれませんし、ここに報告された他のアッセイは、まだ使用することができます。

機能に加えて、局在化、およびインビボでのリガンド相互作用 、GFPタグ付きタンパク質を、抗GFP抗体およびGFPタンパク質の公平な単離を可能にするインビトロアッセイ用いて機能を検査するために使用される単離されたタンパク質を用いて単離することができると比較的孤立したコントロール(無料GFP)。一緒にこれらのアッセイは番目を証明するために必要な強力な追加的な証拠を提供することができます候補タンパク質の機能に仮定されます。

GFPは、コンパクトな構造18から離れて延びているサイトで修飾しない限り、プロテアーゼ耐性があるため、また、細胞の限られたプロテアーゼ処理は、細胞外GFPを解放する必要があります。プロテアーゼ切断は、GFPが結合しているタンパク質または設計結合領域で生じます。リリースされた製品は、GFP配列のN末端伸長とGFPであろう。 GFPが結合しているタンパク質のC末端が細胞内であれば、トリプシンは、GFPを解放するべきではありません。潜在的な製品の予備的分析は、トリプシンにより放出されたGFPタグ付きタンパク質との明確な分子量のパターンを示唆している可能性があります。多くの膜タンパク質を、そのような技術は、そのGFPの放出、または欠如によって膜トポロジーのための明確な証拠をもたらします。

一緒に、この報告書で提示および/または提案された特定のアッセイは、技術トンの幅広いサンプリングを提供します帽子は、蛍光タグ付けされた構築物を用いて開始することによって、新規タンパク質を調べるために使用することができます。このような構築物は、容易に商業的に入手することができます。技術の広い範囲のためにそれらを使用する機会は限られた予算上の小さな研究室のためにそれらを経済的に実現可能になります。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GFP-TMEM184A construct OriGene RG213192
Rhodamine-Heparin Creative PEGWorks HP-204 Light Sensitive
Fluorescein-Heparin Creative PEGWorks HP-201 Light Sensitive
Mowiol EMD Millipore 475904-100GM
Paraformaldehyde (PFA, methanol free) Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific PI28908 at Fisher Use in Fume Hood
Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96-well dishes) Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific PI15510 at Fisher Pay attention to shelf-life
Black 96-well plates Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific 064432 at Fisher
A7r5 vascular smooth muscle cell line ATCC CRL 1444 Can be exchanged into MEM medium1
BAOEC bovine aortic endothelial cells Cell Applications, Inc. B304-05 Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7
BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells Cell Applications, Inc. B354-05 Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1
RAOEC rat aortic endothelial cells Cell Applications, Inc. R304-05a Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7
Biotinylated anti-GFP Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific MA5-15256-BTIN
Streptavidin-coated beads Sigma S1638
HeBS Available from Bio-Rad Can be prepared in the lab. The pH is 6.8
TMEM184A antibody to the N-terminus Santa Cruz Biotechnology sc292006 Only known TMEM184A antibody to N-terminal region.
TMEM184A antibody to the C-terminus Obtained from ProSci Inc, Poway, CA  Pro Sci 5681 ProSci used in Figure 1
GFP antibodies Santa Cruz Biotechnology sc9996 Used in Figure 5
Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC)
715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3)
Minimal cross-reactivity to minimize any nonspecific staining.
CHAPS Purchased from Sigma C5849 Note that this specific catalog number has been discontinued.  Supplier will provide information regarding replacement.
Live imaging 35-mm dishes MatTek (Ashland MA) P35G-1.0 – 20 mm - C
Confocal Microscope Zeiss LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3
Confocal Microscope Nikon C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens Used for images in Figure 5
Confocal Microscope Zeiss Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens Used for images in Figure 2C
Electroporation equipment Bio-Rad Gene Pulser X-Cell System
Electroporation cuvettes Available from MidSci EC2L Can also be obtained from equipment supplier
Plate reader TECAN TECAN Infinite® m200 Pro plate reader Readings in the middle of the wells rather than at the surface.
Computer program for measuring staining intensity Image J https://imagej.nih.gov/ij/
Program and information available on-line
Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail  
Cell Culture trypsin solution Sigma T4174 purchased as a 10x solution

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References

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GFPタグTMEM184Aを使用すると、ヘパリン受容体のアイデンティティの確認のために構築します
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Farwell, S. L. N., Slee, J. B., Li, Y., Lowe-Krentz, L. J. Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity. J. Vis. Exp. (120), e55053, doi:10.3791/55053 (2017).More

Farwell, S. L. N., Slee, J. B., Li, Y., Lowe-Krentz, L. J. Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity. J. Vis. Exp. (120), e55053, doi:10.3791/55053 (2017).

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