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Genetics

Usando um TMEM184A GFP Construir para a confirmação da Heparina Receptor Identity

doi: 10.3791/55053 Published: February 17, 2017

Summary

Uma construção que codifica TMEM184A com uma marcação GFP no carboxi-terminal concebido para expressão eucariótica, foi empregue em ensaios desenhados para confirmar a identificação de um receptor TMEM184A como heparina em células vasculares.

Abstract

Quando novas proteínas são identificados através de análise de isolamento e bioinformática à base de afinidade, eles são muitas vezes não caracterizados em grande parte. Os anticorpos contra os péptidos específicos dentro da sequência prevista permitir que algumas experiências de localização. No entanto, outros possíveis interacções com os anticorpos muitas vezes não podem ser excluídos. Esta situação constituiu uma oportunidade para desenvolver um conjunto de ensaios dependentes da sequência da proteína. Especificamente, foi obtida uma construção contendo a sequência de gene acoplado à sequência codificante de GFP na extremidade C-terminal da proteína e utilizados para estes fins. Experimentos para caracterizar localização, afinidade do ligando, e ganho de função foram originalmente concebidos e realizados para confirmar a identificação de TMEM184A como um receptor heparina 1. Além disso, a construção pode ser utilizada para estudos abordando questões de topologia de membrana e as interacções proteína-ligando detalhados. O presente relatório apresenta arange de protocolos experimentais com base na GFP-TMEM184A expresso em células vasculares que poderia ser facilmente adaptada para outras novas proteínas.

Introduction

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Identificação de proteínas candidatas para novos funções muitas vezes depende protocolos de isolamento à base de afinidade, seguido por determinação da sequência parcial. Exemplos recentes de proteínas recentemente identificados incluem proteína transmembranar 184A (TMEM184A), um receptor de heparina identificado após interacções de afinidade de heparina 1, e TgPH1, um proteína do domínio de homologia que se liga plecstrina PI fosfoinositida (3,5) P 2 2. Outro novo identificação de proteínas envolve a análise de sequência directa de péptidos, tais como que por Vit, et ai. que usou peptídeos transmembrana para identificar produtos de proteínas de genes previamente descaracterizados 3. Do mesmo modo, a identificação de sequências de proteína nova pode ser realizada utilizando bioinformática procura de famílias de proteínas previamente caracterizadas como a identificação de novas proteínas 4TM 4. Exame de sequências de genes da família aquaporin tem alpor isso permitiu a identificação de novos membros com novas funções 5. Após a identificação, análise da função da proteína é tipicamente um passo seguinte, que pode, por vezes, ser examinada utilizando um ensaio específico da função da proteína, tais como no caso aquaporina.

Quando possível, a função de uma proteína recentemente identificada pode ser examinada com enzimática específica ou ensaios in vitro de função semelhante. Porque muitas funções de novas proteínas dependem de interacções complexas que ocorrem apenas em células intactas ou organismos, em ensaios in vitro não são sempre eficazes. No entanto, os ensaios in vivo devem ser concebidos de tal maneira que eles dependem da sequência do gene. Em cultura de células, e / ou organismos modelo simples, knockdown pode fornecer elementos de prova para a identificação / função da proteína 6. Com novas proteínas identificadas como notado acima, é muitas vezes insuficiente para derrubar simplesmente uma proteína para confirmar a função, umad o desenho de ensaios funcionais in vivo que dependem da sequência do gene torna-se importante para a caracterização de novas proteínas.

A recente identificação de TMEM184A como um receptor de heparina (que modula a proliferação no músculo liso vascular e respostas inflamatórias em células endoteliais), utilizando cromatografia de afinidade e de MALDI MS 1, 7 fornecido uma oportunidade para desenvolver um conjunto de ensaios após knockdown produziu resultados consistentes com a identificação . Uma revisão recente confirmou que a heparina interage especificamente com muitos factores de crescimento, os seus receptores, os componentes da matriz extracelular, adesão celular, receptores e outras proteínas 8. No sistema vascular, a heparina e os proteoglicanos de sulfato de heparano (contendo cadeias de sulfato de heparano de uma estrutura semelhante à heparina) interagem com várias centenas de proteínas 9. Para confirmar funcionalmente that TMEM184A estava envolvido com a captação de heparina e de ligação, as técnicas que empregaram a construção de gene para TMEM184A foram desenvolvidos. O presente relatório inclui um conjunto de ensaios com base em um GFP-TMEM184A construção para utilização em confirmando a identidade do TMEM184A como um receptor de heparina.

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Protocol

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1. Projeto de uma construção GFP-proteína

  1. Compra, ou de design e construção, uma construção GFP baseada na proteína em questão.
    NOTA: Para uma construção de compra, vectores convencionais estão disponíveis a partir de laboratórios comerciais que incluem parte ou a totalidade dos seguintes sugestões: Para uma proteína de membrana, seleccionar um local no terminal C da GFP, porque é menos provável que interfira com o tráfico de proteína de membrana. Considere uma extensão entre o gene de interesse e o GFP se há razão para acreditar que o C-terminal da proteína em questão é compactamente dobrada em um domínio da proteína. Escolha do construto de expressão de células eucarióticas geral, mas permitem construir a produção em sistemas bacterianos. Incluir um sítio de clivagem (tais como para a protease de TEV), através da qual a GFP pode ser removido se desejado para algumas experiências em que o GFP poderiam interferir com a actividade da proteína. Adicionar outras inserções tais como uma tag adicional para localização ou afinidade eminteracções (por exemplo, His6). Este não foi necessário para os ensaios aqui descritos, mas pode facilitar a outros ensaios, ou seja útil directamente adjacente ao gene, antes da GFP, se a remoção de GFP é desejado.

2. GFP-TMEM184A Expressão em células vasculares

  1. Cultura endoteliais ou células do músculo liso vasculares em 0,2% de gelatina revestidas placas de cultura de tecidos como relatado anteriormente 1, 6, 7.
  2. Adicionar solução 5 ml de cultura de células de tripsina (0,5% w / v) a uma enxaguado 100 mm, ou maior, prato confluente de células. Incubar a 37 ° C até as células são apenas libertado a partir da placa, e transferência das células para um tubo de centrífuga de polipropileno estéril.
  3. Adicionar um inibidor de tripsina (por exemplo, um volume igual de meio de cultura normal), tal como utilizado na cultura de rotina, para a solução de células / tripsina para limitar a actividade da tripsina. Sedimentar as células durante 5 min a aproximdamente 600 xg (ou a velocidade adequada e tempo para simplesmente agregar as células de cultura de tecido normal). Aspirar o sobrenadante.
  4. Ressuspender as células em 1 ml de tampão de electroporação HeBS (Hepes-solução salina tamponada), que limitam a quantidade de tempo são células na pelete ou suspensão. Coloque a suspensão de células em gelo e realizar etapas restantes no gelo.
    NOTA: pelota pode ser lavada uma vez com HeBS antes da ressuspensão.
  5. Adicionar um volume suficiente de GFP plasmídeo TMEM184A às células para atingir uma concentração final de 20 ug de ADN / mL. Use um protocolo idêntico para uma construção GFP.
  6. Colocar aproximadamente 0,4 ml da solução de células em HeBS numa cuvete de electroporação. Pré-relaxar os cuvetes antes de usar.
  7. Electroporar células usando as seguintes condições: Decaimento Exponencial, 500 mF, ∞ ohms, e 170 V.
    NOTA: A tensão para um dado tipo de células devem ser optimizadas. Estudos preliminares com células endoteliais e do músculo liso cell tipos foram realizadas com um GFP-vinculina para determinar o valor de tensão óptimo observado aqui, por exemplo, 10.
    1. Para otimizar a eletroporação, comece com as recomendações do fabricante do equipamento (que incluem condições para alguns tipos de células normais). Utilizar a construção desejada ou uma proteína fluorescente controlo construção semelhante em tamanho e características fluorescentes para a construção desejada.
      NOTA: Pequeno ácidos nucleicos parecem entrar em células mais facilmente do que as construções de maior dimensão, assim uma construção com apenas uma proteína fluorescente pode ser mais fácil de expressar uma maior do que um.
    2. Usar a microscopia de fluorescência para determinar a viabilidade celular, a percentagem de células nas quais a construção fluorescente é expressa após 24 e 48 h, e a intensidade de expressão.
      NOTA: diminuir a tensão e / ou tempo ligeiramente se a sobrevivência é baixa. Alvo para o menor tempo possível entre a liberação de células da superfície da cultura e retornandocélulas de cultura para aumentar a sobrevivência. Pequenos aumentos no tempo ou um segundo pulso pode melhorar a absorção de construção se a sobrevivência é elevada e a expressão é baixa. condições óptimas e expressão variam entre tipos de células. Se a percentagem de células que expressam a construção é elevado, mas a intensidade é baixa, o aumento da concentração de ADN e monitorização das células transfectadas ao longo do tempo para a intensidade óptima, que irá variar com base na semi-vida da proteína assim como a expressão, pode melhorar a intensidade. a intensidade da coloração pode ser ampliada para alguns ensaios, se necessário, por coloração por imunofluorescência de GFP com anticorpos anti-GFP
  8. Após a eletroporação, semear as células em seis poços de cultura de tecidos de 30 mm com lamelas para imagens ou em placas de cultura de tecidos. Cultura as células utilizando procedimentos de cultura de células padrão.
  9. Opcional: Substituir o meio de cultura após 24 h para remover qualquer tampão de eletroporação HeBS.

3. Visualização de GFP-TMEM184A Localização

  1. Lavar as células com PBS e agitando suavemente após a cultura durante pelo menos 24 h. Limitar a exposição à luz brilhante para evitar desvanecimento GFP.
  2. Fixar as células com paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS durante 15 min à temperatura ambiente com agitação suave. Evitar o uso de quaisquer reagentes contendo metanol, que pode permeabilizar as células. A fixação com metanol pode ser usado se ele não é necessário para avaliar as interacções de ligandos.
    Cuidado: O paraformaldeído é tóxico. Use equipamento de proteção pessoal apropriado. Use em um exaustor, com cuidado, e descartar adequadamente.
  3. Lavar com PBS como acima. Para coloração de anticorpos com base, ver 3.6 abaixo.
  4. Mount lamelas de slides usando Mowiol ou outro meio de montagem adequado.
  5. lâminas de imagem usando um microscópio confocal ou fluorescência com os filtros adequados para excitação GFP e espectros de emissão. A microscopia confocal é o preferido por causa da capacidade de separar amostras no plano z. Salvar imagens em escala de cinza para qufins antitation em formato TIF (para além de imagens coloridas para ilustrações).
  6. Para efeitos de comparação com WT TMEM184A expressas pelas células, preparar outras células para imunofluorescência utilizando anticorpos primários preparados a um péptido (s) a partir da sequência TMEM184A, por exemplo, um. Identificação de GFP-TEMEM184A também pode ser realizada utilizando anticorpos contra GFP. Avaliar ambas as amostras de células por técnicas de microscopia idênticos.

4. Rodamina-ligação à heparina e de uma co-localização com células GFP-TMEM184A-transfectadas

  1. Tratar as células GFP-TMEM184A-expressando com 100 ug / mL de rodamina-heparina adicionada ao meio de cultura, e permitir que as células a incubar durante um determinado período de tempo, tipicamente inferior a 10 minutos para as células A7r5. Enxaguar e corrigir como em 3.1 e 3.2.
    NOTA: O tempo óptimo e a concentração do ligando dependerá da resposta celular, a intensidade de fluorescência da intensidade ligando e imagem obtida. este concentratião de heparina foi utilizada porque resulta em resposta de mais do que 50% em 11 outros ensaios. Esta concentração pode ser visualizada usando técnicas de microscopia de fluorescência padrão, por isso não foi necessário aumentá-la. Diluição de rodamina-heparina com resultados heparina não marcados em menor fluorescência nas células, é, portanto, mais difícil de imagem e quantificar.
  2. Para quantificar a ligação devido à GFP-TMEM184A transfecção rodamina-heparina, preparar células idênticas, sem transfectadas GFP-TMEM184A.
  3. Imagem as células usando um microscópio confocal com a GFP apropriado (488 nm) e rodamina (543 nm) de excitação e emissão - valores (500 530 nm para GFP e superior a 560 nm para a rodamina) para determinar co-localização. Obtenção de imagens de pelo menos 50 células de pelo menos três experiências separadas para obter estatísticas. Manter configurações idênticas dentro de experiências, e empregar uma amostra de controlo (s) (por exemplo, células transfectadas com nenhum tratamento) thno pode ser usada para normalizar os dados para a análise de múltiplas experiências.
  4. Analisar as imagens usando um programa de computador para determinar rodamina relativa de ligação / absorção em cada célula para a quantificação da ligação.
    NOTA: TIF imagens devem ser empregues como eles são convenientes para análise e pode ser convertido em escala de cinzentos em muitos programas de computador, se eles não foram inicialmente guardado nesse formato. Imagem J (freeware) foi empregado na presente análise e permite que a área ea intensidade de pixel a ser medido para qualquer área definida pelo usuário em uma imagem.
    1. Use uma ferramenta à mão livre para circundar uma célula dentro de uma imagem fluorescente e usar a ferramenta de medida para determinar a intensidade dentro desse espaço.
      NOTA: Estas medições fornecem as informações necessárias para calcular a intensidade total para uma área definida pelo usuário (células inteiras, núcleo, etc.) fornecendo uma maneira de comparar as células diferentes, com diferentes geometrias. A intensidade média sobre uma área de fundo pode ser relatada, e que facilitams coleção de intensidade de fundo para a análise.
    2. Exportação para uma folha de cálculo para calcular a área multiplicada pela intensidade e subtrair o fundo para a mesma quantidade de área. Média da fluorescência / celular para células suficientes / experimento para obter significância estatística.

5. A transferência de energia de ressonância de fluorescência de GFP-TMEM184A a rodamina-Heparina

  1. Preparar células transfectadas com e incubar / ml de ligando marcado com rodamina 200 ug como em 3.1. Note-se que o tempo de incubação com o ligando fluorescente é dependente do tipo de célula. Fixe com apenas PFA, e montar os slides para a imagem latente.
  2. Em primeiro lugar, excita a 405 nm e imagem para emissão rodamina (566-685 nm; FRET). Em segundo lugar, excita a 488 GFP (imagem à 493-530) para, e em terceiro lugar, excita a 561 para rodamina (imagem à 566-685). Controles sem GFP-TMEM184A ou sem rodamina-heparina são críticos.

6. Imagens Live-célula de Rodamina-Heparin Captação

  1. Semear o GFP-TMEM184A células transfectadas em pratos individuais concebidas para geração de imagens ao vivo de células e tratar como no protocolo 3.
    NOTA: O número de células necessário depende do tipo de célula e a densidade desejada. Para minimizar a quantidade de tempo que as células estão em suspensão, não contar as células. células de sementes de um prato confluentes 100 milímetros em seis pratos de imagens ao vivo de 35 mm para obter células perto da confluência em 48 h.
  2. Após 48 h, substituir o meio com meio de cultura sem vermelho de fenol.
  3. Transferir uma placa de células com um microscópio confocal com um estágio de aquecimento para manter a temperatura, e focar o microscópio.
  4. Pipetar 100 ug / mL de rodamina-heparina para o prato e misturar suavemente.
  5. começar imediatamente a gravação de imagens ao vivo. Se nenhuma absorção celular de heparina ocorre dentro da região em vista, mover o prato ligeiramente para identificar as células com pelo menos uma vesícula que contém a etiqueta verde rodamina.
    NOTA: excitação de imagem e de emissão específicos são omesmo que para o protocolo de captação de heparina (seção 5). O período de tempo entre as imagens foi de aproximadamente 16 s. As condições da experiência e do microscópio serão normalmente determinam a velocidade a que as imagens podem ser obtidas.

7. Isolamento de GFP-TMEM184A e GFP de células cultivadas

  1. Depois de remover o meio de cultura e enxaguar com PBS, adicionar 2 ml de 0,2% (w / v) de CHAPS 1x PBS com inibidores de protease para uma placa de 150 mm de células expressando GFP-TMEM184A ou GFP (para ensaios de ligação de controlo). Raspar as células a partir da placa, colocar a solução de células / CHAPS num tubo de polipropileno de 15 ml em gelo, e misturar bem tocando. Conclua todas as etapas em luz brilhante para garantir a tag GFP é branqueada para o ensaio de ligação abaixo.
  2. Para ligar especificamente GFP-TMEM184A (ou um controlo adequado GFP), adicionar anticorpo anti-GFP biotinilado 2 ug / mL para a solução e incubar durante a noite a 4 ° C com agitação.
  3. Adicionar 500 uLde esferas de estreptavidina-agarose para, pelo menos, 5 mL de 0,2% de CHAPS / PBS e centrifugar a 600 xg durante cerca de 3 a 5 min. Remover o sobrenadante. Repita mais duas vezes com CHAPS fresco / PBS a cada vez. Adicionar grânulos para a solução de anticorpos e de células e incubar durante a noite a 4 ° C com agitação para permitir que os grânulos de se ligar ao anticorpo anti-GFP biotinilado ligado à GFP ou GFP-TMEM184A.
  4. Sedimentar as pérolas por centrifugação (como em 7.3) e remover o material não ligado. Adicionar inibidores de, pelo menos, 5 mL de 0,2% de CHAPS / PBS / protease de lavar. Repita a lavagem e centrifugação, pelo menos 3x para efetivamente remover qualquer proteína não ligada.
  5. Depois de retirar a lavagem final, incubar os grânulos com 1 mL de glicina / 0,2% de CHAPS a 0,2 M em PBS (pH a 2,0 utilizando HCl) em gelo durante 3 min para dissociar o anticorpo-GFP de ligação (resultando em livre GFP-TMEM184A ou livre GFP). Misture suavemente batendo a cada 30 s.
  6. Centrifuga-se a aproximadamente 600 xg e transferir o sobrenadante contendo o p purificadarotein para um novo tubo de 15 mL, seguido por neutralização imediata com 5 mL de 1 M de bicarbonato de sódio (para ajustar o pH 7).
  7. Concentra-se a amostra usando um cut-off de 10.000 Dalton de peso molecular concentrador centrífugo (empregar velocidade de centrifugação recomendada pelo fornecedor). Quando o volume atinge aproximadamente 0,5 ml, adicionar 0,2% de CHAPS / PBS. Continue a concentração e a adição de mais 0,2% de CHAPS / PBS até pelo menos dez volumes (vezes o volume inicial da amostra) do CHAPS a 0,2% / PBS foram adicionados.
  8. Para determinar uma estimativa da quantidade de proteína GFP isolado ou GFP-tagged, obter uma leitura da absorvância a 280 nm e compará-lo com uma curva padrão preparada a partir de albumina de soro bovino ou outra proteína de controlo na mesma solução tampão.
    NOTA: Devido às diferenças do coeficiente de extinção, esta concentração é uma estimativa, mas pode proporcionar uma concentração proteica aproximada para facilitar a análise posterior, sem perder amostra. concentração de proteína precisa pode ser dissuadirminada usando um ensaio de proteína de micro-Lowry certificando-se preparar a proteína padrão no mesmo tampão que a amostra. A análise adicional da proteína isolada pode ser realizado por transferência de Western da proteína isolada (utilizando a detecção de anticorpos para GFP) e comparação com o peso molecular previsto. Alternativamente, o uso dos anticorpos TMEM184A deve resultar em uma banda do tamanho previsto construção, mas também pode resultar em uma banda WT TMEM184A se dímeros oligómeros (ou de ordem mais elevada) estão presentes na amostra. Uma estimativa de pureza podem ser obtidos por coloração de uma mancha de proteína total da amostra isolado vs proteína total a partir de uma alíquota do material de partida.

8. In Vitro A heparina ensaio de ligação

  1. Prepara-se uma placa de 96 poços revestidas com avidina preto por lavagem com 200 uL de 0,2% de CHAPS / PBS três vezes durante 5 min com agitação. Prepara-se uma preto não revestida placa de 96 poços idêntica empregando o mesmo procedimento de lavagem. Prepare umlayout para as amostras experimentais (em triplicado) a seguir durante o ensaio. Incluem poços para concentrações padrão de heparina, controles de buffer, e poços com amostras GFP sem heparina para confirmar branqueamento da GFP.
    NOTA: Se de isolamento ou de interacção ligando buffers otimizados são diferentes para a proteína em questão, fazer todas as preparações de pratos, e lavar com o sistema tampão ideal.
  2. Adicionar 100 uL de 60 pmol / cavidade biotinilado anti-GFP a todas as cavidades da placa revestida com avidina, onde é desejada a ligação de GFP. A quantidade de anticorpo é apenas suficiente para saturar a avidina de alta afinidade nas cavidades.
    1. Adicionar tampão só para todos os poços utilizados para o controlo (sem GFP ou GFP-TMEM184A ligação desejada). Selar os poços com uma tampa de placa para evitar a evaporação. Incuba-se durante 2 h à TA, com agitação.
      NOTA: Os volumes adicionados aos poços e tempos de incubação são baseadas em recomendações do provedor.
  3. Lave todos os poços três vezesdurante 5 min com 200 ul de 0,2% de CHAPS / PBS.
  4. Adicionar 100 uL de 5 nmol / bem-GFP ou GFP TMEM184A aos poços apropriados na placa revestida com avidina e incubar durante 1 h à TA com agitação. Lavar novamente como em 8.3.
    NOTA: Esta concentração de proteína foi escolhida para assegurar que todos os sítios estavam saturados com GFP excesso ou GFP-TMEM184A. Isto é importante para assegurar que a mesma quantidade de proteína é ligado a cada poço. Quantidades mais baixas de proteína também pode saturar os sítios, uma possibilidade que pode ser examinada através da avaliação de proteína não ligada remanescente após incubação várias concentrações de proteína com a placa e comparando a proteína não ligada e ligando de ensaios de ligação.
  5. Prepare a várias concentrações de heparina marcada com f luoresceina, por exemplo, 10, 25, 50, 75, 100, 200 ug / mL, em 0,2% de CHAPS / PBS. Faça isso e todo o trabalho restante no escuro.
    NOTA: Antes da preparação de concentrações, as concentrações específicas de outros ligandos deve ser determinada para a protei-alvo n em questão. A concentração mais baixa deve ser detectável no leitor de placas. Por isso, é importante primeiro determinar o intervalo que pode ser detectada com precisão no sistema tampão empregue. Em seguida, determinar o intervalo necessário para a obtenção de ligação mensurável. As concentrações de f luoresceina-heparina abaixo de 10 ug / ml não registam sistematicamente no leitor de placas de acordo com as condições de tampão utilizadas. Da mesma forma, enquanto que a heparina-rodamina tal como utilizado nos outros ensaios, podem ser visualizados no leitor de placas, nas condições de tampão e nas concentrações requeridas para a ligação, as leituras de fluorescência para os padrões não foram reprodutivelmente diferente com que fluoróforo.
  6. Adicionar 100 ul de fluoresceína-heparina para poços de ensaio apropriados nos poços de placas e concentração padrão revestidas com avidina, tanto no revestida com avidina e a chapa não revestida. Incubar durante 10 min à TA com agitação. Mantenha as placas no escuro (ou folha coberto).
  7. Usando uma rea ​​placader, gravar a emissão de fluorescência inicial a partir da heparina nos poços de ambas as placas e a fluorescência inicial de emissão (total) a partir de poços com imobilizada GFP-TMEM184A ou GFP na placa revestida com avidina de controlo. Se necessário, ajustar o ganho do instrumento para garantir a detecção de heparina fluorescente entre o menor e maior concentração.
    NOTA: Certifique-se o leitor de placas lê poços de cima e lê no local óptimo nos poços se que é ajustável. Para o estudo em questão, a localização ótima foi de cerca de 75% abaixo dos poços. Informações disponíveis com o leitor de placas deve fornecer sugestões que são únicas para o leitor de placas em questão para a leitura de ensaios de amostra ligado em placas pretas.
  8. Remover heparina fluorescente não ligado dos poços com imobilizado GFP-TMEM184A ou GFP e colocar nos poços correspondentes na placa não-revestido preto. Ler de imediato a emissão de fluorescência.
  9. Adicionar 100 mL frescos 0,2% CHAPS / PBS volta intO poços a partir do qual a fluoresceína-heparina foi removido, e ler emissão de fluorescência.
  10. Repita os passos de 8,8-8,9 3x.
    NOTA: Estas leituras da placa revestida indicam fluoresceína heparina remanescente nas GFP ou GFP-TMEM184A poços. Se fluorescência significativa é encontrada na terceira amostra não ligada, uma lavagem adicional deve ocorrer. Se fluorescência continua a ser removido em cada lavagem, ligação do ligando pode ser baixa afinidade, e as condições devem ser reavaliados. A leitura final constitui a leitura de heparina ligada.
  11. emissão de fluorescência registro das removidos, não ligados, as amostras na placa não revestida, a obtenção de números para cada lavagem. Estas são as leituras "desacoplado".
  12. Use valores totais de emissão de heparina obtidos em 8.7 para confirmar os níveis correctos de heparina adicionada a cada poço. Subtrair média leituras de fundo a partir dos valores.
    NOTA: Wells sem qualquer fluoresceína-heparina servir como pano de fundo, devido ao anticorpo, a GFP e buffer. average o fundo repete para obter o valor de fundo. médios Subtrair fundo leituras das leituras ligadas e não ligadas para obter valores reais.
  13. Empregar um terreno de emissão vs. total de fluoresceína-heparina adicionada para determinar a escala de emissão vs. quantidade de heparina.
    NOTA: apenas anticorpo, ou anticorpo e antigénio resultou em alguns extinção da fluorescência. Portanto, a heparina total foi determinado com base no total de heparina adicionada como observado em 8,7.
  14. Traçar a heparina ligada corrigida vs. heparina acrescentado para os triplicados, tanto no caso GFP-TMEM184A eo caso GFP.
  15. Determinar o ligando livre, adicionando as leituras não ligadas a partir de todas as lavagens para uma concentração específica.

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Representative Results

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Embora, em teoria, a transfecção de qualquer construção de ADN para as células pode ser realizada com os reagentes de transfecção lipofílicos, relatórios anteriores indicam transfecção mais eficaz de GFP construções em células endoteliais utilizando electroporação 12. O protocolo aqui fornecida tipicamente conseguida GFP-construção de expressão em mais de 80% das células endoteliais derivados de primários e células de músculo liso utilizados. Projeto da construção empregado utilizou um sistema comercialmente disponível que poderia entregar esta construção rapidamente. O principal uso pretendido foi focado em questões de localização, portanto, a entrega correta para a membrana, juntamente com a expressão da proteína eucariótica ideal e produção de construção continuou foram considerações preliminares. Outras considerações podem incluir: diferente localização da GFP por proteínas localizadas de forma diferente ou proteínas com um terminal C que é parte de uma região dobrada, a possibilidade de wanting para remover a GFP (a adição de um sítio de clivagem de protease), e um local de afinidade secundário. Este último iria proporcionar formas alternativas de purificação da GFP e estabilizá-la sobre uma superfície para o ensaio de ligação. Para confirmar os padrões de coloração para anticorpos diferentes contra TMEM184A comerciais, células vasculares expressando GFP-TMEM184A foram comparadas com as células idênticas coradas com os anticorpos comerciais. O período de tempo após transfecção de distribuição impactos de GFP-TMEM184A, que apareceu a acumular-se ao longo de pelo menos 72 h. O período de tempo após a transfecção, resultando em expressão óptima varia com o tipo de células e devem ser optimizados para cada técnica. Ao longo do tempo, mais do rótulo GFP foi na região peri-nuclear. Dependendo manuseio, GFP branqueamento também ocorreu. Os resultados indicaram GFP-TMEM184A na superfície da célula e nas estruturas vesiculares peri-nuclear e outros semelhantes para a localização observada coloração com anticorpo TMEM184A (Figura 1). As células primárias em Figura 5 em que a técnica também foi usada para avaliar a topologia de membrana.

A utilização de um ligando fluorescente (rodamina-heparina) facilitou a avaliação de co-localização de ligando e receptor ao longo do tempo, e as duas etiquetas, foi possível realizar imagens ao vivo (Figura 2 e um filme). Figura 2C foi fotografada por uma excitante a GFP a 405 nm, mas a captura das emissões do rodamina (imagens de meio). excitação GFP é limitada a 405 nm produzindo emissão limitada, bem como, mas isso impedido de excitação de rodamina e um sinal FRET falsa. Da mesma forma, a FRET Inducemissão de rodamina ed era fraca. Em controlos com a expressão de GFP-TMEM184A, mas sem rodamina-heparina, e os outros apenas com rodamina-heparina houve nenhuma emissão rodamina com 405 nm de excitação. Depois, GFP total (imagens à esquerda) e rodamina total (imagens direitas) foram medidos usando comprimentos de onda de excitação / emissão normalizados para cada fluoróforo. Os dados em C suportam ainda mais a co-localização do ligando e o GFP-TMEM184A. absorção de Rodamina-heparina em RAOEC necessário mais tempo de incubação, em comparação com células A7r5. Nenhuma evidência de FRET foi observada em células sem rodamina-heparina ou em células não transfectadas. Um experimento ideal seria incluir outro GFP-construção superfície que não deve ter nenhum co-localização com o ligante.

Aquisição ou recuperação da função também poderia ser realizada com construções de GFP-proteína e rodamina-heparina. Isso proporcionou a oportunidade de usar a GFP como prova para o nível de expressão e co-ligantelocalização e quantificação das interações. Especificamente, a absorção de heparina foi aumentada em GFP-TMEM184A células A7r5 (Figura 3) construir-transfectadas. Células knockdown estáveis que ocupam muito limitado rodamina-heparina foram produzidos 1, e estes forneceu um sistema onde ganho de função poderia ser avaliada. A transfecção de GFP-TMEM184A resultou em células que internalizam poderia novamente rodamina-heparina no nível de células do tipo selvagem ou acima (Figura 3). Deve-se notar que a imagem "sem heparina" é de células estáveis ​​de knockdown, que não expressam GFP como um repórter para a construção de knockdown. a fluorescência de fundo foi mais elevada nestas células, como observado na imagem mostrada.

É normalmente útil usar receptor isolado por determinação da especificidade do ligando para diminuir a probabilidade de outras proteínas que interagem com o ligando. O uso de um GFP-proteiN construção proporciona uma vantagem significativa, a este respeito, como a etiqueta de GFP pode servir como um identificador para o isolamento da proteína e evita possíveis interacções de anticorpos ou outros reagentes de afinidade com proteínas adicionais. GFP também pode ser expresso em populações de células idênticas e isolado utilizando o mesmo procedimento GFP afinidade. Isto proporciona uma proteína de controlo para estudos de interacção ligando. No sistema TMEM184A, o GFP-TMEM184A isolado utilizando um procedimento de afinidade de anticorpo anti-GFP resultou em heparina específica, saturável, enquanto a GFP de controlo não se liga de heparina (Figura 4).

Normalmente, as etiquetas GFP em constructos são colocadas numa extremidade de uma proteína. A localização do terminal C da proteína facilita o tráfico correcta a uma membrana. Por isso, a disponibilidade de GFP em um determinado lado de uma membrana pode fornecer evidência de topologia específica de uma proteína de membrana se dobrar e topologia não são umlready conhecido. Simples imunofluorescência com anticorpos contra GFP (tal como na Figura 5) pode fornecer evidência de localização de GFP com base no acesso de anticorpo em células não-permeabilizadas. Os anticorpos anti-GFP GFP reconhecer mesmo branqueada. Coloração de imunofluorescência mostrado na Figura 5 indica a coloração anti-GFP significativa sem permeabilização das células GFP-TMEM184A transfectadas que fornecem evidência preliminar de que a GFP na membrana plasmática é extracelular. Claramente, a proteína intracelular em vesículas torna-se também corados nas células permeabilizadas. Imagens FRET na Figura 2C são consistentes com esta topologia proposta.

figura 1
Figura 1: Localização GFP-TEMEM184A em Células Confirma TMEM184A Localização Determinado por imunofluorescência. A) BAOECs transfectadas com GFP-TMEM184A foram fixadas com PFA 4%. As células não transf ectadas foram processadas quer com metanol (MeOH) de fixação arrefecido com gelo e permeabilização ou PFA a 4% seguido por Triton X-100 a permeabilização (como indicado). As células não transfectadas foram coradas utilizando um anticorpo contra um péptido do terminal C a partir de TMEM184A (CTD) ou um péptido N-terminal de TMEM184A (NTD) e um anticorpo anti-coelho secundário marcado com TRITC. B) Exemplos de clonados (A7r5) e) células musculares lisas primárias (BAOSMC foram processados de forma semelhante. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Imagem de GFP-TMEM184A com Rodamina-heparina. A) A7r5s electroporadas com GFP-TMEM184A foram tratadas com 100 ug / mL de rodamina-heparina para otempos indicados e, em seguida, fixadas com PFA a 4%. As imagens são representativos de duas experiências separadas. B) células A7r5 foram transfectadas com GFP-TMEM184A e rodamina-heparina foi adicionado com imagens ao vivo imediato. quadros selecionados do filme são mostradas com uma barra vertical apontando para a localização inicial de uma vesícula revestida de GFP contendo rodamina-heparina. O marcador de GFP e a rodamina se movem em conjunto. Barras de escala = 2 uM. C) RAOECs tratados como em A foram fotografadas para a ressonância de fluorescência de transferência de energia através da excitação a 405 (GFP, por FRET) e em comparação com as configurações padrão, consulte o protocolo 3.5. Painel A, e os dois pontos de tempo em B, foram originalmente publicado no Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP et ai. 1. Copyright da Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular. Por favor clique aqui para vIEW uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: GFP-TMEM184A transfecção proporciona ganho de função. A) significativamente os níveis mais baixos de rodamina-heparina são vistas em células A7r5 knockdown estáveis em comparação com o tipo selvagem A7r5s, ver exemplo imagens. A imagem "sem heparina" é de knockdown células estáveis ​​que expressam GFP como um marcador da presença da construção. Barras de escala = 10 uM. B) Transfecção de GFP-TMEM184A em ambos do tipo selvagem e células knockdown estáveis aumenta significativamente o sinal de rodamina-heparina nestas células com base na análise de mais de 50 células / condição em três experiências independentes. As barras de erro representam SEM. p <0,0001 com base em um teste de Tukey. Esta figura foi originalmente publicado no Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP et ai. 1. Copyright da Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Isolado GFP-TMEM184A Binds heparina. GFP-TMEM184A ou GFP foi isolado e ligado a placas de ensaio revestidas com avidina. Fluoresceína-heparina foi adicionada em concentrações de 0,056 nmol através 1,111 nmol. A heparina ligada foi determinada medindo a emissão a 519 nm. GFP-TMEM184A (quadrados). GFP controlo (círculos). Esta figura foi originalmente publicado no Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP et ai. 1. Copyright da Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular. _blank "> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5: GFP-TMEM184A e Membrana de topologia. GFP-TMEM184A células transfectadas foram ou fixadas com 4% de PFA (parte superior) ou fixada com PFA a 4% e permeabilizadas com Triton X-100 (inferior). As células foram coradas de forma idêntica com anticorpos primários anti-GFP e anticorpos secundários marcados com Cy3. Barras de escala = 10 uM. Dois experimentos diferentes são mostrados. apenas as células coradas secundária revelaram essencialmente nenhuma coloração. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

filme 1
pload 55053 movie.mp4 "target =" / / _ blank "> Filme 1:.. Vivo-imaging de GFP-TMEM184A com Rodamina-Heparina (Clique direito a download) células A7r5 foram tratados como na figura 2B O filme ilustra a GFP TMEM184A e da vesícula rodamina-heparina no topo movendo juntos. versões de cores separadas, além da versão mesclada do filme são mostradas. a vesícula com GFP e contendo rodamina está cercada.

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Discussion

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Os protocolos aqui relatados foram concebidos para proporcionar provas de confirmação para a identificação de um receptor TMEM184A como heparina em células vasculares 1. knockdown técnicas são rotineiramente utilizado como um mecanismo para confirmar a identificação de novas proteínas. No entanto, alguma perda funcional após knockdown não é geralmente suficiente a prova de que uma proteína candidata é realmente o receptor correcto (ou outra proteína funcional). É também importante ter evidência de que a proteína candidata realmente apresenta a função. Empregando uma construção de um novo gene marcado com GFP permite que o ganho de experiências de função e facilita o isolamento da proteína etiquetada por afinidade GFP. A electroporação empregue neste protocolo facilitada muito alta eficiência de transfecção da construção (maior do que 80% das células expressaram a construção). No entanto, outros mecanismos de transfecção pode ser usado se a electroporação não está disponível ou não é desejável. Existem várias vantagens para selecionar uma construção GFP para a confirmação de uma função nova proteína. Em primeiro lugar, a GFP serve como um repórter para a transfecção e expressão de genes e permite que a sobre-expressão de ser monitorizado através de GFP se uma linha de células sem expressão da proteína não está disponível. Em segundo lugar, o tag de GFP fornece uma ferramenta para a purificação da proteína, que não depende de qualquer afinidade de ligando ou anticorpos contra péptidos. Em terceiro lugar, o tag de GFP fornece uma ferramenta para examinar complexo de localização por imunofluorescência visualizados utilizando anticorpos gerados contra péptidos únicos na sequência de proteína alvo para determinar se o produto do gene real é similarmente localizada.

Ganho de ensaios funcionais com construções de genes estão a ser usados para uma série de fins, incluindo rastreio de alto rendimento para a identificação da função nova proteína de 13. Idealmente, o ganho de testes de função iria empregar um li celular clonado bem estudadoNE que não expressa o gene em causa (as células ainda deve expressar produtos de genes que permitem a função do gene recentemente expressa cooperando). Quando se utiliza uma construção específica marcado com GFP como nos presentes ensaios, é crítica a utilização de células em que o GFP-proteína pode funcionar. Assim, a escolha de células depende da função e, provavelmente, o tipo de célula na qual a função normalmente ocorreria para assegurar que cooperam proteínas estão presentes. GFP-marcação permite uma forma adicional de função de controlo, no caso onde a fluorescência da proteína GFP pode ser seguido, como parte de um ensaio funcional (por exemplo, ver Figuras 2 e 3). Uma limitação a estes estudos seria se GFP de alguma forma altera a função da proteína. Ao ligar a GFP para o C-terminal da proteína, um grande número de proteínas foram já estudados sem uma alteração funcional aparente, mas essa possibilidade existe.

Radioisotopically ligandos marcados têm sido frequentemente usados para estudar a ligação a células intactas 11 ligando. No entanto, esses ensaios não permitem simples determinação da localização ligando após a ligação, nem facilitar as comparações de ligando e receptor em conjunto, como no presente relatório. Um GFP também proporciona oportunidades adicionais para examinar uma proteína de membrana identificada como aqui. Devido à localização C-terminal da etiqueta de GFP, é possível examinar a localização da marca de GFP em células transfectadas durante todo um ensaio. Imunofluorescência utilizando anticorpos para GFP permite a comparação de GFP acessíveis aos anticorpos com e sem permeabilização (Figura 5). Aplicações adicionais de GFP-TMEM184A tirar proveito de imagiologia tais como a GFP co-localização com rodamina-heparina (Figura 2). Empregando FRET para permitir a emissão de GFP para excitar o rodamina-heparina como mostrado na 2C oferece uma maneira interessante avaliar tra vinculativo e intracelularfficking. Além disso, FRET dados indicam que a GFP é suficientemente perto (dentro de 10 nm) para a rodamina-ligando para transferir excitação. A prova de que essa transferência de GFP a um ligando obras foi publicada por hormônio da paratireóide marcada com tetrametil-rodamina 14. Alternativa tecnologia FRET (foto-branqueamento e / ou padrões de imagens através de computador) pode também ser empregue para análise mais complexa do que o que é mostrado aqui como um exemplo. Do mesmo modo, as interacções de outras proteínas com o candidato pode ser analisada usando a FRET com marcadores fluorescentes optimizadas para FRET como no sistema de EGFP / mCherry relatado por Albertazzi et ai. 15 e PCP / YFP e GFP pares utilizados em estudos de canais de potássio por Wang e colegas 16. Muitas moléculas fluorescentes pequenos novos estão sendo projetados, por exemplo 17. Estas moléculas irá aumentar o número de casos em que FRET interacções entre proteínas e f GFPluorescent ligandos podem ser examinados. Estudos futuros também pode envolver alterações no gene alvo, permitindo a construção para ajudar a determinar os aspectos específicos da sequência da função do gene. Uma limitação para proteínas de membrana GFP é quando o terminal C da proteína é normalmente dentro. Em tais casos, ensaios de FRET com ligandos fluorescentes solúveis em água pode não ser possível. No entanto, os mecanismos alternativos para colocar GFP em outras partes do construto pode ainda ser possível para algumas de tais proteínas, e outros ensaios aqui referidos ainda pode ser empregue.

Em adição à função, localização, e in vivo interacções ligando, uma proteína GFP-etiquetado pode ser isolado utilizando um anticorpo anti-GFP e a proteína isolada usado para examinar a função empregando ensaios in vitro em que o GFP permite um isolamento imparcial da proteína e um controle relativamente isolados (GFP livre). Juntos, esses ensaios podem fornecer evidências adicionais forte necessários para provar thnas funções de proteína candidata como hipótese.

Além disso, como a GFP é resistente à protease, a menos que modificado com sítios que se estendem para longe da estrutura compacta 18, o tratamento com protease limitado de células deve libertar GFP extracelular. A clivagem de protease que ocorrem na proteína ao qual está ligado ou GFP em uma região de ligação concebido. O produto libertado seria GFP com uma extensão N-terminal à sequência de GFP. A tripsina não deve libertar GFP se o C-terminal da proteína à qual está ligado é GFP intracelular. Uma análise preliminar dos produtos potenciais poderia sugerir um padrão de peso molecular clara com uma proteína GFP-tagged lançado pela tripsina. Para muitas proteínas de membrana, tais técnicas resultaria em evidência clara para a topologia de membrana por libertação da GFP, ou a falta dela.

Juntos, os ensaios específicos apresentados e / ou propostas neste relatório fornecem uma ampla amostragem de técnicas de tchapéu pode ser empregue para examinar novas proteínas, iniciando com uma construção fluorescentemente marcados. Tais construções podem ser facilmente obtidos comercialmente. A oportunidade de usá-los para uma ampla gama de técnicas torna economicamente viável, mesmo para pequenos laboratórios com orçamentos limitados.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GFP-TMEM184A construct OriGene RG213192
Rhodamine-Heparin Creative PEGWorks HP-204 Light Sensitive
Fluorescein-Heparin Creative PEGWorks HP-201 Light Sensitive
Mowiol EMD Millipore 475904-100GM
Paraformaldehyde (PFA, methanol free) Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific PI28908 at Fisher Use in Fume Hood
Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96-well dishes) Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific PI15510 at Fisher Pay attention to shelf-life
Black 96-well plates Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific 064432 at Fisher
A7r5 vascular smooth muscle cell line ATCC CRL 1444 Can be exchanged into MEM medium1
BAOEC bovine aortic endothelial cells Cell Applications, Inc. B304-05 Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7
BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells Cell Applications, Inc. B354-05 Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1
RAOEC rat aortic endothelial cells Cell Applications, Inc. R304-05a Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7
Biotinylated anti-GFP Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific MA5-15256-BTIN
Streptavidin-coated beads Sigma S1638
HeBS Available from Bio-Rad Can be prepared in the lab. The pH is 6.8
TMEM184A antibody to the N-terminus Santa Cruz Biotechnology sc292006 Only known TMEM184A antibody to N-terminal region.
TMEM184A antibody to the C-terminus Obtained from ProSci Inc, Poway, CA  Pro Sci 5681 ProSci used in Figure 1
GFP antibodies Santa Cruz Biotechnology sc9996 Used in Figure 5
Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC)
715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3)
Minimal cross-reactivity to minimize any nonspecific staining.
CHAPS Purchased from Sigma C5849 Note that this specific catalog number has been discontinued.  Supplier will provide information regarding replacement.
Live imaging 35-mm dishes MatTek (Ashland MA) P35G-1.0 – 20 mm - C
Confocal Microscope Zeiss LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3
Confocal Microscope Nikon C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens Used for images in Figure 5
Confocal Microscope Zeiss Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens Used for images in Figure 2C
Electroporation equipment Bio-Rad Gene Pulser X-Cell System
Electroporation cuvettes Available from MidSci EC2L Can also be obtained from equipment supplier
Plate reader TECAN TECAN Infinite® m200 Pro plate reader Readings in the middle of the wells rather than at the surface.
Computer program for measuring staining intensity Image J https://imagej.nih.gov/ij/
Program and information available on-line
Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail  
Cell Culture trypsin solution Sigma T4174 purchased as a 10x solution

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References

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Usando um TMEM184A GFP Construir para a confirmação da Heparina Receptor Identity
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Farwell, S. L. N., Slee, J. B., Li, Y., Lowe-Krentz, L. J. Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity. J. Vis. Exp. (120), e55053, doi:10.3791/55053 (2017).More

Farwell, S. L. N., Slee, J. B., Li, Y., Lowe-Krentz, L. J. Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity. J. Vis. Exp. (120), e55053, doi:10.3791/55053 (2017).

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