Abstract
In de meeste zoogdieren gehoorbeentjes van het middenoor, zoals de hamer, aambeeld en stijgbeugel, zijn de kleinste botten. Bij muizen, een benige structuur genaamd de auditieve bulla herbergt de gehoorbeentjes, terwijl de auditieve capsule het binnenoor, namelijk het slakkenhuis en halfcirkelvormige kanalen omsluit. Murine gehoorbeentjes zijn essentieel voor het gehoor en dus van groot belang voor onderzoekers op het gebied van KNO, maar hun metabolisme, de ontwikkeling en evolutie zeer relevant zijn voor andere gebieden. Veranderde het botmetabolisme kan invloed hebben op het gehoor functie bij volwassen muizen, en diverse gen-deficiënte muizen vertonen veranderingen in de morfogenese van gehoorbeentjes in de baarmoeder. Hoewel muizen gehoorbeentjes zijn klein, hun manipulatie haalbaar is als men hun anatomische oriëntatie en 3D-structuur begrijpt. Hier beschrijven we hoe de auditieve bulla en de capsule van postnatale muizen ontleden en vervolgens te isoleren individuele gehoorbeentjes door een deel van de bulla verwijderen. We bespreken ook hoe je emhet bed van de bulla en de capsule in verschillende oriëntaties voor het genereren van paraffine of ingevroren secties geschikt zijn voor de bereiding van de lengterichting, horizontaal of frontale delen van de hamer. Tot slot noemen we anatomische verschillen tussen muis en mens gehoorbeentjes. Deze methoden zou nuttig zijn bij het analyseren van pathologische, ontwikkelings- en evolutionaire aspecten van de gehoorbeentjes en het middenoor bij muizen zijn.
Introduction
De drie gehoorbeentjes van het middenoor, namelijk de hamer, aambeeld en stijgbeugel, vormen een zoogdier-specifieke auditief keten die geluid uitzendt van het trommelvlies naar het binnenoor of cochlea 1,2. Hoorzitting functie kan in muizen worden geëvalueerd door het meten van BAER-test (ABR) drempelwaarden 3-6, en de trillingen van de hamer achter het trommelvlies kan worden gecontroleerd met behulp van Laser Doppler vibratiemeting (LDV) 7. Door het combineren van ABR, LDV en Distortion Product Otoakoestische Emission (DPOAE) metingen kan geleidende gehoorverlies te onderscheiden van perceptief impairment 8.
Diermodellen van oor omstandigheden nodig, gezien het belang van het gehoor en gezondheid oor aan het welzijn van patiënten van alle leeftijden. Bijvoorbeeld otitis media is een veel voorkomende oorontsteking waargenomen bij humane zuigelingen en kinderen, en ernstige, acute otitis media en de complicaties kunnen optreden als de conditie is niet behandeld met geschikte antimicrobiële stoffen 9. Muismodellen van otitis media kan nuttig zijn bij het begrijpen van de pathogenese en in het ontwikkelen van behandelingen 10,11.
Murine gehoorbeentjes, die (met uitzondering van de goniale deel van de hamer) gevormd door endochondrale ossificatie 12,13, zijn bijzonder relevant voor de studie van het botmetabolisme en morfogenese. Ten eerste, hun kleine formaat maakt hoge-resolutie analyse van de botten met een intacte beenvlies met X-ray of fluorescentiemicroscopie 14. Ten tweede, afwijkende botmetabolisme, zoals overmatige of deficiënte botresorptie of verminderde interacties tussen botcellen 15, kan worden opgevat als een mogelijke bijdrage aan gehoorverlies 3,4,7. Ten derde, abnormale beentje morfogenese wordt vermeld voor diverse gen-deficiënte muizen, zoals dieren ontbreken Hoxa2 16-19, 20-22 MSX1, Prrx1 23, Goosecoid(Gsc) 24,25, Bapx1 13, Tshz1 26, Dusp6 (Mkp3) 27, Noggin (Nog) 28, FGFR1 29, schildklierhormoon receptoren (Thra, Thrb) 5, Bcl2 30 en anderen 1,31, of in muizen overexpressie Hoxa2 32. Tot slot, ondanks hun geringe omvang, structuren in verband met de gehoorbeentjes, zoals spieren en gewrichten 33 34,35 toegankelijk zijn.
Muis gehoorbeentjes kleiner dan menselijke gehoorbeentjes, maar het is opmerkelijk dat de muis middenoor geen miniatuurversie van zijn menselijke tegenhanger. Bijvoorbeeld, in muizen, de stapediale slagader, die door de ring van de stijgbeugel geeft blijft gedurende het hele leven 36, terwijl bij de mens, de embryonale stapediale slagader verdwijnt tijdens de dracht. Bovendien, de morfologie van de muis hamer verschilt van die van de menselijk bot (zie figuur 6). Bij muizen, de auditieve (trommelvlies) bulla omsluit de met lucht gevulde middenoor holte, terwijl bij de mens, mastoideus luchtcellen bestaat uit trabeculair bot in het slaapbeen bevindt zich de gehoorbeentjes in plaats van een bulla 37. In beide soorten, de auditieve capsule (Otic capsule, knokige labyrint) omsluit het slakkenhuis en halfcirkelvormige kanalen van het binnenoor. Vergelijkende en evolutionaire biologie van het middenoor is uitgebreid beoordeeld 38-40.
Het protocol voorzien hieronder eerst beschreven hoe te ontleden het auditieve bulla en de capsule, die voornamelijk bestaan uit het middenoor en het binnenoor, respectievelijk. Dit protocol toont ook aan hoe de hamer, aambeeld en stijgbeugel van het auditieve bulla te isoleren. Tot slot, het laat zien hoe de auditieve bulla en de capsule te oriënteren voor het inbedden in de voorbereiding op het weefsel snijden van de gehoorbeentjes.
Protocol
Alle dierlijke procedures uitgevoerd in deze studie worden goedgekeurd door de Keio University Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC - erkenningsnummer: 09.221) en volg de institutionele richtlijnen inzake dierproeven aan Keio University voor het gebruik van dieren in het onderzoek. Menselijke specimens werden geïsoleerd uit een kadaver gedoneerd aan de afdeling Anatomie, Keio University School of Medicine, en werden gebruikt in overeenstemming met de institutionele regelgeving.
1. Isolatie van Auditieve Bulla en Capsule
- Euthanaseren muizen in een pot met een platform boven keukenpapier gedrenkt in isofluraan of sevofluraan tot respiratoire ventilatie langer dans een minuut en voer cervicale dislocatie. Wees voorzichtig om direct contact van muizen met de geweekte papieren handdoeken te vermijden.
- Voeg een kleine dwarse snede in de dorsale kant van de nek en trek huid elkaar naar de kop en staart met beide handen onderliggende hals mu blootSCLE weefsel.
- Onthoofden muizen op de cervicale regio met behulp van 14 cm scherpe chirurgische schaar.
- Peel huid volledig in de richting van de neus. Snijd alle huid samen met de snuit en snijtanden.
- Plaats schaar in de mond en snijd kauwspieren aan beide zijden.
- Open de kaak voorzichtig en verwijder de tong en de onderkaak elkaar.
- Met behulp van een scherpe schaar, gespleten schedel en schedelbasis in twee helften langs het sagittale vlak (figuur 1 A, B).
- Met behulp van een tang, verwijder de cerebrale en cerebellaire hemisferen en de hersenstam. De auditieve bulla en capsule zich lateraal van het cerebellum en hersenstam. Merk op dat de auditieve bulla verder lateraal van de auditieve capsule (figuur 1C, D).
- Ontleden de bulla en capsule met de omringende schedel bot (figuur 1E).
- Breng het monster op een schotel met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 bij kamertemperatuur.
- Under een binoculair microscoop ontleden, een tang de omringende botten en een schaar uit elkaar te trekken om de losgemaakte grens rond de bulla en de capsule (figuur 1F) te snijden. De omringende beenderen verwijderd zijn de basioccipital (ventrale grens), exoccipital (ventro-posterior grens), supraoccipitale (posterior grens), interparietal, pariëtale (dorsale grens), squamosal (dorso-anterieure grens), alisphenoid (anterior grens), en basisfenoïdbeen (antero-ventrale grens) botten. Merk op dat de styliform proces (Sp), die de tympanische opening van de buis van Eustachius 41 ondersteunt, verschilt van de styloid proces van het slaapbeen.
2. Isolatie van gehoorbeentjes: Malleus, Incus en Stapes
- soort been
- Waarbij zowel kleine schaar en forceps, verwijder het gedeelte van de uitwendige gehoorgang lateraal van de sulcus tympanicus zodat het trommelvlies zichtbaar (Figuur 2A, B).
- Verwijder een deel van het trommelvlies en trommelvlies bot in de buurt van de malleal processus brevis (kringspieren apophysis, zie Discussie), zowel op het ventrale (stippellijn) en posterior (#) wanden (figuur 2C). De hamer en de tensor tympani spier moet nu worden blootgesteld (figuur 2D, E).
- Til de Malleus (figuur 2F) en snijd de tensor tympani spier met de schuine rand van een 27 G naald (figuur 2G). Merk op dat de malleal manubrium stevig hecht aan het trommelvlies, zoals gezien in andere zoogdieren.
- Maak het trommelvlies voorzichtig uit de manubrium, dat is kwetsbaar. Verwijder het trommelvlies bot om de drie gehoorbeentjes onthullen.
- Ontwrichten de hamer van het aambeeld op de ossicular gewricht (figuur 2H).
- Isoleer de hamer door het breken van de voorste proces op goniale.
- Aambeeld en Stapes
- isoleer tHij incus door het afsnijden van het achterste ligament van de incus aan de korte crus (figuur 3A).
- Isoleer de stijgbeugel door het afsnijden van de stapediale slagader in de buurt van de stijgbeugel met de schuine rand van een 27 G naald (Figuur 3B, C). Indien nodig, knip de pees van de stapediale spier aan de gespierde proces van de stijgbeugel met de naald.
- Plaats een naald (of een markering pen) in de obturator foramen van de stijgbeugel en til de stijgbeugel. Na het verwijderen van de stijgbeugel, moet het ovale venster opening duidelijk zichtbaar (figuur 3D).
3. Inbedding van Auditieve Bulla en Capsule
- Voorbereiding voor het inbedden in paraffine blokken
- Isoleer de bulla en de capsule zoals beschreven in paragraaf 1.
- Snijd het voorste uiteinde van de bulla (styliform de werkwijze) met een schaar, dompel de bulla en capsule in 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS bij 4 °C, en laat fixerende in de bulla te gaan. Als er lucht wordt gevangen in de bulla, verwijder deze dan met een naald en spuit. Laat de bulla en de capsule in het fixeermiddel bij 4 ° CO / N op een buis rotator.
Let op: PFA is giftig en moet zorgvuldig worden behandeld. - Was eenmaal met PBS.
- Ontkalken bulla capsule en een week bij 4 ° C in 10% ethyleendiaminetetraazijnzuur dinatriumzout dihydraat (EDTA-2Na), 100 mM Tris-base, pH 7,0, in een 2 ml buisje. Wijzig de buffer om de andere dag.
- Was eenmaal met PBS. Monsters kunnen worden opgeslagen in 70% ethanol in water bij 4 ° C. Eventueel overbrengen naar 70% ethanol door een gegradeerde reeks alcohol (30%, 50%, 70% in water).
- Een weefselprocessor, dehydrateren specimens in een gegradeerde reeks ethanoloplossingen (70%, 2 x 95%, 3 x 100%, per 1 h), duidelijk xyleen (4x, elk 1 uur bij 40 ° C) en infiltreren exemplaren met gesmolten paraffinewas 42. Eventueel vervangende xyleen commerciële weefsel Clearing oplossing (bijv Histo-Clear).
- Uitladen exemplaren van de processor, en verwijder ze uit hun cassettes.
- Op een tissue inbedding console systeem, plaats exemplaren in mallen gevuld met gesmolten paraffinewas. Ga verder met het inbedden van (deel 4).
- Voorbereiding voor het inbedden in bevroren blokken (Kawamoto's film methode) 43
- Isoleer de bulla en de capsule zoals beschreven in paragraaf 1.
- Snijd het voorste uiteinde van de bulla (styliform de werkwijze) met een schaar, dompel de bulla en capsule fixatief (2% of 1% PFA in plaats van 4% in PBS antigeniteit behouden) bij 4 ° C. Als zich lucht in bulla, verwijder deze dan met behulp van een naald en spuit. Laat de bulla en de capsule in het fixeermiddel bij 4 ° CO / N op een buis rotator.
- Wassen bulla en capsule snel in PBS en onmiddellijk onderdompelen in vloeibare cryogene inbedding verbinding bij 4 ° C.
- Belangrijk: Verwijder luchtbellen indien aanwezig in het middenen oorschelp door middel van aspiratie met een naald, en door toevoeging van de inbedding verbinding met een tang. Ga verder met het inbedden van (deel 4).
4. Sample Orientation and Embedding
LET OP: De gehele bulla en capsule moet worden geregeld in een bepaalde oriëntatie tijdens het inbedden om de gewenste secties te snijden. De hieronder beschreven procedures worden gebruikt om het gedeelte Malleus in verschillende richtingen.
- Longitudinale (parasagittal) afsnijden van de hamer
- Zet de zijkant van de bulla of externe gehoorgang in warme paraffine (of cryo-inbedding compound). Stel de oriëntatie zodat de nek en transversale lamina van de hamer evenwijdig aan de horizontale bodem van de inbedding schotel (Figuur 4A - C) zijn. Merk op dat het trommelvlies helt onder een hoek van ongeveer 30 ° met de verticaal in de muis kop (Figuur 4A Figuur 59 in Kampen
- Zet de zijkant van de bulla of externe gehoorgang in warme paraffine (of cryo-inbedding compound). Stel de oriëntatie zodat de nek en transversale lamina van de hamer evenwijdig aan de horizontale bodem van de inbedding schotel (Figuur 4A - C) zijn. Merk op dat het trommelvlies helt onder een hoek van ongeveer 30 ° met de verticaal in de muis kop (Figuur 4A Figuur 59 in Kampen
- Horizontale snijden van de hamer
- Leg de dorsale kam horizontaal in warme paraffine (of cryo-inbedding compound). Stel de oriëntatie van de bulla en capsule zodat de nek en transversale lamina van de hamer loodrecht op de bodem van de schotel inbedding (Figuur 4D - F).
- Frontale snijden (dwarsdoorsneden) van manubrium en trommelvlies 5
- Plaats de malleal manubrium in warme paraffine (of cryo-inbedding compound) zodanig dat deze loodrecht op de bodem van de schotel insluiten.
- Afkoelen het blok tot temperaturen passend paraffine verharden op een tissue inbedding console-systeem (als alternatief, gebruik-cryo inbedding verbinding in een droog ijs / hexaan bad).
- Proces weefsel blok en geslepen secties met behulp van routine procedures. Bijvoorbeeld, vlek paraffine secties met hematoxyline en eosine (H & #38; E), safranine O (kraakbeen), of tartraat-resistent zuur fosfatase (TRAP) activiteit (voor osteoclasten) 3, of immunohistochemie. Ontkalkte vriescoupes zijn geschikt voor bot- etikettering gebruik fluorochromen 14, alizarine rood kleuring voor calcium en 42 immunofluorescentie.
Representative Results
Dit protocol geeft een methode om gehoorbeentjes van de muis auditieve bulla isoleren. Ten eerste, de bulla en capsule worden uitgesneden als één geheel uit de schedel (figuur 1). De ontlede bulla wordt dan gebruikt om de hamer (figuur 2) en het aambeeld en stijgbeugel (figuur 3) te bereiden. Bezienswaardigheden van de auditieve bulla en capsule zijn de styliform proces aan het voorste einde van de bulla, de dorsale kam, anterior halfronde kanaal, en de subarcuate fossa (Figuur 1F). Microcomputed tomografie (CT) beeldvorming openbaart gehoorbeentjes in het auditieve bulla en de optimale oriëntatie in de lengterichting en horizontaal snijden van de gehoorbeentjes (figuur 4).
Longitudinale paraffine snijden van de hamer, de bulla en capsules werden ontkalkt in EDTA bij 4 ° C gedurende één week, ingebed in een paRaffin blok aan de in figuur 4 A oriëntatie - C, coupes 4 urn en gekleurd met H & E. De hamer bevestigd aan het trommelvlies in het auditieve bulla geopenbaard lopende endochondrale ossificatie bij P14 (figuur 5A). Om vorming van nieuw bot te visualiseren, werd calceïne (30 ug / g lichaamsgewicht) peritoneaal geïnjecteerd in een P20 muis en bulla en capsule werden 24 uur later geïsoleerd op P21. Het monster werd ingevroren zonder ontkalking ingesloten en vervolgens cryosectioned op 6 pm met een zelfklevende film naar de wijze van Kawamoto 43. Na nucleaire kleuring met DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindool), werd de sectie waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop. Calceïne signalen (groen) toonde nieuwe botvorming in de hamersteel (m), bulla en capsule (figuur 5B). Voor horizontale afsnijden van de hamer, werd de auditieve bulla geïsoleerd uit een 5 weken oude muizen ingevroren ingebedde zonder ontkalking (voor deoriëntatie zie Figuur 4D - F), cryosectioned op 6 micrometer met behulp van de Kawamoto methode en gekleurd met H & E. Horizontale snijden van de malleal processus brevis (MPB) toont ook het slakkenhuis (figuur 5C).
Een mediale zicht op de juiste gehoorbeentjes geïsoleerd uit een P31 muis toont typische kenmerken van de muis Malleus, namelijk de 'glijdende-meeuw-vleugel-achtige "(of Perzisch zwaard-achtige 45) manubrium, een prominente processus brevis (orbicular apophysis zie Discussie) en de transversale lamina (figuur 6). Merk op dat de voorste proces (processus anterior) werd gebroken in de dissectie procedure rond de goniale en is gescheiden van de tympanische ring (ectotympanic). Deze representatieve steekproef vertoont een intacte incudomalleolar verbinding tussen de hamer en aambeeld, terwijl de incudostapedial gewricht is uit de kom. Tendineuze inserties in de malleal enstapediale gespierde processen detecteerbaar zijn (Figuur 6A, sterretjes).
Figuur 6B vergelijkt muizen en mensen gehoorbeentjes bij dezelfde vergroting. Species verschillen, anders dan de grootte, zijn de volgende. De malleal manubrium is wing-achtige bij muizen, maar club-achtige bij de mens. De hoek tussen de anatomische as (of de rotatieas, de lijn door de voorste proces van de hamer en de korte werkwijze volgens de incus) en het manubrium veel kleiner in muizen en de twee nagenoeg evenwijdige, tegenover bijna loodrechte bij mensen 6,46-48. In de menselijke gehoorbeentjes, vibrometric studies blijkt dat de incudo-malleolaire gewricht is mobiel in plaats van functioneel vaste 49. De muis Malleus vertoont een brede, dunne, en platte transversale lamina niet duidelijk bij de mens 47. In muizen, de processus voorste zekeringen membraneuze botten, namelijk de goniale en tympanic ring, terwijl bij mensen het processus anterior wordt gereduceerd tot een kleine spicule been 41. De stijgbeugel van muizen en mensen verschilt ook: in muizen, de voorste crus is gebogen en het achterste crus is meer rechttoe, terwijl bij de mens, de voorste crus is meer recht dan het achterste crus. Het is vermeldenswaard dat de Malleus hoofd in verhouding tot lichaamslengte massaal wordt vergroot in soorten, zoals de goudmollen, waaruit blijkt significante variabiliteit in allometrische relaties van de "kleinste" botten 48.
Figuur 1. Dissectie van de auditieve Bulla en Capsule. (A) De schedel van een P31 muis is verdeeld in rechter en linker helften. A, anterior; P, posterior; L, links; R, rechts. (B) mediale oppervlak van de rechter helft van de doorsneden, gevild hoofd. Cx, cerebrale cortex; Cb, cerebellum; Bs, brainstem. D, dorsale; V, ventrale. (C) Verwijdering van hersenen met een tang. (D) mediale Gezien de auditieve capsule op de juiste schedel. De dorsale kam (pijlpunten) ligt tussen de middelste schedelgroeve (MCF) en posterior schedelgroeve (PCF) en scheidt dorso-anterieure en ventro-posterior oppervlakken van de auditieve capsule. Schaal bar, 2 mm. (E) een hogere vergroting van de auditieve bulla en capsule (mediale view). Co, slakkenhuis; VII, gezichtszenuw; VIII, nervus vestibulocochlearis; AC, anterior (superior) halfronde gracht; Sf, subarcuate fossa, die de cerebellaire paraflocculus herbergt. Schaal bar, 1 mm. (F) Deze coupe van geïsoleerde auditieve bulla en capsule (mediale view). Sp, styliform proces. Schaal bar, 1 mm. (A - E), P31 muis. (F), P33 muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Dissectie van de Malleus. (A) ventrolaterale weergave van een recht auditieve bulla en capsule. De sulcus tympanicus (ST, gestippelde pijl) is de bevestigingsplaats van het trommelvlies. Het bot lateraal van de ST is onderdeel van het uitwendige oor en het bot mediaal van de ST vormt de bodem van het middenoor holte. A, anterior; P, posterior; D, dorsale; V, ventrale. (B) Uitzicht na verwijdering van de uitwendige gehoorgang het trommelvlies (TM) omvattende de pars flaccida (Pf) en pars tensa (Pt) onthullen. (C) Het verwijderen van delen van het trommelvlies bot (stippellijnen en #) in de buurt van de malleal processus brevis (MPB). m, hamer; mM, malleal manubrium. Pijl, luchtbel in het middenoor holte gezien door het trommelvlies. (D) Exposed hamer. Malleus hoofd is aangegeven. stippellijn geeft de articulaire oppervlak van de incus. (E) pees van de musculus tensor tympani (TT) bevestigd aan de hamer. (F) Het tensor tympani wordt getrokken wanneer de Malleus wordt opgeheven. *, Gespierde proces. (G) Tensor tympani wordt gesneden met behulp van een naald. (H) Drie gehoorbeentjes na verwijdering van het trommelvlies. De incudo-malleolaire gewricht is uit de kom. m, hamer; i, aambeeld; s, stijgbeugel; Go, goniale (gefuseerd met de hamer en trommelvlies ring, TR). Alle schaal bars, 0,5 mm. (A, H), P33 muizen. (B - G), P31 muis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Dissection van de Incus en Stapes. (A) en Incusstijgbeugel na verwijdering van de hamer. De stapediale slagader (SA) gaat door de stijgbeugel (s). Stippellijn geeft het articulaire oppervlak van de incus. Merk op dat de korte crus (ICB, crus breve) van de incus (i) wordt bepaald door de achterste ligament (niet getoond). Asterisk, gespierde proces van de stijgbeugel. (B) stapes na verwijdering van de incus. Naaldtip wordt gebruikt om de stapediale slagader (SA) gesneden. Pijl richting van de bloedstroming. Stippellijn geeft articulaire oppervlak van de stijgbeugel. (C) De stapediale slagader wordt uit de stijgbeugel. X is het afgesneden uiteinde van de stapediale slagader (SA). (D) De ovale venster (Ow, Fenestra ovalis of fenestra vestibuli) zichtbaar is na verwijdering van de stijgbeugel. Rw, ronde venster (fenestra rotonde of Fenestra cochleae). Schaalbalken 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze fotofiguur.
Figuur 4. oriënteren van de Auditieve Bulla en Capsule tijdens insluiten voor Longitudinaal (parasagittal, A - C) en horizontale (D - E) Snijden van de Malleus. (A - C) De hals en transversale lamina van de hamer evenwijdig geplaatst aan de bodem van inbedding schaal. (A) Zijaanzicht: micro-CT afbeelding om inbedding van de rechter hamer in de bulla (pseudocolored blauw) te tonen. De hamer en aambeeld zijn pseudocolored groen. Binnen de stippellijn, de gewenste snijvlak. Ononderbroken lijn, onderkant van het inbedden schotel. m, hamer; pijlpunten, dorsale kuif. M, mediale; L, laterale; D, dorsale; V, ventrale. (B) Bovenaanzicht: het Micro-CT. Merk op dat het voorste uiteinde van de bulla (styliform proces) verwijderd. i, incus. (C) Bovenaanzicht: microfoto (genomen met eenkleurfilter). AC, anterior (superior) halfronde gracht; Sf, subarcuate fossa; Sp, styliform proces. A, anterior; P, posterior; D, dorsale; V, ventrale. (D - F) De processus brevis van de malleus is geplaatst loodrecht op de bodem van inbedding schaal. (D) Zijaanzicht: afbeelding Micro-CT om inbedding van de juiste hamer te laten zien. Binnen de stippellijn, de gewenste snijvlak. Ononderbroken lijn, onderkant van het inbedden schotel. (E) Bovenaanzicht: het Micro-CT. mM, malleal manubrium. (F) Bovenaanzicht: microfoto (genomen met een kleurfilter). Schaalbalken, 1 mm. Micro-CT-beelden werden verkregen bij een voxel resolutie van 5 urn, zoals eerder beschreven 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
FIGUUR 5. Histologie. (A) H & E-kleuring. Longitudinale (parasagittal) sectie van de paraffine ingebedde recht Malleus (m) in de auditieve bulla (stippellijn) op P14. TM, trommelvlies. (B) calceïne bot labeling. Langsdoorsnede van de bevroren, ontkalkte linker hamer (m) in het auditieve bulla bij P21. Tegenkleuring, DAPI. (C) H & E-kleuring. Horizontale doorsnede van de bevroren, ontkalkte linker malleal processus brevis (MPB) in het auditieve bulla en capsule (5 weken oude muis). Co, slakkenhuis. Schaalbalken, 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Mediale View of gehoorbeentjes. (A) Recht gehoorbeentjes van P31 muis. A, anterior; P, posterior; D, dorsale; V, ventrale. Schaal bar, 1 mm. Malleus hoofd (Caput mallei, Capitulum mallei); hals (Collum mallei); lamina (transversale lamina); mM (Manubrium mallei); zwarte asterisk (gespierde proces van de hamer); MPa (Processus anterior, Processus gracilis); MPB (processus brevis); incus lichaam (Corpus incudis); ICB (Crus breve, korte crus, kort proces); ICL (Crus longum, lange crus, lang proces); IPL (Processus lenticularis, lenticular proces, Sylvian apophysis); stijgbeugel hoofd (Caput stapedis); witte asterisk (gespierde proces van de stijgbeugel); SCA (Crus anterius, anterior crus); SCP (Crus posterius, posterior crus); base (Basis stapedis, voetplaat); SOF (obturator foramen, intercrural foramen). (B) Rechter gehoorbeentjes van een 76-jarige menselijke vrouwelijke (Met dank van de afdeling Anatomie, Keio University School of Medicine). De gehoorbeentjes van P31 muis (rechtsonder) worden afgebeeld op dezelfde vergroting als die gebruikt voor menselijke gehoorbeentjes. Curved pijlen geven de hoek tussen de anatomische as en de manubrium (stippellijnen). Schaal bar, 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Hier presenteren we een methode nuttig voor de auditieve bulla en capsule postnatale muizen te isoleren. Vóór P12, weefsels kwetsbaar en kan worden beschadigd tijdens isolatie. Na P12, kan de auditieve bulla en de capsule gemakkelijk worden geïsoleerd van de omliggende weefsels. Opheldering van de bulla van het hoofd voor het snijden heeft verschillende voordelen. Ten eerste postnatale cavitatie en groei van de auditieve bulla komen het meest actief van P6 verder en volledig door 50 P14. De mesenchymale weefsel tussen het trommelvlies en cochleaire wand wordt vervangen door lucht door de cavitatie proces. De resulterende lucht in het middenoor holte contact tussen weefsels en vloeistoffen tijdens fixatie, ontkalken en inbedding belemmeren. Het is gemakkelijker om de lucht uit de geïsoleerde auditieve bulla verwijderen door het afsnijden van het voorste einde (styliform proces) in plaats van te proberen om dit te doen in de ongeïsoleerde bulla. Ten tweede, oriëntatie van de Malleus (en het trommelvlies) is niet verticaalin het hoofd. Daarom is het makkelijker om het gedeelte Malleus in de gewenste vlakken door het inbedden van de geïsoleerde auditieve bulla en capsule in een bepaalde richting.
Eenmaal geïsoleerd, auditieve bulla en capsules zijn geschikt voor talrijke analyses. Zo kan een hoge resolutie Röntgenstralen micro-CT bone microstructuur morfologie onthullen zoals osteogene capillairen in de hamer 14. De stereofluorescence ontleden microscoop is een krachtig hulpmiddel om structuren te visualiseren in de evaluatie van reporter muizen die fluorescerende eiwitten in het midden of binnenoor 33. Daarnaast zijn er diverse in vivo of ex vivo fluorescentie etikettering methoden en hele mount immunofluorescentie detectie kunnen worden ondernomen. Licht sheet fluorescentiemicroscopie is ook nuttig voor driedimensionale analyse 51. Hoewel hier niet beschreven, diverse anatomische structuren geassocieerd met de auditieve bulla en capsule zoals perifere zenuwen, bloedvaten enhet trommelvlies in het middenoor kan worden geëvalueerd met dit protocol.
Merk op dat paraffine snijden vereist ontkalking van het bot weefsels voor het inbedden en dus niet de analyse van de mineralisatie mogelijk te maken. Daarentegen kan de Kawamoto filmmethode 43 gebruikt om ingevroren secties bereiden worden uitgevoerd zonder ontkalking en is geschikt voor mineralisatie studies met in vivo been labeling technieken of specifieke kleuringen zoals alizarine kleuring. Cryo-snijden voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd volgens op basis van de muis leeftijd. Zo wordt een minder koele temperatuur in de cryostaatkamer aanbevolen voor oudere muis specimens schade aan onderdelen te minimaliseren.
In de muis, de juiste term voor de prominente semi-bolvormig uitsteeksel van de Malleus is "orbicular apophysis". Toch is de term "processus brevis" wordt algemeen gebruikt om de circulaire apophysis meer th aangeveneen twee decennia, met name onder muis ontwikkelingsstoornissen biologen 16,20,22-25. "Processus brevis" oorspronkelijk verwezen naar de laterale proces (processus lateralis), die verschilt van de kringspieren apophysis. Bij mensen een laterale proces lijkt op een klein conisch uitsteeksel vormt de algemene regel van bevestiging aan het trommelvlies, zich vanaf het manubrium (niet gezien in figuur 6B, mediaal aanzicht). In muizen, de laterale proces is een projectie van het manubrium aan het andere uiteinde naar umbo 48. De pars flaccida van het trommelvlies is boven het laterale proces van de hamer. Orbicular apophysis is niet duidelijk in het menselijk hamer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools/Equipment | |||
| Paper towel | Daio Paper Corporation | 703347 | can be purchased from other vendors |
| Glass Jar | Various | can be purchased from other vendors | |
| 14 cm surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 91400-14 | can be purchased from other vendors |
| Extra fine scissors-straight | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14084-08 | can be purchased from other vendors |
| Fine Forceps Angled 45° | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11063-07 | can be purchased from other vendors |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800N | for routine dissection |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ18 | for movies |
| Injection needle 27 G | TERUMO | NN-2719S | |
| Syringe (1 mL) | TERUMO | SS-01T | |
| Marking Pin | Various | ||
| Tube rotator RT-50 | TAITEC | 0000165-000 | can be purchased from other vendors |
| Cryostat | Leica | CM3050S | http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/ |
| TC-65 Tungsten blade | Leica | 14021626379 | for Kawamoto's firm method |
| Stainless containers | Leica | for Kawamoto's firm method | |
| Cryofilm type IIC | Leica | for Kawamoto's firm method | |
| Silane coated slide (New Silane II) | Muto Pure Chemicals | 511617 | can be purchased from other vendors |
| Cover glass | Matsunami | can be purchased from other vendors | |
| Tissue processor | Sakura Finetek | VIP-5 | can be purchased from other vendors |
| Tissue Embedding Console System | Sakura Finetek | Tissue-Tek TEC 5 | can be purchased from other vendors |
| Sliding microtome for paraffin | Yamato Kohki Industrial | REM-710 | can be purchased from other vendors |
| Path Blade+pro for hard tissue | Matsunami | PB3503C | for paraffin section |
| Micro-CT | RIGAKU | R_mCT2 | http://www.rigaku.com/en |
| Fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-9000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Isoflurane | Maruishi pharmaceutical Co. Ltd | ||
| NaCl | wako | 191-01665 | for PBS |
| KCl | wako | 285-14 | for PBS |
| Na2HPO4 12H2O | wako | 196-02835 | for PBS |
| KH2PO4 | wako | 287-21 | for PBS |
| Paraformaldehyde (PFA, EM Grade) | TAAB | P001 | |
| EDTA-2Na | wako | 15111-45 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Super Cryoembedding Medium | Leica | for Kawamoto's firm method | |
| Dry Ice | Various | for Kawamoto's firm method | |
| Hexane | wako | 080-03423 | for Kawamoto's firm method |
| Super Cryomouting Medium type R2 | Leica | for Kawamoto's firm method | |
| Paraffin | Sakura Finetek | 781001A0107 | |
| Histo-Clear | NDS | HS-200 | |
| Calcein | DOJINDO | 340-00433 | |
| Hematoxylin | wako | 131-09665 | |
| Eosin | wako | 051-06515 |
References
- Mallo, M. Formation of the middle ear: recent progress on the developmental and molecular mechanisms. Dev Biol. 231, 410-419 (2001).
- Manley, G. A. An evolutionary perspective on middle ears. Hear Res. 263, 3-8 (2010).
- Kanzaki, S., Ito, M., Takada, Y., Ogawa, K., Matsuo, K. Resorption of auditory ossicles and hearing loss in mice lacking osteoprotegerin. Bone. 39, 414-419 (2006).
- Kanzaki, S., Takada, Y., Ogawa, K., Matsuo, K. Bisphosphonate therapy ameliorates hearing loss in mice lacking osteoprotegerin. J Bone Miner Res. 24, 43-49 (2009).
- Cordas, E. A., et al. Thyroid hormone receptors control developmental maturation of the middle ear and the size of the ossicular bones. Endocrinology. 153, 1548-1560 (2012).
- Dong, W., Varavva, P., Olson, E. S. Sound transmission along the ossicular chain in common wild-type laboratory mice. Hear Res. 301, 27-34 (2013).
- Kanzaki, S., et al. Impaired vibration of auditory ossicles in osteopetrotic mice. Am J Pathol. 178, 1270-1278 (2011).
- Qin, Z., Wood, M., Rosowski, J. J. Measurement of conductive hearing loss in mice. Hear Res. , (2009).
- Klein, J. O. Is acute otitis media a treatable disease? N Engl J Med. 364, 168-169 (2011).
- Rosch, J. W., et al. A live-attenuated pneumococcal vaccine elicits CD4+ T-cell dependent class switching and provides serotype independent protection against acute otitis media. EMBO Mol Med. 6, 141-154 (2014).
- Li, X., et al. Otitis media in sperm-associated antigen 6 (Spag6)-deficient mice. PLoS One. 9, e112879 (2014).
- Rodríguez Vázquez, J. F., Mérida Velasco, J. R., Jiménez Collado, J. A study of the os goniale in man. Acta Anat (Basel). 142, 188-192 (1991).
- Tucker, A. S., Watson, R. P., Lettice, L. A., Yamada, G., Hill, R. E. Bapx1 regulates patterning in the middle ear: altered regulatory role in the transition from the proximal jaw during vertebrate evolution. Development. 131, 1235-1245 (2004).
- Matsuo, K., et al. Osteogenic capillaries orchestrate growth plate-independent ossification of the malleus. Development. 142, 3912-3920 (2015).
- Matsuo, K. Cross-talk among bone cells. Curr Opin Nephrol Hypertens. 18, 292-297 (2009).
- Rijli, F. M., et al. A homeotic transformation is generated in the rostral branchial region of the head by disruption of Hoxa-2, which acts as a selector gene. Cell. 75, 1333-1349 (1993).
- Mallo, M., Gridley, T. Development of the mammalian ear: coordinate regulation of formation of the tympanic ring and the external acoustic meatus. Development. 122, 173-179 (1996).
- O'Gorman, S. Second branchial arch lineages of the middle ear of wild-type and Hoxa2 mutant mice. Dev Dyn. 234, 124-131 (2005).
- Santagati, F., Minoux, M., Ren, S. Y., Rijli, F. M. Temporal requirement of Hoxa2 in cranial neural crest skeletal morphogenesis. Development. 132, 4927-4936 (2005).
- Satokata, I., Maas, R. Msx1 deficient mice exhibit cleft palate and abnormalities of craniofacial and tooth development. Nat Genet. 6, 348-356 (1994).
- Zhang, Z., et al. Malleal processus brevis is dispensable for normal hearing in mice. Dev Dyn. 227, 69-77 (2003).
- Houzelstein, D., Cohen, A., Buckingham, M. E., Robert, B. Insertional mutation of the mouse Msx1 homeobox gene by an nlacZ reporter gene. Mech Dev. 65, 123-133 (1997).
- Martin, J. F., Bradley, A., Olson, E. N. The paired-like homeo box gene MHox is required for early events of skeletogenesis in multiple lineages. Genes Dev. 9, 1237-1249 (1995).
- Yamada, G., et al. Targeted mutation of the murine goosecoid gene results in craniofacial defects and neonatal death. Development. 121, 3005-3012 (1995).
- Rivera-Pérez, J. A., Mallo, M., Gendron-Maguire, M., Gridley, T., Behringer, R. R. Goosecoid is not an essential component of the mouse gastrula organizer but is required for craniofacial and rib development. Development. 121, 3005-3012 (1995).
- Coré, N., et al. Tshz1 is required for axial skeleton, soft palate and middle ear development in mice. Dev Biol. 308, 407-420 (2007).
- Li, C., Scott, D. A., Hatch, E., Tian, X., Mansour, S. L. Dusp6 (Mkp3) is a negative feedback regulator of FGF-stimulated ERK signaling during mouse development. Development. 134, 167-176 (2007).
- Hwang, C. H., Wu, D. K. Noggin heterozygous mice: an animal model for congenital conductive hearing loss in humans. Hum Mol Genet. 17, 844-853 (2008).
- Calvert, J. A., et al. A missense mutation in Fgfr1 causes ear and skull defects in hush puppy mice. Mamm Genome. 22, 290-305 (2011).
- Carpinelli, M. R., et al. Anti-apoptotic gene Bcl2 is required for stapes development and hearing. Cell death dis. 3, e362 (2012).
- Chapman, S. C. Can you hear me now? Understanding vertebrate middle ear development. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1675-1692 (2011).
- Kitazawa, T., et al. Distinct effects of Hoxa2 overexpression in cranial neural crest populations reveal that the mammalian hyomandibular-ceratohyal boundary maps within the styloid process. Dev Biol. 402, 162-174 (2015).
- Wang, L., et al. Scleraxis is required for differentiation of the stapedius and tensor tympani tendons of the middle ear. J Assoc Res Otolaryngol. 12, 407-421 (2011).
- Amin, S., Tucker, A. S. Joint formation in the middle ear: lessons from the mouse and guinea pig. Dev Dyn. 235, 1326-1333 (2006).
- Amin, S., Matalova, E., Simpson, C., Yoshida, H., Tucker, A. S. Incudomalleal joint formation: the roles of apoptosis, migration and downregulation. BMC Dev Biol. 7, 134 (2007).
- Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of anatomy. 201, 15-29 (2002).
- Treuting, P. M., Dintzis, S. M. Ch. 22, Special senses: ear. Comparative Anatomy and Histology: A Mouse and Human Atlas. Treuting, P. M., Dintzis, S. M. 22, Academic Press. 419-432 (2012).
- Mallo, M., Schrewe, H., Martin, J. F., Olson, E. N., Ohnemus, S. Assembling a functional tympanic membrane: signals from the external acoustic meatus coordinate development of the malleal manubrium. Development. 127, 4127-4136 (2000).
- Anthwal, N., Joshi, L., Tucker, A. S. Evolution of the mammalian middle ear and jaw: adaptations and novel structures. Journal of anatomy. 222, 147-160 (2013).
- Takechi, M., Kuratani, S. History of studies on mammalian middle ear evolution: a comparative morphological and developmental biology perspective. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 314, 417-433 (2010).
- Henson, O. W. Jr Ch. 3, Comparative Anatomy of the Middle Ear. Handbook of Sensory Physiology. Keidel, W. D., Neff, W. D. Vol. 1, Auditory System. Anatomy, Physiology (Ear), Springer. Berlin Heidelberg. 39-110 (1974).
- Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. , Humana Press. (2003).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
- Kampen, P. N. V. Gegenbaurs Morphologiesches Jahrbuch. 34, W. Engelmann. 321-722 (1905).
- Lee, J. H., Park, K., Kang, T. C., Choung, Y. H. Three-dimensional anatomy of the temporal bone in normal mice. Anat Histol Embryol. 38, 311-315 (2009).
- Fleischer, G. Evolutionary principles of the mammalian middle ear. Adv Anat Embryol Cell Biol. 55, 3-70 (1978).
- Lavender, D., Taraskin, S. N., Mason, M. J. Mass distribution and rotational inertia of "microtype" and "freely mobile" middle ear ossicles in rodents. Hear Res. 282, 97-107 (2011).
- Mason, M. J. Of mice, moles and guinea pigs: functional morphology of the middle ear in living mammals. Hear Res. 301, 4-18 (2013).
- Willi, U. B., Ferrazzini, M. A., Huber, A. M. The incudo-malleolar joint and sound transmission losses. Hear Res. 174, 32-44 (2002).
- Richter, C. A., et al. Defects in middle ear cavitation cause conductive hearing loss in the Tcof1 mutant mouse. Hum Mol Genet. 19, 1551-1560 (2010).
- Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61, 382-395 (2013).
