Summary

Cryosectioning af sammenhængende regioner en enkelt mus Skeletal Muscle for genekspression og histologiske analyser

Published: December 12, 2016
doi:

Summary

Konsekutive cryo-sektioner er samlet for at muliggøre histologiske applikationer og berigelse af RNA til genekspression målinger med tilstødende regioner fra en enkelt mus skeletmuskel. Høj kvalitet RNA fås fra 20 – 30 mg puljede kryosnit og målinger direkte sammenlignes på tværs af applikationer.

Abstract

Med denne metode bliver efterfølgende kryosektioner opsamlet for at give begge mikroskopi ansøgninger om væv histologi og berigelse af RNA til genekspression bruger tilstødende regioner fra en enkelt mus skeletmuskel. Typisk er det udfordrende at opnå tilstrækkelig homogenisering af små skeletmuskulaturen prøver, fordi buffer mængder kan være for lav til effektiv slibning applikationer, dog uden tilstrækkelig mekanisk afbrydelse, den tætte væv arkitektur muskel grænser penetration af buffer reagenser, i sidste ende forårsager lavt RNA udbytte. Ved at følge den protokol rapporteret her, er 30 um snit opsamlet og samlet tillade cryosectioning og efterfølgende nål homogenisering til mekanisk forstyrre musklen, forøgelse af overfladearealet eksponeret i buffer penetration. De primære begrænsninger af teknikken er, at den kræver en kryostat, og det er forholdsvis lille produktion. Imidlertid kan høj kvalitet RNA opnås fra små prøver af puljet muscle kryosektioner, hvilket gør denne metode i mange forskellige skeletmuskulatur og andre væv. Desuden muliggør denne teknik matchede analyser (fx væv histopatologi og genekspression) fra tilstødende områder af en enkelt skeletmuskulatur, så målingerne kan sammenlignes direkte på tværs af programmer for at reducere eksperimentel usikkerhed og for at reducere nødvendige replikative dyreforsøg at købe en lille væv til flere programmer.

Introduction

Målet med denne teknik er at foretage flere eksperimentelle analyser af forskellige modaliteter, såsom histologi og genekspression, tilgængelige fra en enkelt lille skeletmuskulatur kilde væv. Mikroskopi applikationer er de mest følsomme til at prøve konserveringsmetoder, som skal styres omhyggeligt for at begrænse dannelsen af ​​iskrystal artefakter under kryopræservering. Således er metodeudvikling baseret på tibialis anterior (TA) muskel frosne delvis dækket med indlejring harpiks i en -140 ° C flydende nitrogen-afkølet 2-methylbutan bad som udgangsmateriale til både immunfluorescensmikroskopi og genekspression analyser.

Behovet for at bruge den samme kilde materiale til diverse tekniske tilgange er især vigtigt for intramuskulær injektion-baserede eksperimenter, hvor venstre og højre muskler repræsenterer forskellige betingelser, en eksperimentel og en kontrol. For eksempel i muskelregenerationen undersøgelser, en muscle injiceres med et toksin til at forårsage omfattende vævsskade, mens den kontralaterale muskel tjener som et vehikel-injiceret kontrol 1. Tilsvarende genterapi undersøgelser for muskelsygdomme begynder typisk med validering af genterapivektoren ved intramuskulær injektion for at blive sammenlignet med tom vektor, ubeslægtet vektor eller vehikelkontrol på den kontralaterale side 2. Derfor er det ikke muligt at kilde hver TA muscle til et andet program.

Fælles strategier til at håndtere dette problem er: i) at bruge en anden muskel gruppe for hver ansøgning, ii) at bruge ekstra mus, eller iii) at afskære et stykke af musklen for hvert program. Men væsentlige forskelle mellem muskelgrupper gør det vanskeligt at sammenligne data fra forskellige applikationer, og yderligere dyr øger regning og er dårligt berettiget, hvis der findes andre alternativer. Opdeling musklen efter dissektion til kilde forskellige applikationer er den bedste løsning in mange tilfælde. Imidlertid musklen stykker er ofte for lille til at bruge pulverisering under flydende nitrogen eller mekaniske formaling teknikker til homogenisering 2-5. Som muskel er en yderst strukturel væv pakket med ekstracellulære matrix og kontraktile proteiner, utilstrækkelig mekanisk homogenisering fører til et lavt udbytte af efterfølgende DNA, RNA eller protein. Metoden beskrevet her tillader små mængder af væv fra én kilde muskel til brug i flere programmer, og inddragelsen af ​​cryosectioning og nål findeling forbedrer mekanisk homogenisering for bedre RNA udbytte.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af University of Georgia Institutional Animal Care og brug Udvalg under anvendelse dyr protokol A2013 07-016 (Beedle). 1. Kryopræservering af ikke-fikserede Skeletal Muscle Forberedelse Skær kork i små firkanter (ca. 1 cm x 1 cm) med et barberblad, skrive på proppen med en fin spids markør, der er resistent over for 2-methylbutan at identificere kilden mus og muskler, og gøre en meget overfladisk snit (ca. 1 mm) over den øverste overflade. Indsæt en plas…

Representative Results

Muskel kryosektion RNA er høj kvalitet og giver tilstrækkelig udbytte til de fleste applikationer Analyser af seksten skeletmuskulatur RNA præparater er vist i tabel 1 under anvendelse af 19,4 til 41 mg af poolede tibialis anterior (TA) muscle fra 8 kontrolmus. Både venstre (L) og højre (R) TA muskler er udarbejdet i regenerering eksperimenter med muskler indsamlet 3 dage efter langsgående …

Discussion

For at opnå de bedste resultater med denne metode, holde indlejring harpiks begrænset til den nederste tredjedel eller halvdelen af ​​musklen under vævet kryopræservering fordi overskydende harpiks vil bremse indsamlingen af ​​de samlede kryosnit og kan øge indlejring harpiks forurening i RNA isolation. Også, omhyggelig opmærksomhed under nålen homogenisering er vigtigt at maksimere udbyttet og minimere sandsynligheden for tilstopning af nålen. Protokollen kan ændres ved hjælp af en Luer-Lok sprøjte …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre and Junna Luan provided technical assistance. Research reported in this publication was supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under award number AR065077. The content is solely the responsibility of the author and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

Materials

Cork VWR Scientific 23420-708 Cut into small squares with a sharp blade.
Plastic coverslip Fisher Scientific 12-547 Used to orient the muscle during freezing.
Low temperature thermometer VWR Scientific 89370-158
2-methylbutane Sigma M32631-4L Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet.
Embedding resin: "cryomatrix" Thermo Fisher Scientific 6769006 Other embedding resins can be substituted for cryomatrix.
Cryostat Thermo Fisher Scientific microm HM550 with disposable blade carrier Any working cryostat should be sufficient for the protocol.
Disposable cryostat blade Thermo Fisher Scientific 3052835 Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used.
RNAse decontamination solution: "RNase Zap" Thermo Fisher Scientific AM9780
Analytical balance Mettler Toledo XS64
Paint brush Daler Rowney 214900920 Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies.
Razor blade VWR Scientific 55411-050
Microscope slide VWR Scientific 48311600
RNA organic extraction reagent: TRIzol Thermo Fisher Scientific 15596026 Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle.
18 gauge needle VWR Scientific BD305185
22 gauge needle VWR Scientific BD305155
26 gauge needle VWR Scientific BD305115 Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol.
1 mL syringe VWR Scientific BD309659 For very high value samples, a luer-lok syringe is recommended (e.g. VWR BD309628).
1-bromo-3-chloropentane (BCP) Sigma B9673
For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol Decon Laboratories, Inc. +M18027161M Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water. 
For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water Thermo Fisher Scientific AM9922 Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water.
RNA purification kit: PureLink RNA minikit Thermo Fisher Scientific 12183018A Final steps of RNA preparation.
DNase/Rnase-free water  Gibco 10977 DEPC-treated water can also be used.
Spectrophotometer: Nanodrop 2000 Thermo Fisher Scientific NanoDrop 2000
Dnase I Thermo Fisher Scientific AM2222 Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications.
Hydrophobic pen Thermo Fisher Scientific 8899
Dulbecco's PBS Gibco 14190 PBS for immunofluorescence protocol.
Donkey serum Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc 017-000-121 Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence.  Normal goat serum can also be used.
eMHC antibody University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank F1.652
Collagen VI antibody Fitzgerald Industries #70R-CR009x
Donkey anti-rabbit AlexaFluor488 Thermo Fisher Scientific A21206
Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546 Thermo Fisher Scientific A21123
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Thermo Fisher Scientific D1306
Aqueous mounting media: Permafluor Thermo Fisher Scientific TA-030-FM Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties.
Glass coverslip VWR Scientific 16004-314 Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl
Image analysis software: ImageProExpress Media Cybernetics, Inc. Image-Pro Express, or more advanced products Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process.  E.g. ImageProPremier.  
Merge and map section images: Photoshop Adobe Photoshop
Cardiotoxin Sigma C9659 Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated.
reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system Thermo Fisher Scientific 18080051 Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used.
Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system Promega M8298 Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead.
SYBR green Thermo Fisher Scientific S7585 For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers.
ROX: SuperROX, 15 mM BioResearch Technologies, Inc. Novato CA SR-1000-10 SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments
Real-time PCR Applied Biosystems 7900HT

References

  1. Foltz, S. J., et al. Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice. PLoS One. 11 (1), 0147049 (2016).
  2. Bartoli, M., et al. Noninvasive monitoring of therapeutic gene transfer in animal models of muscular dystrophies. Gene Ther. 13, 20-28 (2006).
  3. Ip, W. T., Huggins, C. E., Pepe, S., Delbridge, L. M. Evaluating RNA preparation options for archived myocardial biopsies. Heart Lung Circ. 20 (5), 329-331 (2011).
  4. Beedle, A. M., et al. Mouse fukutin deletion impairs dystroglycan processing and recapitulates muscular dystrophy. J. Clin. Invest. 122 (9), 3330-3342 (2012).
  5. Foltz, S. J., et al. Four-week rapamycin treatment improves muscular dystrophy in a fukutin-deficient mouse model of dystroglycanopathy. Skeletal Muscle. 6, 20 (2016).
  6. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat. Protoc. 10, 1612-1624 (2015).
  7. Rump, L. V., Asamoah, B., Gonzalez-Escalona, N. Comparison of commercial RNA extraction kits for preparation of DNA-free total RNA from Salmonella cells. BMC Res. Notes. 3, 211 (2010).
  8. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).
  9. Valdez, M. R., Richardson, J. A., Klein, W. H., Olson, E. N. Failure of Myf5 to support myogenic differentiation without myogenin, MyoD, and MRF4. Dev Biol. 219 (2), 287-298 (2000).
  10. Pavlath, G. K., Dominov, J. A., Kegley, K. M., Miller, J. B. Regeneration of transgenic skeletal muscles with altered timing of expression of the basic helix-loop-helix muscle regulatory factor MRF4. Am. J. Pathol. 162 (5), 1685-1691 (2003).
  11. Chomczynski, P., Mackey, K. Substitution of chloroform by bromo-chloropropane in the single-step method of RNA isolation. Anal. Biochem. 225 (1), 163-164 (1995).
  12. Lee, J. T. Y., Cheung, K. M. C., Leung, V. Y. L. Extraction of RNA from tough tissues with high proteoglycan content by cryosection, second phase separation and high salt precipitation. J. Biol. Methods. 2 (2), 20 (2015).
  13. Guo, D., Catchpoole, D. R. Isolation of intact RNA following cryosections of archived frozen tissue. BioTechniques. 34, 48-50 (2003).
  14. Goodpaster, T., Randolph-Habecker, J. A flexible mouse-on-mouse immunohistochemical staining technique adaptable to biotin-free reagents, immunofluorescence, and multiple antibody staining. J. Histochem. Cytochem. 62 (3), 197-204 (2014).
  15. Ikezawa, M., Minami, N., Takahashi, M., Goto, Y., Miike, T., Nonaka, I. Dystrophin gene analysis of 130 patients with Duchenne muscular dystrophy with a special reference to muscle mRNA analysis. Brain Dev. 20 (3), 165-168 (1998).
  16. Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Anal. Biochem. 474, 25-27 (2015).
  17. Espina, V., Heiby, M., Pieroban, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Rev Mol Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).

Play Video

Cite This Article
Beedle, A. M. Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses. J. Vis. Exp. (118), e55058, doi:10.3791/55058 (2016).

View Video