Summary
Opeenvolgende cryo-secties verzameld histologische toepassingen en verrijking van RNA voor genexpressie metingen met aangrenzende gebieden van een enkele muis skeletspier schakelen. Hoogwaardige RNA wordt verkregen 20-30 mg samengevoegd vriescoupes en metingen worden direct vergeleken verschillende applicaties.
Abstract
Bij deze methode worden opeenvolgende cryosecties verzameld zowel microscopie toepassingen voor weefsel histologie en verrijking van RNA voor genexpressie met behulp aangrenzende gebieden van een enkele muis skeletspier schakelen. Doorgaans is het een uitdaging om voldoende homogenisering van kleine skeletspieren monsters te bereiken omdat buffer volumes te laag voor een efficiënte slijpen toepassingen kunnen zijn, maar zonder voldoende mechanische verstoring, het dichte weefsel architectuur van de spier grenzen penetratie van buffer reagentia, uiteindelijk veroorzakend lage RNA opbrengst. Door het volgen van het protocol hier gemeld, zijn 30 micrometer secties verzameld en samengevoegd waardoor cryosectioning en de daaropvolgende naald homogenisatie mechanisch verstoren van de spieren, het verhogen van de oppervlakte blootgesteld buffer penetratie. De primaire beperkingen van de techniek zijn dat het een cryostaat vereist, en het is relatief lage doorzet. Echter, hoge kwaliteit RNA verkregen uit kleine monsters van samengevoegde muscle vriescoupes, waardoor deze methode toegankelijk voor veel verschillende skeletspieren en andere weefsels. Bovendien maakt deze techniek gepaard analyses (bijvoorbeeld weefsel histopathologie en genexpressie) van aangrenzende gebieden van een skeletspier zodat metingen direct vergelijkbaar tussen toepassingen experimentele onzekerheid te verminderen en replicatieve dierproeven noodzakelijk reduceren tot een kleine weefsel voor bron meerdere toepassingen.
Introduction
Het doel van deze techniek is om meerdere experimentele analyses maken van verschillende modaliteiten, zoals histologie en genexpressie, vanuit een single skeletspier bronweefsel. Microscopie toepassingen zijn het gevoeligst voor conserveringstechnieken, die zorgvuldig moet worden geregeld om de vorming van ijskristallen artefacten tijdens cryopreservatie beperken proeven. Aldus wordt methodeontwikkeling gebaseerd op de tibialis anterior (TA) spier bevroren gedeeltelijk bedekt met inbedding hars in een -140 ° C vloeibare stikstof gekoeld 2-methylbutaan bad bronmateriaal zowel immunofluorescentie microscopie en genexpressie analyses.
De noodzaak om dezelfde grondstof voor diverse technische benaderingen is bijzonder belangrijk voor intramusculaire injectie gebaseerde experimenten waarbij de linker en rechter spieren vertegenwoordigen verschillende omstandigheden, een experimenteel en bediend. Bijvoorbeeld, bij spierregeneratie studies, een muSCLE wordt ingespoten met een toxine om wijdverspreide weefselbeschadiging veroorzaken terwijl de contralaterale spier fungeert als een vehikel geïnjecteerd control 1. Evenzo gentherapie studies spieraandoeningen typisch beginnen validatie van de gentherapie vector die door intramusculaire injectie worden vergeleken met lege vector, verbonden vector of het voertuig aan de contralaterale zijde 2. Daarom is het niet mogelijk om elke TA spier bron naar een andere toepassing.
Gemeenschappelijke strategieën om deze kwestie zijn: i) een andere spiergroep gebruikt voor elke toepassing, ii) aanvullende muizen gebruiken, of iii) een stuk van de spier voor elke toepassing af te snijden. Echter aanzienlijke verschillen tussen spiergroepen bemoeilijken vergelijking van de gegevens van afzonderlijke toepassingen en meer dieren te verhogen en kosten zijn slecht onderbouwd als alternatieven bestaan. Het verdelen van de spier na de sectie voor verschillende toepassingen bron is de beste optie in veel gevallen. De spier stukken vaak te klein om verpulvering gebruikt onder vloeibare stikstof of mechanisch malen technieken voor homogenisatie 2-5. Spier- een zeer structureel weefsel vol extracellulaire matrix en contractiele eiwitten, onvoldoende mechanische homogenisering leidt tot een lage opbrengst van latere DNA, RNA of eiwit. De werkwijze die hier worden beschreven kunnen kleine hoeveelheden weefsel uit een hand spier geschikt voor verschillende toepassingen, en het opnemen van cryosectioning en naald trituratie verbetert mechanische homogenisering betere RNA opbrengst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden door de Universiteit van Georgia Institutional Animal Care en gebruik goedgekeurd in het kader van het gebruik van dieren protocol A2013 07-016 (Beedle).
1. cryopreservatie Unfixed Skeletal Muscle
- Voorbereiding
- Snijd cork in kleine vierkanten (ongeveer 1 cm x 1 cm) met een scheermesje, schrijft de kurk met een fijne punt marker die resistent zijn tegen 2-methylbutaan de bron muis en spier identificeren, en een zeer ondiepe snede (ca. 1 mm) over het bovenoppervlak. Plaats een plastic dekglaasje in de cut te gebruiken voor het richten van het weefsel. Herhaal dit tot een kurk is klaar voor elk weefsel worden ingevroren.
- Het verkrijgen van vloeibare stikstof, 2-methylbutaan, inbedding hars, lage temperatuur thermometer, kurken, dissectie instrumenten, en de studie muis.
LET OP: Vloeibare stikstof is een gecomprimeerd gas dat kan ontploffen bij verwarming. Draag een laboratoriumjas, lage temperatuur handschoenen, en de bescherming van het gezicht bij het hanteren van vloeibaar niTrogen; Contact met de huid of ogen kan brandwonden of bevriezing veroorzaken. 2-methylbutaan is een brandbare, giftige, gezondheid en milieu gevaar. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, handschoenen, veiligheidsbril), opent u de voorraad houder in een zuurkast, de overdracht van de kleine hoeveelheid die nodig is voor het invriezen van (meestal 200 tot 400 ml) in een aparte container die stevig kan worden gesloten, en inademen te voorkomen . - Euthanaseren muizen met een goedgekeurde methode van euthanasie onder verdoving. In het kort, plaatst u de muis in een inhalatie kamer met 2,5% isofluraan in zuurstof uit een isofluraan vaporizer, wachten tot 20 seconden na de muis niet meer beweegt om te controleren op een pedaal reflex. Als het pedaal reflex negatief is, euthanaseren de studie muis door cervicale dislocatie 6.
OPMERKING: Euthanasie methoden goedkeuring door de institutionele ethische commissie nodig. - Verwijder het vel bovenop de distale achterbeen en snijd de distale voorste pezen net boven de enkel met fine-point dissectie schaar. Pak de distale pezen met fijn pincet en voorzichtig omhoog te trekken en in de richting van de knie tijdens het snijden laterale fascia om de spieren los te maken. Trek de spier loodrecht vanaf de knie en maak een final cut op de TA spier 7 accijnzen.
OPMERKING: De TA spier wordt hier als voorbeeld, maar elke muis skeletspieren en het hart kan worden vervangen door de TA in dit protocol eventueel experimentele doelen van de gebruiker. De enige beperking is dat een weefsel klein genoeg om snel cryopreservatie gehele diepte bereikt moet zijn; maximaal weefselgrootte van 1 cm x 1 cm aanbevolen. - Herhaal aan de andere been, en ontleden van alle andere weefsels moeten worden verzameld. Voeren dissectie zo snel mogelijk weefselafbraak voor cryopreservatie beperken.
- Orient elke spier voor dwarsprofielen op zijn pre-gelabeld kurk. Staan de spier loodrecht op de kurk met de distale pees aanraken van de kurk en de bovenkant van de spier exteindigend weg, rechtop gehouden door de dekglaasje.
- Cryopreserve alle weefsels voor histologisch onderzoek zo spoedig mogelijk na sectie, bij voorkeur binnen 5 minuten, maar zeker niet meer dan 15 minuten verstreken tijd sinds euthanization van de dierlijke bron.
- cryopreservatie
- Beginnen koelen cryopreservatie bad vijf minuten voor het einde van de dissectie. Pour 2-methylbutaan in een open metalen beker tot een diepte van ongeveer 3 cm. Vloeibaar stikstof in een geïsoleerde container tot een diepte van 2-4 cm. Stel het bekerglas van 2-methylbutaan in de vloeibare stikstof; het stikstofatoom begint te koken. Vermijd stikstof spatten in de 2-methylbutaan beker.
LET OP: Bereid bevriezen bad in een zuurkast of een goed geventileerde ruimte. - Plaats een lage temperatuur thermometer in het 2-methylbutaan om de temperatuur en roer regelmatig met een vork gelijkmatige koeling. Blijf roeren en koel tot 2-methylbutane bereikt -140 ° C, het toevoegen van nieuwe vloeibare stikstof om de buitenste bad nodig.
LET OP: -140 ° C is de optimale temperatuur te ijskristal artefacten in dwarsgestreepte spieren een minimum te beperken; andere weefsels kunnen het best worden ingevroren bij verschillende temperaturen (bijvoorbeeld hersenen, -90 ° C). - Toepassen inbedding hars alleen de onderste 35-50% van de spier waar het de kurk en geeft de kurk vallen in de 2-methylbutaan bij -140 ° C. Snel herhalen voor maximaal 8 weefsels per bevriezen batch. Roer gedurende 30 sec schrapen over de bodem van de beker zodat weefsels niet bevriezen in de stollende 2-methylbutaan.
- Gebruik een vork, schuimspaan of grote tang om elk weefsel kurk te trekken van de 2-methylbutaan. Snel verwijderen van het dekglaasje, dep het overtollige 2-methylbutaan in de beker, en dan vallen de weefsel kurk in de buitenste stikstof bad. Herhaal dit voor alle resterende kurken in de beker.
- Doorvoermonsters in vloeibare stikstof of droog ijseen -80 ° C vriezer voor opslag.
- Als er weefsels voor cryopreservatie blijven, herhaalt u de stappen 1.2.3 tot en met 1.2.4. Voeg extra 2-methylbutaan aan de beker of vloeibare stikstof om de buitenste bad nodig en opnieuw afkoelen tot -140 ° C. Gooi gebruikte 2-methylbutaan als gevaarlijk afval.
- Beginnen koelen cryopreservatie bad vijf minuten voor het einde van de dissectie. Pour 2-methylbutaan in een open metalen beker tot een diepte van ongeveer 3 cm. Vloeibaar stikstof in een geïsoleerde container tot een diepte van 2-4 cm. Stel het bekerglas van 2-methylbutaan in de vloeibare stikstof; het stikstofatoom begint te koken. Vermijd stikstof spatten in de 2-methylbutaan beker.
2. Verzamel Weefsel secties voor histologie en RNA Applications
- Voorbereiding.
- Pre-wegen een DNase / RNase-free geautoclaveerde buis op een analytische balans. Vervolgens verplaatsen in de cryostaat kamer om te koelen. Herhaal dit tot buizen zijn klaar voor alle samengevoegde cryosectie monsters te verzamelen.
- Voor skeletspieren snijden, bevestigen dat de cryostaat kamer temperatuur van -21 tot -22 ° C door de interne thermostaat. Overbrengen van containers met weefsels in de kamer te snijden en laat de container (s) de temperatuur ervan op de cryostaat temperatuur gedurende ten minste 15 min voorafgaand.
- Plaats een nieuwe disposable cryostaat blade. Als alternatief, verwijder de bestaande lemmet, nevel met RNase decontaminatie oplossing, spoelen met DDH 2 O, en plaats in de cryostaat om af te koelen. Spuit een schone tissue met 70% ethanol en veeg het mes en het mes vastklemmen platform.
- Spuit een schone tissue met een RNase decontaminatie oplossing en veeg cryostaat borstels. Spuit een tissue met DDH 2 O, veeg de borstels weer en zet ze in de cryostaat kamer op een schone ondergrond.
LET OP: De cryostaat mes moeten worden gedekt door het mes guard wanneer niet in gebruik. Ook RNase decontaminatie oplossing toxisch en bevriest een neerslag in de koude cryostaat kamer te vormen. Daarom voorzichtig behandelen en te voorkomen dat het gebruik ervan in de cryostaat kamer.
- Spuit een schone tissue met een RNase decontaminatie oplossing en veeg cryostaat borstels. Spuit een tissue met DDH 2 O, veeg de borstels weer en zet ze in de cryostaat kamer op een schone ondergrond.
- Binnen de cryostaat kamer, plaats een dubbeltje-en kleinbedrijf druppel (ongeveer 300 pl) van het inbedden van hars op een warme specimen chuck, stel dan een tissue kurk op de top van de hars, druk, en vervolgens de boorkop in de freezing rail of op een supervriessysteem element indien beschikbaar.
- Na het inbedden hars stolt (wit), voeg extra verankering hars bovenop de kurk, rond de onderste 35% van het weefsel en op de warmteafvoerblok in de inbedding hars snel bevriezen het weefsel beter stabiliseren. Wacht 5 minuten voor snijden zodat de hars volledig te harden.
- Controleer of de proefstukhouder is in zijn meest teruggetrokken stand, het verst van het blad. Plaats het weefsel specimen boorkop in de objectklem.
- Cryosectie preparaat.
- Draai het mes-drager, stel de vrije hoek van het blad tot 10 ° (of een hoek die geschikt is voor het blad gebruikte drager), en draai. Laat het rempedaal en draai het handwiel om de spieren in de richting van het mes te verlagen. Schat de kleinste afstand tussen het weefsel en het mes, verplaats het weefsel uit de buurt van het mes en schakel de rem handwiel.
- Maak de hoogteverstelling lever en beweeg de mesbladhouder voor- of achteruit, respectievelijk als het einde van het weefsel meer dan ongeveer 2 mm van het mes of het mes raakt het weefsel. Draai en het weefsel te verlagen opnieuw om afstand te controleren van het mes. Herhaal aanpassingen totdat het zaagblad 1-2 mm van het uiteinde van het weefsel door visuele schatting.
- Verlaag het weefsel in de richting van het mes en te beoordelen weefsel hoek voor dwarsdoorsneden. Vergrendelen het handwiel en de objectklem hendel los. Duw de proefstukhouder links of rechts totdat de horizontale oriëntatie van het weefsel loodrecht op het blad.
- Duw de objectklem omhoog of omlaag om de "y" richting aanpassen, zodat weefselcoupes loodrecht op de lengteas van de spier is. Draai de objectklem hendel.
- Gebruik de cursus en fijn naar voren toevoer naar het model vooruit totdat het net raakt het mes. Als op zoek naar delen van een bepaald weefsel diepte, reset de som van de sectie diktes tot nul (bovenkant van het weefsel).
- Stel de cryostaat aan de trim-functie met een sectie dikte bij 30 micrometer. Knip en gooi secties totdat de vooraf gekozen diepte voor weefsel collectie is bereikt (bijvoorbeeld 400 pm van boven).
- Verzamel vriescoupes voor RNA-extractie.
- Open de tube voor het verzamelen van secties en plaats het in de buurt van het blad carrier. Gebruik een pre-gekoelde, schone borstel te halen elke sectie als het van het mes wordt gesneden en de overdracht van de cryosectie in de buis. Herhaal dit tot de samengevoegde gedeelten weegt 30 mg of tissue gewenste diepte is bereikt.
LET OP: Voor een volwassen muis tibialis anterior, de inzameling van weefsel diepte van ongeveer 400 tot 4000 um levert doorgaans 25 - 40 mg. Met behulp van metalen tang om delen over te dragen aan de collectie buis wordt niet aanbevolen als de secties neiging vast te houden en te klonteren op het metaaloppervlak. - Als inbedding hars rondom de spier cryosectie, blokkeer je de handrem en het gebruik van een scheermesje omafscheren kleine stukjes hars totdat er slechts een dunne laag rond de bovenkant van de spier. Zaag altijd hars met het mes schuin weg van de spier.
LET OP: Een dun laagje hars inbedden niet wezenlijk afbreuk doen aan de downstream-RNA voorbereiding. Als dikkere inbedding hars aanwezig is, gebruik borstels om uit de buurt van de spier te plagen voordat de cryosectie in de collectie buis. - Als alternatief, zwembad secties op het blad vervoerder en de overdracht in bulk aan de collectie buis.
Opmerking: Deze werkwijze is vaak langzamer en secties vaker plakken en samenklonteren, waardoor de efficiëntie van de naald homogenisatie in latere stappen kunnen verminderen. - Plaats snel de gepoolde cryosectie buis in een analytische balans en opnemen buis gewicht. Onmiddellijk terug te keren de buis naar de koude cryostaat kamer te vinden in hoofdstuk temperatuur in de buurt van -20 ° C te houden. Bereken het gewicht van de samengevoegde gedeelten.
NB: Als RNA-isolatie zal plaatsvinden op adVerschillende onderdelen dag, slaan de samengevoegde cryosectie buis bij -80 ° C tot gebruik.
- Open de tube voor het verzamelen van secties en plaats het in de buurt van het blad carrier. Gebruik een pre-gekoelde, schone borstel te halen elke sectie als het van het mes wordt gesneden en de overdracht van de cryosectie in de buis. Herhaal dit tot de samengevoegde gedeelten weegt 30 mg of tissue gewenste diepte is bereikt.
- Verzamel vriescoupes voor histologie.
- Druk op de snijdikte knop voor fijn snijden en het gebruik pijlen om de cryostaat coupedikte ingesteld op 7 pm (of andere geschikte sectie dikte, meestal 6 tot 10 pm).
OPMERKING: Dunnere gedeelten (6-10 um) worden gebruikt voor histologische toepassingen zodat kleurstoffen kan de diepte van de weefselsectie penetreren. Dunne gedeelten kunnen uit elke diepte tijdens het cryosectioning, maar diepere gedeelten hebben de voorkeur omdat het invoegen hars, die toeneemt met weefseldiepte, geen afbreuk histologische kleuring. - Knip en gooi 4-7 secties om een consistente, zelfs weefsel oppervlak te bekomen. Noteer het weefsel diepte.
- Snijd een sectie en richt deze op het oppervlak van de bladdrager. Pak de sectie door een warme (kamertemperatuur) microscoopglaasje snel en zachtjes aanrakenhet gedeelte van de bladdrager. Zet de dia tot kamertemperatuur. Ga door tot het gewenste aantal dia's wordt verkregen. Noteer het uiteindelijke weefsel diepte.
LET OP: Het verzamelen van een tweede (dubbele) sectie voor elk weefsel wordt aanbevolen. - Met het snijden voltooid is, schakel de handwiel rem, de terugkeer van de specimen aan de achterzijde meest positie, en verwijder het weefsel boorkop. Gebruik de cryostaat warmte element aan het inbedden van hars die het weefsel kurk op het monster boorkop smelten. Verwijder weefsel kurk, droog met weefsel, en keer terug naar de opslag.
- Herhaal vanaf stap 2.1.2 voor elke resterende weefsel. Sta dia drogen 20 minuten na het laatste weefsel wordt aangebracht. Gebruik vervolgens dia's voor histologische of immunofluorescentiekleuring of bevriezen bij -80 ° C in een dia doos totdat het nodig is.
- Druk op de snijdikte knop voor fijn snijden en het gebruik pijlen om de cryostaat coupedikte ingesteld op 7 pm (of andere geschikte sectie dikte, meestal 6 tot 10 pm).
3. RNA isolatie uit samengevoegde Weefsel secties
- RNA-extractie
- Move buis (s) van gepoolde cryosecties om ijs. Onmiddellijk voeg eenorganische RNA-extractie reagens in een verhouding van ongeveer 1 ml per 50 mg reagens cryosectie gewicht, kenmerkend 600 gl per buis.
LET OP: RNA-isolatie reagentia zijn giftig, bijtend, en irritant. Volg de instructies van de fabrikant voor het veilig hanteren. - Met behulp van een 1 ml spuit met een 18 gauge naald, trek de RNA extractievloeistof en spoel de wanden van de buis totdat alle weefsel in de oplossing gesuspendeerd. Probeer om luchtbellen te minimaliseren tijdens de naald homogenisering.
- Gebruik de punt van de naald tot puree en verspreiden elke samengeklonterd vriescoupes en stukken vast te houden aan de buiswand. Fijnstampen te homogeniseren door op en neer het monster door de naald voor vijf slagen, en dan terug het monster naar ijs. Herhaal beide stappen drie tot vijf keer, of zo vaak als nodig is om alle klonten verstoren en passeert het monster gemakkelijk door de naald.
- Verwijder de 18 gauge naald en te vervangen door een 22 gauge naald. zorgvuldig triturate het monster voor vijf slagen, en dan terug het monster naar ijs. Herhaal de tritureren 3-4 keer om een zeer fijn gedispergeerde weefselhomogenaat bereiken.
LET OP: Als weefsel deeltjes beginnen om de naald te blokkeren bij het opstellen van het monster, verdrijven alle monster uit de spuit en terug te schakelen naar de 18 gauge naald voor verdere homogenisering. Een extra stap trituratie met een 25 of 26 gauge naald kan worden toegevoegd om maximale opbrengst. Echter, kan de naald verstopt raken, dus er is een risico van het monster morsen. - Beweeg het monster van ijs tot kamertemperatuur. Incubeer gedurende 5 min moleculaire complexen verstoren.
- In een zuurkast, voeg 0,1 ml 1-broom-3-chloorpentaan (BCP) per 1 ml van RNA isolatie reagens (stap 3.1.1), typisch 60 pi per buis. Schud de buis krachtig met de hand gedurende 15 seconden (niet vortex). Incubeer het monster bij kamertemperatuur gedurende 2 tot 3 minuten. Vervolgens gecentrifugeerd gedurende 15 min bij 12.000 xg en 4 ° C.
VOORZICHTIGHEID: - Verzamel zorgvuldig de bovenste waterfase (kleurloos) bevattende RNA en overgebracht naar een schone buis. Voeg een gelijk volume van 70% ethanol (in DEPC water) en vortex te mengen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende maximaal 10 minuten.
LET OP: de middelste interfase en lagere fenol BCP fasen kan worden verwerkt voor genomische DNA en eiwitten, respectievelijk, volgens de instructies van de fabrikant of verzameld in een fenol BCP gevaarlijke afval container voor de juiste verwerking.
- Move buis (s) van gepoolde cryosecties om ijs. Onmiddellijk voeg eenorganische RNA-extractie reagens in een verhouding van ongeveer 1 ml per 50 mg reagens cryosectie gewicht, kenmerkend 600 gl per buis.
- RNA zuivering.
- Volg de instructies van de fabrikant voor het monster binden, wassen en elutie met kleine variaties 8. Bijvoorbeeld:
- Plaats een hoeveelheid van DNase / RNase-free water in een 37 ° C bad of incubator voor een pre-warm voor stap 3.2.4.
- Voeg het RNA monster van 3.1.8 hierboven aan een zuiveringskolom en centrifugeer het monster gedurende 15 secbij 12.000 xg bij kamertemperatuur. Giet de stroom door terug in dezelfde kolom en opnieuw centrifuge. Herhaal dit een extra tijd om te maximaliseren RNA-bindende, en vervolgens de definitieve doorstroming ontdoen.
- Voer wasstappen volgens de instructies van de fabrikant 8. Toepassen 700 pl wasbuffer (geen ethanol) aan de kolom, centrifugeren gedurende 15 sec bij 12.000 xg en de stroom door verwijderen.
- Voeg 500 ul wasbuffer (met ethanol) aan de kolom, centrifugeren gedurende 15 sec bij 12.000 xg en de stroom door verwijderen. Herhaal deze stap een keer.
- Draai de lege kolom gedurende 1 min bij 12.000 xg om het membraan te drogen.
- Breng de spin-kolom om een schone RNase-, DNase-vrij buis. Voeg 40 ul voorverwarmde DNase / RNase-vrij water (van 3.2.1) tot het midden van de kolom membraan. Bij kamertemperatuur incuberen gedurende 2 minuten en centrifugeer gedurende 2 min bij 12.000 x g.
OPMERKING: De 40 pl elutievolume ongeveer 1,3 gl per mg origineleweefsel voor 30 mg samengevoegde vriescoupes. Stel het elutievolume afhankelijk van verschillende uitgangsposities weefsel gewichten, maar niet tot minder dan 32 pi. Een tweede elutie, toepassing van ongeveer 0,7 gl per mg oorspronkelijk weefsel, kunnen worden toegevoegd aan totale RNA opbrengst te verhogen. - Analyseer de RNA (kolom elutie) voor concentratie en zuiverheid een spectrofotometer, elektroforese en / of bioanalyzer. Bewaar het RNA bij -80 ° C totdat het nodig is voor verdere toepassingen, zoals reverse transcriptie voor kwantitatieve PCR 4.
LET OP: Een DNase behandeling wordt aanbevolen voor het gebruik van het RNA in downstream-toepassingen. Deze behandeling kan worden uitgevoerd op een aantal RNA zuiveringskolommen voor de wasstap op dit specifieke punt volgende kolom elutie, of met een deel van het RNA als de eerste stap in een stroomafwaartse toepassing. Het RNA moet stabiel zijn gedurende enkele jaren.
4. histologische analyse door Immunofluorescentie Staining Muscle Weefsel secties
- Simple immunofluorescentie protocol.
- Gebruik een hydrofobe pen tot de groep van secties cirkel op elke dia. Voorzichtig laten vallen PBS in het omcirkelde gebied (ongeveer 80 ul voor een klein oppervlak tot 500 ul voor een groot oppervlak), zorg dat u de weefsels niet aan te raken. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
LET OP: Als het gebruiken van bevroren glijbanen, verwijderen dia's van -80 ° C vriezer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 tot 30 minuten te ontdooien en droog, ga dan als hierboven. Ten minste twee dia's zijn nodig: een experimentele dia worden geïncubeerd in primaire en secundaire antilichaam; en een regelschuif die primaire antilichaam is uitgesloten, de "secundaire only" control. - Tip de dia giet PBS. Voeg 5% ezel serum in PBS (blokkerende oplossing) aan het omcirkelde gebied; wees voorzichtig om ervoor te zorgen dat de spier secties niet uitdrogen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten (of tot enkele uren in een vochtige kamer).
- Bereid primaire antilichaam oplossing voor regeneratie van de spieren te analyseren. Meng blokkeeroplossing Met eMHC antilichaam (1:40) en een ColVI antilichaam (1: 1000). Bereid ongeveer 150 pl, 300 ul of 500 ul voor kleine, middelgrote of grote glijbaan gebieden, respectievelijk. Vortex gedurende 5 seconden en centrifugeer gedurende 2 min bij 15.000 xg om eventuele neerslag pellet.
- Voor experimentele slides, tip de glijbaan af te gieten blokkeren oplossing en voeg vervolgens primaire antilichaam-oplossing van 4.1.3. Voor de secundaire controle glijbaan, tip de glijbaan af te gieten blokkeren oplossing en voeg dan verse blokkerende oplossing (geen antilichaam). Incubeer objectglaasjes in een vochtige kamer bij 4 ° C overnacht.
OPMERKING: Bij pipetteren antilichaamoplossingen op objectglaasjes, altijd aan vloeistof vanuit de bovenzijde van de primaire antilichaamoplossing buis Sluit geen neerslag op de bodem van de buis niet verstoren. - Tip glijdt om de oplossing af te gieten. Voeg PBS druppelsgewijs aan het omcirkelde gebied van elke dia om te wassen, tip te gietenuit en voeg meer PBS en incubeer gedurende 3 tot 5 minuten. Herhaal dit voor een totaal van drie wasbeurten.
NB: De wastijd is heel flexibel en kan worden verlengd tot 20 min indien gewenst. In het algemeen, het aantal veranderingen oplossing is belangrijker dan de tijd. - Bereid secundaire antilichaamoplossing voor objectglaasjes (inclusief de secundaire regelschuif) met een 1: 500 verdunning van rode en groene fluorofoor gekoppelde secundaire antilichamen tegen muizen IgG1 (eMHC) en konijnen IgG (ColVI) en 1 detecteren: 10.000 verdunning van DAPI nucleaire vlek.
- Bijvoorbeeld, meng 1 ui DAPI met 9 pl DDH 2 O een 1:10 verdunning van DAPI maken. Vervolgens wordt voor een 500 pl eindvolume, voeg 1,0 pl anti-muis IgG1-rood + 1,0 pl anti-konijn IgG-groen + 0,5 ul 01:10 DAPI tot 447,5 pl blokkeeroplossing. Vortex mengen en centrifugeer gedurende 2 min bij 15.000 xg om eventuele neerslag pellet.
LET OP: In het ideale geval alle secundaire antilichamen moet zijn van dezelfde gastheersoort.
- Bijvoorbeeld, meng 1 ui DAPI met 9 pl DDH 2 O een 1:10 verdunning van DAPI maken. Vervolgens wordt voor een 500 pl eindvolume, voeg 1,0 pl anti-muis IgG1-rood + 1,0 pl anti-konijn IgG-groen + 0,5 ul 01:10 DAPI tot 447,5 pl blokkeeroplossing. Vortex mengen en centrifugeer gedurende 2 min bij 15.000 xg om eventuele neerslag pellet.
- Tip de dia's af te gieten de laatste PBS wassen. Voeg secundaire antilichaamoplossing alle weefsels dekken. Bedek de objectglaasjes ter bescherming tegen licht en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
LET OP: Alle secundaire antilichamen moeten worden gevalideerd om een minimale kruisreactiviteit met andere soorten in de etikettering experimenten dual hebben. - Was de dia's zoals beschreven in 4.1.5. Na de laatste wasbeurt, tip de glijbaan te gieten van de PBS en zet de schuif op een tissue. Voeg 3-4 druppels van een waterige afdekmiddel langs één zijde.
- Stel de rand van een glazen dekglaasje alleen de buitenrand van de fixeermiddelen. Middels een tang, langzaam de dekglaasje naar de weefsels dan het dekglaasje los en voorzichtig tikken op zijn plaats. Tenslotte voorzichtig op elke hoek van het dekglaasje te stabiliseren.
- Bescherm de dia tegen licht en bewaar bij 4 ° C tot gebruik.
LET OP: Voor de lange termijn opslag, breng dan een dun laagje nagellak langs de rand van the dekglaasje om te voorkomen dat de dia uit te drogen.
- Gebruik een hydrofobe pen tot de groep van secties cirkel op elke dia. Voorzichtig laten vallen PBS in het omcirkelde gebied (ongeveer 80 ul voor een klein oppervlak tot 500 ul voor een groot oppervlak), zorg dat u de weefsels niet aan te raken. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Histologisch onderzoek.
- Het imago van de dia's met behulp van een epifluorescerende of confocale microscoop met de nodige filters om eMHC (rood) te detecteren; ColVI (groen); en DAPI-gekleurde kernen (blauw), meestal met behulp van een 20X doelstelling van 1,5.
- Controleer of het fluorescerende signaal van experimentele dia's verschilt van de tweede controle dia om de specificiteit van de eMHC en ColVI detectie 4 demonstreren.
OPMERKING: eMHC positieve regenererende vezels dienen van ongeveer 2-7 dagen getoond na een spierletsel en regelbaar in muizen met spierdystrofie. Collageen VI aanwezig is in de extracellulaire matrix omringende spierweefsel, bloedvaten en zenuwen en in de grotere bindweefsel bundels van peri- en epimysium. DAPI nucleaire vlek is het nuttig om spiervezels met centrale kernen versus perifere kernen aangeeft fiber regeneratie, en de aanwezigheid van i te identificerennfiltrating cellen. Necrotic of gewonden vezels kunnen zwak kleuren met de muis IgG secundair antilichaam door detectie van endogeen IgG dat de vezels dringt door beschadigde spieren membranen. - Om regeneratie kwantificeren, neem overlapping microscoop foto's met elkaar fluorescerende filter over het gehele beeld. Voeg de eMHC, ColVI en DAPI beelden voor elke locatie en lijn de foto's om een kaart van de gehele sectie 1,5 reconstrueren.
- Met behulp van analyse software, tel het aantal eMHC positieve vezels en het totale aantal vezels recente regeneratie (100 * (# eMHC + vezels / # totaal vezels)) te berekenen. Ook, tel het aantal centraal kernhoudende vezels uit van de totale vezels regeneratie te meten over een langere periode (100 * (# CN + vezels / # totaal vezels)) 1,5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cryosectie Muscle RNA ligt hoog in kwaliteit en voldoende rendement voor de meeste toepassingen
Analyses van zestien skeletspier RNA preparaten worden weergegeven in Tabel 1 gebruik 19,4-41 mg samengevoegde tibialis anterior (TA) spierweefsel 8 controlemuizen. Zowel het linker (L) en rechter (R) TA spieren werden bereid regeneratie proeven met spieren verzameld 3 dagen na longitudinale intramusculaire injectie van 25 pl van zoutoplossing of 10 uM cardiotoxine om spierbeschadiging met werkwijzen veroorzaken eerder gemeld 1. Zoals getoond in Tabel 1, de A260 / 280 verhoudingen spier- cryosectie RNA meestal dicht bij 2 of meer van deze representatieve monsters. Als "zuivere" RNA wordt geacht A260 hebben / 280 van 2,0 en A260 / 280 van 1,8 tot 2,2, de zuiverheid van de cryosectie RNA monsters uitstekend 9. Totaal RNA herstel was typisch over 10 ug per monster met opbrengsten van meer dan 0,18 tot 1 ug totaal RNA per mg uitgangsweefsel, voldoende materiaal voor de meeste verdere toepassingen. Met name, RNA-concentratie, totaal RNA geëxtraheerd en RNA opbrengst per mg uitgangsweefsel TA spieren 3 dagen na toxine schade was aanzienlijk hoger dan van zoutoplossing geïnjecteerd TA. Dit suggereert dat er verbeterde homogenisatie bij musculaire structuur wordt verstoord door uitgebreide schade en / of dat er een toename van gentranscriptie en / of RNA stabiliteit in 3 dagen regenererende spieren. De persistentie van RNA kwaliteit werd bepaald door eenvoudige 1x TAE / 1,5% agarosegel elektroforese van 1 pl spieren na cryosectie RNA monsters bij -20 ° C gedurende 18 maanden werden bewaard. Prominente 18S en 28S rRNA bands zijn nog steeds zichtbaar in monsters aantonen van een hoog RNA kwaliteit, zelfs onder suboptimale omstandigheden opslag (figuur 1A).
Muscle cryosectie RNAondersteunt downstream-toepassingen
Eén microgram van RNA per cryosectie samengevoegde monster werd met DNase en reverse getranscribeerd van oligo dT primers. Na RNase behandeling, het totale volume van de reverse getranscribeerd cDNA was 30 pi. Eenvoudige niet-kwantitatieve PCR met overmaat amplificatie werd uitgevoerd om de levensvatbaarheid van de cDNA bevestigen. Myogene regulerende factor 4 (Mrf4), een transcriptiefactor met opgereguleerd spier differentiatie, werd geamplificeerd met behulp eerder gemeld muis primers, sense 5'-CTACATTGAGCGTCTACAGGACC en antisense 5'-CTGAAGACTGCTGGAGGCTG 10, van 2 pl matrijs onder toepassing van standaard PCR. Er was robuust, specifieke amplificatie van het 234 bp Mrf4 fragment uit zowel links als rechts TA cDNA monsters, maar niet RT (RNA inbegrepen, maar geen reverse transcriptase), RT DDH 2 O (reverse transcriptie zonder RNA template) of DDH 2 O PCR-controles (Figuur 1B).Dezelfde monsters werden in drievoud Mrf4 en mOaz1 referentiesignaal 4 kwantificering middels relatieve amplificatie en passieve fluorescentie referentie op een real-time PCR systeem. Mrf4 expressie werd gebracht op 0,097 maal de toxine-geïnjecteerde recht TA vergeleken met de saline geïnjecteerde links TA, berekend volgens de methode ΔΔCt 4. Dit is vergelijkbaar met eerdere verslagen lage expressie Mrf4 3 dagen na toxine letsel door een verlies van volwassen spiervezels 11. Om de consistentie van cryosectie RNA voor kwantitatieve PCR vergelijken, werden Ct-waarden vergeleken voor de mOaz1 referentie-gen. Van zes monsters, werd mOaz1 transcript gedetecteerd met een gemiddelde Ct van 17,242 ± 1,483 sd, terwijl de gemiddelde Ct was 36,332 ± 3,61 sd in RT-controlemonsters (n = 4). De strakke groepering van mOaz1 Ct signalen over monsters suggereert dat RNA geïsoleerd uit TA spier vriescoupes presteert zoals verwacht in downstream-RNA-expressie analyses.
Voorbeelden van indirecte immunofluorescentie kleuring van 7 urn tibialis anterior gedeeltes uit hetzelfde nest controlemuizen 3 dagen na toxine-injectie aangetoond regenererende vezels detecteren (Figuur 2). Beide gedeelten werden uit spieren minder dan 150 urn van het gebied wordt gebruikt voor RNA-analyse op een diepte van 4,5 tot 4,6 mm vanaf het proximale oppervlak spier. Embryonale myosine zware keten (eMHC, red) detecteert regenererende vezels, collageen VI (ColVI, groen) schetst de spiervezels, en DAPI vlekken kernen blauw, volgens het protocol van 4 regio's met geconcentreerde nucleaire infiltraat (blue signaal) aan te geven plaatsen van toxine letsel , zoals blijkt door activering van eMHC positieve nieuw regenererende spiercellen. Hele sectie kaarten zoals dit voorbeeld worden gebruikt voor het kwantificeren van wedergeboorte door het berekenen van het aandeel van embryonic myosine zware keten tot expressie vezels (rood, onlangs geregenereerd) of centraal kernen vezels zoals eerder gemeld 1. Met name is er verrassend weinig schade in de TA spier in figuur 2A. Hoewel er verschillen tussen de injecties, typisch toxine injecties invloed veel groter deel van de spier compartiment 1, zie figuur 2B. Daarom is deze histologische analyse blijkt dat het toxine schade in figuur 2A was minimaal en een belangrijk instrument voor genexpressiedata interpreteren van de aangrenzende spier cryosectie RNA monster. Als de hele spier had voor RNA-preparaat werd gebruikt door middel van standaard slijpen methoden, zou de onverwacht kleine blessure gedeelte van dit monster is een uitschieter die stroomafwaarts analyses zou scheef te maken. Integendeel, het koppelen histologische kwantificering van dezelfde spier maakt de directe meting van de omvang van de schade van de aangrenzende secties. Dit maakt het gebruik van inclusie / uitsluitingscriteria te waarborgen dat alle monsters die stroomafwaarts RNA analyses voldoen minimaal schadedrempel of normalisatie van RNA analyses volgens schade grootte.
Figuur 1: Quality Assessment van RNA uit samengevoegde Muscle Weefsel secties. A) 18S en 28S ribosomale RNA-banden prominent in RNA uit samengevoegde spier vriescoupes 18 maanden na de RNA bereiding. B) Niet-kwantitatieve PCR voor Mrf4 na reverse transcriptie. 200 en 300 bp banden van een DNA ladder aangegeven. RT, reverse transcriptie reactie met RNA-matrijs, maar geen reverse transcriptase. RT-H 2 O, reverse transcriptie met DDH 2 O, zonder RNA matrijs. H 2 O, template- PCR controle met DDH 2 O. Bij deze experimenten toxine werd geïnjecteerd in de juiste tibialis anterior (RTA) en zoutoplossing was geïnjecteerd in de linker (LTA). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbeeld histologische Maps for Muscle Regeneration Studies. A, B) Samengesteld kaarten van enkele tibialis anterior spier secties 3 dagen na toxine injectie toont voorbeelden van slecht (A) en normaal (B) toxine-geïnduceerde verwonding. White boxed regio's van elke sectie kaart worden weergegeven als inzet beelden voor hogere vergroting te bekijken, Red, embryonale myosine zware keten; groen, collageen VI extracellulaire matrix eiwit; blauw, DAPI nucleaire vlek. Schaal bar, 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Vertegenwoordiger RNA opbrengst en zuiverheid Metingen van samengevoegde Muscle vriescoupes. Zestien tibialis anterior (TA) spieren werden doorgesneden en samengevoegd cryosectie monsters werden bewerkt voor RNA. Gezuiverd RNA (1 ui) werd geanalyseerd met een nanospectrophotometer. Column statistieken werden uitgevoerd in een spreadsheet, werden groep vergelijkingen uitgevoerd met behulp van statistische software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beste resultaten met deze methode te realiseren, houdt inbedding hars beperkt tot het onderste deel of helft van de spier weefsel tijdens cryopreservatie dat buitensporige hars het verzamelen van de samengevoegde cryosecties zal vertragen en kunnen verhogen inbedding hars verontreiniging in de RNA-isolatie. Ook zorgvuldige aandacht tijdens homogenisatie naald is belangrijk om de opbrengst te maximaliseren en de kans op verstopping van de naald te minimaliseren. Het protocol kan worden gemodificeerd door een Luer-Lok spuit te beschermen tegen verlies van monster of de naald verstopt raakt en vereist hoge druk om de verstopping te verwijderen. Een extra naald homogenisatiestap met een 25 gauge naald en 26 kunnen ook worden toegevoegd aan een fijnere weefselsuspensie verder verbeterd RNA oogst produceren. Terwijl chloroform kunnen vervangen BCP, wordt dit niet aanbevolen als BCP minder toxisch en resulteert in lagere genomisch DNA verontreiniging in de waterfase tijdens organische extractie van RNA 12. toenemendede sectie dikte samengevoegd vriescoupes meer dan 30 micrometer wordt ook afgeraden als homogenisering minder efficiënt zal zijn.
Als RNA opbrengst onder de gewenste niveaus kunnen verschillende strategieën worden gebruikt voor herstel zoals vergroten: i) het verhogen milligram hoeveelheid uitgangsmateriaal mogelijke opbrengst te verhogen; ii) vermindering van de snijdikte onderstaande 30 urn mechanische homogenisering van het weefsel te verbeteren; iii) verhoging van de duur van monster en incubatie naald homogenisatie in de organische extractie reagens mechanische en chemische weefselverstoring verbeteren; en iv) indien het weefsel brokken blijven uitvoeren van een tweede extractie stap met strengere naald homogenisering. Als alternatief kunnen er weefselspecifieke overwegingen, zoals extra stappen fasescheiding en precipitatie voor monsters met een hoog gehalte proteoglycan 13. Tijdens de RNA kolomzuivering, kan een grotere elutievolume gebruiken en uitvoeren een tweede elutie maximize totaal RNA terugwinning, maar ten koste van RNA-concentratie. Een post-column alcohol precipitatie kan worden gebruikt om het RNA te concentreren als lage concentratie een zorg met deze wijziging. Als RNA degradatie is een probleem, waardoor tijd cryopreservatie tijdens dissectie, strengere reinigen cryostaat oppervlakken en instrumenten RNase blootstelling te minimaliseren, het uitvoeren van de naald homogenisatiestap in een koude kamer, toevoeging van een RNase remmer reagens om de cryosecties 14 en frequente vervanging van RNase vrije oplossingen kunnen elk kunnen voorkomen of blootstelling aan RNases minimum te beperken en klievingsactiviteit. Het is mogelijk dat kortstondig het weefsel baden in een RNase remmer reagens na sectie, maar voor cryopreservatie, kan monster afbraak verder te verminderen. Er moet echter voorlopige experimenten worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat een dergelijke behandeling niet ijskristallen of andere artefacten doet verhogen tijdens cryopreservatie.
terwijl embryonalemyosine zware keten / collageen VI indirecte immunofluorescentie wordt hier als voorbeeld voor spier analyse van de schade, dunne vriescoupes aangebracht op microscoopglaasjes uit deze experimenten kan worden gebruikt voor elke relevante histologische vlek die op bevroren secties kunnen worden uitgevoerd, waaronder immunofluorescentie technieken met post -fixation en hematoxyline / eosine kleuring. Inderdaad, kunnen aanpassingen van de eenvoudige immunofluorescentie protocol die hier nodig. Bijvoorbeeld, anti-muis secundaire antilichamen gebruikt om een muis primair antilichaam (bijvoorbeeld eMHC) gedetecteerd kan ook detecteren endogene muis immunoglobulinen in het doel weefsel. Dergelijke endogene antilichamen typisch ophopen in beschadigde of necrotische spiervezels in gewonde of dystrofische spier veroorzaken achtergrond immunofluorescentie kleuring. Een secundaire regelschuif (met primair antilichaam weggelaten) moet altijd worden onderzocht om de specificiteit van de kleuring te beoordelen. Als endogene antilichaam achtergrond problematisch is, moet pre-block stappen zijntoegevoegd aan het protocol te voorkomen of opsporen van endogene muisimmunoglobulinen 15 minimaliseren.
De belangrijkste beperkingen van de werkwijze is dat het een cryostaat vereist en het is tijdrovend, waardoor het relatief lage productie maakt. Bijvoorbeeld, een deskundige in de techniek in staat om te verwerken 16 spieren samengevoegd cryosecties en objectglaasjes (8 dia's met dubbele lagen van alle 16 weefsels) in ongeveer 9-10 uur. Voor beginners tot cryosectioning, kon inzameling van gepoolde cryosecties 2-4 monsters redelijk onder de knie na de training cryostaat en één of twee oefensessies, in plaats daarvan, het verkrijgen van de kwaliteit vriescoupes voor histologie duurde meer ervaring. Daarom kan apparatuur, tijd en training factoren deze methode niet zo effectief voor zachtere weefsels die goed gehomogeniseerd met een handmatige stamper homogenisator kan maken.
In vergelijking met niet-cryostaat homogenisering methoden, dwarsgestreepte spieren RNA bereidingdit is gemeld uit spierbiopten met RNA opbrengst van 0,05-0,7 ug RNA pre mg spier 16 en, recenter 0,27-1,08 ug RNA per mg spier 17. Daarom is de hier beschreven techniek biedt RNA opbrengst zo goed als of beter dan niet-cryostaat methoden met het extra voordeel dat gepaarde histologische analyses uit een aaneengesloten gebied van hetzelfde monster. Met name een eerdere studie gebruikten ook cryosectioning voor homogenisatie in wervel weefsel en vergelijkbare gevonden dat cryosectioning weefsel verbeterde homogenisering efficiëntie voor de RNA-isolatie 13. Bij deze techniek werd getest bij runderen skeletspier monsters, de gemiddelde opbrengst per RNA monstervoorbereiding was 4,09 ± 0,36 ug, aan de onderkant van het normale bereik hier 13 beschreven. Lasermicrodissectie is een ander alternatief voor het verzamelen van weefsel voor RNA-extractie uit een cryosectie. Laser capture is superieur aan deze gepoolde cryosectie werkwijzedat het de specificiteit slechts een gewenste subset van cellen uit de sectie verzamelt en kan worden uitgevoerd op een weefselsectie tot 50 18 urn dik. Toch kan verzamelen van een micro-ontleed monster moeilijk en geschikte apparatuur is niet op grote schaal beschikbaar, waardoor gepoolde cryosectie homogenisering meer toegankelijk voor onderzoekers. Bij beide methoden beschikbaar voorkeur aan een weefsel subregio analyseren aanvraag hoeft slechts kleine RNA hoeveelheden bevoordelen laser capture microdissectie terwijl gepoold cryosectie homogenisering is het beste als deelgebied analyse minder belangrijk en grotere hoeveelheden RNA nodig.
Hoewel histologische en RNA isolatiemethoden zijn de focus hier is de gepoolde cryosectie werkwijze eenvoudig toepasbaar in eiwitlysaten bereiden op Western blot analyses of enzymactiviteit metingen. Zo werden samengevoegd vriescoupes van het hart opgelost voor Western blot analysen 4 eennd samengevoegd vriescoupes van de TA werden gehomogeniseerd succinate dehydrogenase activiteit assays van mitochondriale functie 5. Als alternatief kan genomisch DNA en eiwitfracties te scheiden van andere fasen in de organische extractie na RNA-isolatie, die de potentie om genomische DNA, eiwit, RNA en histologische metingen afkomstig van een weefsel na één cryostaat sessie.
Kortom, het belangrijkste voordeel van deze methode is om experimentele flexibiliteit doordat meerdere benaderingen waarbij verschillende monstervoorbereiding uit één weefsel. De werkwijze is het meest geschikt voor spieren en andere weefsels met uitgebreide intra- of extracellulaire structuur die de efficiëntie van stamper gebaseerde weefsel homogenisatie vermindert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cork | VWR Scientific | 23420-708 | Cut into small squares with a sharp blade. |
| Plastic coverslip | Fisher Scientific | 12-547 | Used to orient the muscle during freezing. |
| Low temperature thermometer | VWR Scientific | 89370-158 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631-4L | Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet. |
| Embedding resin: "cryomatrix" | Thermo Fisher Scientific | 6769006 | Other embedding resins can be substituted for cryomatrix. |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific | microm HM550 with disposable blade carrier | Any working cryostat should be sufficient for the protocol. |
| Disposable cryostat blade | Thermo Fisher Scientific | 3052835 | Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used. |
| RNAse decontamination solution: "RNase Zap" | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | XS64 | |
| Paint brush | Daler Rowney | 214900920 | Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies. |
| Razor blade | VWR Scientific | 55411-050 | |
| Microscope slide | VWR Scientific | 48311600 | |
| RNA organic extraction reagent: TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle. |
| 18 gauge needle | VWR Scientific | BD305185 | |
| 22 gauge needle | VWR Scientific | BD305155 | |
| 26 gauge needle | VWR Scientific | BD305115 | Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol. |
| 1 ml syringe | VWR Scientific | BD309659 | For very high value samples, a Luer-Lok syringe is recommended (e.g., VWR BD309628). |
| 1-bromo-3-chloropentane (BCP) | Sigma | B9673 | |
| For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol | Decon Laboratories, Inc. | +M18027161M | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water. |
| For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9922 | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water. |
| RNA purification kit: PureLink RNA minikit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | Final steps of RNA preparation. |
| DNase/Rnase-free water | Gibco | 10977 | DEPC-treated water can also be used. |
| Spectrophotometer: Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | AM2222 | Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications. |
| Hydrophobic pen | Thermo Fisher Scientific | 8899 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco | 14190 | PBS for immunofluorescence protocol. |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc | 017-000-121 | Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence. Normal goat serum can also be used. |
| eMHC antibody | University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank | F1.652 | |
| Collagen VI antibody | Fitzgerald Industries | #70R-CR009x | |
| Donkey anti-rabbit AlexaFluor488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546 | Thermo Fisher Scientific | A21123 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Aqueous mounting media: Permafluor | Thermo Fisher Scientific | TA-030-FM | Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties. |
| Glass coverslip | VWR Scientific | 16004-314 | Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl |
| Image analysis software: ImageProExpress | Media Cybernetics, Inc. | Image-Pro Express, or more advanced products | Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process; e.g., ImageProPremier. |
| Merge and map section images: Photoshop | Adobe | Photoshop | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9659 | Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated. |
| reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used. |
| Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system | Promega | M8298 | Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead. |
| SYBR green | Thermo Fisher Scientific | S7585 | For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers. |
| ROX: SuperROX, 15 mM | BioResearch Technologies, Inc. Novato CA | SR-1000-10 | SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments |
| Real-time PCR | Applied Biosystems | 7900HT |
References
- Foltz, S. J., et al. Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice. PLoS One. 11 (1), 0147049 (2016).
- Bartoli, M., et al. Noninvasive monitoring of therapeutic gene transfer in animal models of muscular dystrophies. Gene Ther. 13, 20-28 (2006).
- Ip, W. T., Huggins, C. E., Pepe, S., Delbridge, L. M. Evaluating RNA preparation options for archived myocardial biopsies. Heart Lung Circ. 20 (5), 329-331 (2011).
- Beedle, A. M., et al. Mouse fukutin deletion impairs dystroglycan processing and recapitulates muscular dystrophy. J. Clin. Invest. 122 (9), 3330-3342 (2012).
- Foltz, S. J., et al. Four-week rapamycin treatment improves muscular dystrophy in a fukutin-deficient mouse model of dystroglycanopathy. Skeletal Muscle. 6, 20 (2016).
- AVMA Guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). Available from: www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx 1-102 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat. Protoc. 10, 1612-1624 (2015).
- Rump, L. V., Asamoah, B., Gonzalez-Escalona, N. Comparison of commercial RNA extraction kits for preparation of DNA-free total RNA from Salmonella cells. BMC Res. Notes. 3, 211 (2010).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).
- Valdez, M. R., Richardson, J. A., Klein, W. H., Olson, E. N. Failure of Myf5 to support myogenic differentiation without myogenin, MyoD, and MRF4. Dev Biol. 219 (2), 287-298 (2000).
- Pavlath, G. K., Dominov, J. A., Kegley, K. M., Miller, J. B. Regeneration of transgenic skeletal muscles with altered timing of expression of the basic helix-loop-helix muscle regulatory factor MRF4. Am. J. Pathol. 162 (5), 1685-1691 (2003).
- Chomczynski, P., Mackey, K. Substitution of chloroform by bromo-chloropropane in the single-step method of RNA isolation. Anal. Biochem. 225 (1), 163-164 (1995).
- Lee, J. T. Y., Cheung, K. M. C., Leung, V. Y. L. Extraction of RNA from tough tissues with high proteoglycan content by cryosection, second phase separation and high salt precipitation. J. Biol. Methods. 2 (2), 20 (2015).
- Guo, D., Catchpoole, D. R. Isolation of intact RNA following cryosections of archived frozen tissue. BioTechniques. 34, 48-50 (2003).
- Goodpaster, T., Randolph-Habecker, J. A flexible mouse-on-mouse immunohistochemical staining technique adaptable to biotin-free reagents, immunofluorescence, and multiple antibody staining. J. Histochem. Cytochem. 62 (3), 197-204 (2014).
- Ikezawa, M., Minami, N., Takahashi, M., Goto, Y., Miike, T., Nonaka, I. Dystrophin gene analysis of 130 patients with Duchenne muscular dystrophy with a special reference to muscle mRNA analysis. Brain Dev. 20 (3), 165-168 (1998).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Anal. Biochem. 474, 25-27 (2015).
- Espina, V., Heiby, M., Pieroban, M., Liotta, L. A.
