Aufeinanderfolgende Kryo-Abschnitte werden gesammelt, um histologische Anwendungen und Anreicherung von RNA für Genexpressionsmessungen mit benachbarten Regionen aus einer einzigen Maus Skelettmuskel ermöglichen. 30 mg gepoolt Kryoabschnitte und Messungen werden direkt im Vergleich über mehrere Anwendungen hinweg - Qualitativ hochwertige RNA wird aus 20 erhalten.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Kryoschneiden von benachbarten Regionen eines einzelnen Maus Skelettmuskel für die Genexpression und histologische Analysen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mit diesem Verfahren werden aufeinanderfolgende Kryoschnitte gesammelt beide Mikroskopieanwendungen für Gewebe Histologie und Anreicherung von RNA für die Genexpression zu ermöglichen, benachbarte Bereiche von einer einzigen Maus Skelettmuskel verwendet. Typischerweise wird es ausreichende Homogenisierung von kleinen Skelettmuskelproben zu erreichen, herausfordernd, weil Puffervolumen für die effiziente Schleifanwendungen zu gering sein kann, aber ohne ausreichende mechanische Störung, die dichte Gewebearchitektur der Muskelgrenzen Eindringen von Pufferreagenzien, was letztlich geringe RNA-Ausbeute. Durch Befolgen des Protokolls hier berichtet wird, 30 & mgr; m Abschnitte werden gesammelt und vereinigt Kryoschneiden und anschließende Homogenisierung Nadel ermöglicht, um mechanisch den Muskel zu stören, die Erhöhung der Oberfläche für die Puffer Eindringen ausgesetzt. Die primären Beschränkungen der Technik sind, dass es einen Kryostaten erfordert, und es ist relativ geringen Durchsatz. Allerdings können qualitativ hochwertige RNA aus kleinen Proben von gepoolten m erhalten werdenuscle Kryoschnitte, so dass dieses Verfahren zugänglich für viele verschiedene Skelettmuskeln und anderen Geweben. Darüber hinaus ermöglicht diese Technik angepasst Analysen (zB Gewebe Histopathologie und Genexpression) aus benachbarten Regionen eines einzelnen Skelettmuskel , so dass Messungen direkt im Vergleich über mehrere Anwendungen hinweg werden können experimentelle Unsicherheit zu reduzieren und replikative Tierversuche notwendig zur Quelle ein kleines Gewebe zu reduzieren für mehrere Anwendungen.
Einleitung
Das Ziel dieser Technik ist es, mehrere experimentelle Analysen von verschiedenen Modalitäten, wie Histologie und Genexpression, zugänglich von einem einzigen kleinen Skelettmuskel Quelle Gewebe zu machen. Mikroskopieanwendungen sind die empfindlichsten Konservierungsverfahren abzutasten, die sorgfältig während der Kryokonservierung kontrolliert werden muss, die Bildung von Eiskristallen Artefakte zu begrenzen. Somit wird der Methodenentwicklung auf der Grundlage der tibialis anterior (TA) gefroren Muskel teilweise mit Einbettungsharz in einer -140 ° C mit flüssigem Stickstoff gekühlt 2-methylbutan-Bad als Ausgangsmaterial sowohl für die Mikroskopie Immunofluoreszenz....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Alle Tier Verfahren wurden von der University of Georgia Institutional Animal Care und Use Committee unter Verwendung von Tieren Protokoll A2013 07-016 (Beedle) zugelassen.
1. Kryokonservierung von Unfixierte Skelettmuskel
- Vorbereitung
- Schneiden Kork in kleine Quadrate (ca. 1 cm x 1 cm) mit einer Rasierklinge, schreiben auf den Korken mit einer feinen Spitze Marker, der an 2-Methyl resistent ist, die Quelle Maus und Muskel zu identifizieren, und machen einen sehr flachen Schnitt (ca. 1 mm) über die obere Oberfläche. Legen Sie eine Kunststoff-Deckglas in den Schnitt zur Ausrichtung des Gewebes zu verwenden. Wiederholen, bis ein Korken berei....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Muscle Kryoschnittes RNA ist hoch in der Qualität und sorgt für eine ausreichende Ausbeute für die meisten Anwendungen
Die Analysen von sechzehn Skelettmuskel - RNA - Präparationen sind in Tabelle 1 unter Verwendung von 19,4 bis 41 mg gepoolten tibialis anterior (TA) Muskel von 8 Kontrollmäusen gezeigt. Sowohl linke (L) und rechten (R) TA Muskeln wurden in Regenerationsversuche vorbereitet mit 3 Tagen gesammelt M.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Um die besten Ergebnisse mit dieser Methode zu erreichen, halten Harz auf das untere Drittel beschränkt Einbetten oder die Hälfte des Muskels während der Kryokonservierung Gewebe, weil überschüssiges Harz wird die Sammlung der gepoolten Kryoabschnitte verlangsamen und erhöhen Harz Kontamination in der RNA-Isolierung eingebettet ist. Auch besondere Aufmerksamkeit während der Nadel Homogenisierung ist wichtig, die Ausbeute zu maximieren und die Wahrscheinlichkeit einer Verstopfung der Nadel zu minimieren. Das Protokoll ka.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Verfasserin erklärt, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen hat.
Danksagungen
Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre und Junna Luan leisteten technische Unterstützung. Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases der National Institutes of Health unter der Fördernummer AR065077 unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung des Autors und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wieder.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Kork | VWR Scientific | 23420-708 | Mit einer scharfen Klinge in kleine Quadrate schneiden. |
| Deckglas aus Kunststoff | Fisher Scientific | 12-547 | Wird verwendet, um den Muskel während des Einfrierens auszurichten. |
| Niedertemperatur-Thermometer | VWR Scientific | 89370-158 | |
| 2-Methylbutan | Sigma | M32631-4L | Achtung: gefährliche Chemikalie. In einem brennbaren Schrank aufbewahren. |
| Einbettungsharz: "Kryomatrix" | Thermo Fisher Scientific | 6769006 | Andere Einbettungsharze können durch Kryomatrix ersetzt werden. |
| Kryostat | Thermo Fisher Scientific | microm HM550 mit Einweg-Klingenträger | Jeder funktionierende Kryostat sollte für das Protokoll ausreichend sein. |
| Einweg-Kryostat-Klinge | Thermo Fisher Scientific | 3052835 | Verwenden Sie eine geeignete Klinge oder ein geeignetes Messer für den zu verwendenden Kryostaten. |
| RNAse Dekontaminationslösung: "RNase Zap" | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Analysenwaage | Mettler Toledo | XS64 | |
| Pinsel | Daler Rowney | 214900920 | Zur Handhabung von Kryosektionen verwenden. Kann in Geschäften mit einfachem Künstlerbedarf gefunden werden. |
| Rasierklinge | VWR Scientific | 55411-050 | |
| Objektträger | VWR Scientific | 48311600 | |
| Reagenz für die organische RNA-Extraktion: TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Achtung: TRIzol ist eine gefährliche Chemikalie. Hinweis: Für die RNA-Extraktion aus der Skelettmuskulatur werden nur organische Extraktionsreagenzien empfohlen. |
| 18-Gauge-Nadel | VWR Scientific | BD305185 | |
| 22-Gauge-Nadel | VWR Scientific | BD305155 | |
| 26-Gauge-Nadel | VWR Scientific | BD305115 | Optional. Kann für eine dritte Runde der Probenverreibung im RNA-Extraktionsprotokoll verwendet werden. |
| 1 ml Spritze | VWR Scientific | BD309659 | Für sehr hochwertige Proben wird eine Luer-Lok-Spritze empfohlen (<>z. B. , VWR BD309628). |
| 1-Brom-3-chlorpentan (BCP) | Sigma | B9673 | |
| Für 70% Ethanol in DEPC-Wasser: 200 prozentiger Alkohol | Decon Laboratories, Inc. | +M18027161M | Mischen Sie 35 ml 200 prozentiger Alkohol + 15 ml DEPC-Wasser. |
| Für 70 % Ethanol in DEPC-Wasser: DEPC-behandeltes Wasser | Thermo Fisher Scientific | AM9922 | Mix 35 ml 200 prozentiger Alkohol + 15 ml DEPC-Wasser. |
| RNA-Aufreinigungskit: PureLink RNA Minikit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | Letzte Schritte der RNA-Vorbereitung. |
| DNase/Rnase-freies Wasser | Gibco | 10977 | DEPC-behandeltes Wasser kann ebenfalls verwendet werden. |
| Spektralphotometer: Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | AM2222 | Behandeln Sie gereinigte RNA, um DNA-Kontaminationen vor nachgelagerten Anwendungen zu entfernen. |
| Hydrophober Stift | Thermo Fisher Scientific | 8899 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco | 14190 | PBS für Immunfluoreszenzprotokoll. |
| Eselserum | Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc | 017-000-121 | Rehydrieren Sie normale Eselserumvorräte gemäß den Anweisungen des Herstellers und verdünnen Sie dann ein Aliquot auf 5% für Immunfluoreszenz. Es kann auch normales Ziegenserum verwendet werden. |
| eMHC-Antikörper | University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank | F1.652 | |
| Kollagen-VI-Antikörper | Fitzgerald Industries | #70R-CR009x | |
| Esel Anti-Kaninchen AlexaFluor488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| Ziege Anti-Maus IgG1 AlexaFluor546 | Thermo Fisher Scientific | A21123 | |
| DAPI (4',6- Diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Wässrige Eindeckmedien: Permafluor | Thermo Fisher Scientific | TA-030-FM | Verwenden Sie nur Eindeckmedien, die für fluoreszierende Anwendungen mit lichtbeständigen Eigenschaften entwickelt wurden. |
| Glasdeckglas | VWR Scientific | 16004-314 | Verwendung für die Montage von Objektträgern am Ende des Immunfluoreszenz-Protogramms |
| Bildanalyse-Software: ImageProExpress | Media Cybernetics, Inc. | Image-Pro Express oder fortgeschrittenere Produkte | Freeware ImageJ sollte auch für die manuelle Zählung funktionieren. Fortschrittlichere Software mit Segmentierungsmöglichkeiten kann eine teilweise Automatisierung des Prozesses ermöglichen; z.B. , ImageProPremier. |
| Zusammenführen und Kartieren von Abschnittsbildern: Photoshop | Adobe | Photoshop | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9659 | Sigma C9659 wurde eingestellt. Weitere Optionen für Kardiotoxin sind EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; oder Ge Script # RP17303; Diese wurden jedoch nicht validiert. |
| Reverses Transkriptionskit: Superscript III Erststrangsynthesesystem | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | Alle validierten, qualitativ hochwertigen Reagenzien für reverse Transkription können verwendet werden. |
| Standard-PCR: GoTaq Flexi-Polymerase-System | Promega | M8298 | Jedes validierte, qualitativ hochwertige Taq-Polymerase-System kann verwendet werden. Wenn die DNA-Sequenzierung für eine der PCR nachgelagerte Anwendung verwendet werden soll, sollte stattdessen ein High-Fidelity-PCR-System verwendet werden. |
| SYBR grün | Thermo Fisher Scientific | S7585 | Zur Verwendung in der qPCR, wenn kein spezieller qPCR-Mastermix verwendet wird. Zur Verwendung mit SuperROX (für Applied Biosystems-Instrumente) und GoTaq Flexi-Polymerase und -Puffern. |
| ROX: SuperROX, 15 mM | BioResearch Technologies, Inc. Novato CA | SR-1000-10 | SuperROX ist in der PCR-Reaktion stabiler und wird daher als passiver qPCR-Referenzfarbstoff gegenüber ROX (Carboxy-X-Rhodamin) bevorzugt. Für qPCR mit Applied Biosystems |
| Instrumenten Echtzeit-PCR | Applied Biosystems | 7900HT |
Referenzen
- Foltz, S. J., et al. Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice. PLoS One. 11 (1), 0147049(2016).
- Bartoli, M., et al.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
