نقدم بروتوكول لfunctionalize الزجاج مع بقع البروتين النانومترية تحيط بها طبقة ثنائية الدهن السائل. هذه ركائز متوافقة مع المجهر الضوئي المتقدمة، ومن المتوقع أن تكون بمثابة منصة للدراسات التصاق الخلايا والهجرة.
حاليا هناك اهتماما كبيرا في خلق صفائف أمر من الجزر البروتين لاصقة في بحر من سطح تخميلها للدراسات البيولوجية الخلية. في السنوات الماضية، فقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أن الخلايا الحية تستجيب، وليس فقط لطبيعة البيوكيميائية من الجزيئات المقدمة لهم ولكن أيضا على الطريقة التي يتم بها عرض هذه الجزيئات. خلق البروتين أنماط الصغرى ولذلك المعيار الآن في العديد من المختبرات البيولوجية. متعدد الأنماط نانو هي أيضا أكثر سهولة. ومع ذلك، في سياق التفاعلات خلية خلية، هناك حاجة إلى نمط ليس فقط ولكن أيضا البروتينات طبقات ثنائية الدهون. وحتى الآن لم تكن هذه المزدوجة الزخرفة-PROTEO شحمي الوصول إليها بسهولة. نحن نقدم تقنية السطحية لخلق البروتين نانو النقاط معتمدة على الزجاج واقتراح طريقة لردم مساحة بين نقطة مع طبقة ثنائية الدهون المدعومة (SLB). من الصور تبييض التتبع الدهون الفلورسنت المدرجة في SLB، علينا أن نبرهن على طبقة ثنائية المعارض الكبيرة في وررسيولة انو. Functionalizing النقاط البروتين مع مجموعات الفلورسنت يسمح لنا صورة لها وتظهر أنها تنظم في شعرية سداسية منتظمة. النقطة حجم النموذجي هو حوالي 800 نانومتر، والتباعد تظاهر هنا هو 2 ميكرون. ويتوقع لهذه ركائز لخدمة منصات مفيدة لالتصاق الخلايا والهجرة والدراسات والميكانيكية الاستشعار عن بعد.
التصاق الخلايا تتم من خلال جزيئات متخصصة التصاق الخلية (الحدب)، البروتينات الموجودة على غشاء الخلية التي هي قادرة على الربط إلى نظيرتها في نسيج خارج الخلية أو على خلية أخرى. على خلايا الالتزام، ومعظم جزيئات الالتصاق بما في ذلك إنتغرين في كل مكان وكادهيرين، وتوجد في شكل مجموعات 1. تفاعل الخلايا الليمفاوية T (خلايا T) مع خلايا مقدمة للمستضد (ناقلات الجنود المدرعة) يوفر التوضيح ولا سيما ضرب من أهمية مجموعات مستقبلات شكلت في واجهة بين خليتين – غالبا ما يسمى المشبك المناعي. على تشكيل أول اتصال مع مستقبلات الخلايا APC، T (TCRs) على سطح T شكل خلية ميكرون مجموعات على نطاق والتي تكون بمثابة إشارات منصات 2، 3، 4، ومركزية في نهاية المطاف إلى تشكيل أكبر كتلة supramolecular المركزية (cSMAC )معشوقة = "XREF"> 5، 6، 7. مؤخرا، تبين أن على الجانب APC، وتتركز في بروابط من TCR أيضا 8.
في سياق T خلية APC التفاعل، ونشر الأنظمة الهجينة، حيث حاكت APC قبل العشب الصناعي functionalized مع البروتينات ذات الصلة، وقد تقدمت كثيرا فهمنا واجهة متشابك 2، 3، 4، 5، 6، 7 . في هذا السياق، هو ذات أهمية كبيرة لتصميم APC السطوح المحاكاة التي تستحوذ واحد أو أكثر من جوانب الخلية المستهدفة. على سبيل المثال، إذا تم المطعمة بروابط على طبقات ثنائية الدهون المعتمدة، فإنها يمكن أن تنتشر في الطائرة من طبقة ثنائية، تحاكي الوضع على سطح APC، وفي الوقت نفسه تسمح تشكيلcSMAC 6 و 7. وبالمثل، وقد حاكت مجموعات على APC من خلال خلق جزر بروابط في بحر من البوليمرات 9، 10، 11، 12، 13، 14. ومع ذلك، حتى الآن لم يتم الجمع بين هذه الميزات اثنين.
نحن هنا وصف تقنية الرواية لخلق نانو النقاط مكافحة CD3 (الأجسام المضادة التي تستهدف مجمع TCR) وتحيط بها طبقة ثنائية الدهون مع الدهون نشرها. وتودع طبقة ثنائية باستخدام انجمير-بلودجيت / انجمير-شايفر تقنية 7 و 15 و 16 و إذا رغبت في ذلك، يمكن functionalized مع بروتين معين – على سبيل المثال، يجند للخلية إنتغرين T (وتسمى ICAM1). وبالإضافة إلى ذلك، ومكافحة CD3 النقاط البروتين فصول التوجيه الجامعييتم استبدال دينار مع الأجسام المضادة أو CAM آخر. في حين أننا اخترنا البروتينات لاستخدامها في المستقبل كمنصة لT الدراسات التصاق الخلية، واستراتيجية مفصلة هنا يمكن تكييفها لأي البروتين، وحتى الحمض النووي.
ترتبط الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول المذكورة أعلاه إلى تشكيل البروتين نانو النقاط أو العودة ملء الفضاء حول النقاط التي كتبها طبقة ثنائية الدهون المعتمدة. الخطوة الأولى الحاسمة فيما يتعلق البروتين نانو النقاط هي إعداد حبة قناع. تنظيف غطاء الشريحة أمر بالغ الأهمية. وي…
The authors have nothing to disclose.
نشكر لوران Limozin، بيير ديلارد واستريد فاهل لمواصلة مناقشات مثمرة حول التطبيقات الخلوية. كما نشكر فريدريك البدو من مرفق غرف الأبحاث PLANETE لمساعدته مع الملاحظات SEM. وقد تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل مجلس البحوث الأوروبي عبر منحة رقم 307104 FP / 2007-2013 / ERC.
Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | |
Observation chamber | Home made | |
Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 |
Ultra-sonicator | ThermoFisher | |
Desiccator | Labbox | |
Crystallizer | Shott | |
Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 |
PBS | Sigma-aldrich | P3813 |
Water MQ | ELGA, Veolia France | |
Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 |
APTES | Sigma-aldrich | A3648 |
BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 |
DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C |
Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 |
Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 |
Film balance | NIMA | Medium |
Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system |
Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | |
Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |