Ligand Nano-klynge Arrays i et understøttet lipid-dobbeltlag
Summary
Vi præsenterer en protokol til funktionalisering glas med nanometriske protein patches omgivet af en fluid lipiddobbeltlaget. Disse substrater er kompatible med avanceret optisk mikroskopi og forventes at tjene som platform for celleadhæsion og migrationsundersøgelser.
Abstract
I øjeblikket er der betydelig interesse i at skabe ordnede arrays af selvklæbende protein øer i et hav af passiveret overflade til cellebiologiske studier. I de seneste år er det blevet mere og mere klart, at levende celler reagerer, ikke kun for den biokemiske natur af molekylerne præsenteret for dem, men også til den måde disse molekyler er præsenteret. Oprettelse protein mikro-mønstre er derfor nu standard i mange biologiske laboratorier; nano-mønstre er også mere tilgængelige. Men i forbindelse med celle-celle-interaktioner, er der behov for mønster ikke blot proteiner, men også lipiddobbeltlag. En sådan dual Proteo-lipid mønster har hidtil ikke været let tilgængelige. Vi tilbyder en let teknik til at skabe protein nano-prikker understøttet på glas og foreslå en metode til at efterfylde den inter-dot rum med en understøttet lipid-dobbeltlag (SLB). Fra foto-blegning af sporstof fluorescerende lipider inkluderet i SLB viser vi, at dobbeltlaget udviser betydelige i-plane flydende. Funktionalisering af protein prikker med fluorescerende grupper giver os mulighed for at billedet dem og for at vise, at de er bestilt i en regulær sekskantet gitter. Den typiske punktstørrelse er ca. 800 nm og afstanden demonstreret her er 2 mikrometer. Disse substrater forventes at tjene som nyttige platforme for celleadhæsion, migrering og mekanisk-sensing undersøgelser.
Introduction
Celleadhæsion sker gennem specialiserede celleadhæsionsmolekyler (CAM'er), proteiner til stede på cellemembranen, der er i stand til at binde til deres modpart på den ekstra cellulære matrix eller på en anden celle. På adhærerede celler, de fleste adhæsionsmolekyler, herunder den allestedsnærværende integrin og cadherin, findes i form af klynger 1. Interaktionen af T-lymfocytter (T-celler) med antigenpræsenterende celler (APC'er) tilvejebringer en særlig slående illustration af vigtigheden af receptor klynger dannet ved grænsefladen mellem de to celler – ofte kaldet en immunologisk synapse. Ved dannelse af den første kontakt med APC, T-cellereceptorer (TCR'er) på overfladen af celle formular micron skala klynger T, der tjener som signalering platforme 2, 3, 4, og til sidst centraliserede til dannelse af en større central supramolekylært klynge (cSMAC )lass = "xref"> 5, 6, 7. For nylig blev det vist, at på APC side, er ligander af TCR også klynger 8.
I forbindelse med T-celle-APC-vekselvirkning, indsættelse af hybride systemer, hvor APC efterlignes af en kunstig overflade funktionaliseret med relevante proteiner, har i høj grad avancerede vores forståelse af den synaptiske grænseflade 2, 3, 4, 5, 6, 7 . I denne sammenhæng er det yderst relevant at designe APC mimetiske overflader, der fanger en eller flere aspekter af målcellen. For eksempel, hvis ligander er podet på understøttede lipiddobbeltlag, kan de diffundere i planet af dobbeltlaget, efterligner situationen på APC-overfladen og samtidig tillade dannelse af dencSMAC 6, 7. Ligeledes har klyngerne på APC blevet efterlignet ved at skabe øer af ligander i et hav af polymerer 9, 10, 11, 12, 13, 14. Disse to funktioner er hidtil ikke blevet kombineret,.
Her beskriver vi en ny teknik til at skabe nano-prikker af anti-CD3 (et antistof rettet mod TCR-komplekset) omgivet af et lipiddobbeltlag med spredende lipider. Dobbeltlaget deponeres ved anvendelse Langmuir-Blodgett / Langmuir-Schaefer teknik 7, 15, 16 og om ønsket kunne være funktionaliseret med et specifikt protein – f.eks liganden af T-integrin (kaldet ICAM1). Hertil kommer de anti-CD3 protein dots could erstattes med et andet antistof eller CAM. Mens vi har valgt de proteiner til fremtidig anvendelse som platform for T-celle vedhæftning undersøgelser, kan den strategi detaljeret her tilpasses til ethvert protein og endda DNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kritiske trin i protokollen ovenfor beskrevne er relateret til dannelsen af protein-nano-prikker eller back-fyldning af rummet omkring prikkerne af et understøttet lipiddobbeltlaget. Den første kritiske trin i forhold til protein nano-prikker er fremstillingen af den perle-maske. Rensningen af dækslet-slide er kritisk. Objektglassene skal enten renses med en detergentopløsning, der anbefales til rengøring kvartskuvetter eller med oxygenplasma. Andre rengøring teknikker som nedsænkning i ethan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Laurent Limozin, Pierre Dillard og Astrid Wahl for fortsat frugtbare diskussioner om cellulære applikationer. Vi takker også Frederic Bedu fra PLANETE renrum for hans hjælp med SEM observationer. Dette arbejde blev delvist finansieret af Det Europæiske Forskningsråd via tilskud nr 307.104 FP / 2007-2013 / ERC.
Materials
| Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | |
| Observation chamber | Home made | |
| Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 |
| Ultra-sonicator | ThermoFisher | |
| Desiccator | Labbox | |
| Crystallizer | Shott | |
| Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 |
| Water MQ | ELGA, Veolia France | |
| Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 |
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
| Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 |
| Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 |
| Film balance | NIMA | Medium |
| Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system |
| Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | |
| Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |
References
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2002).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Kaizuka, Y., et al. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
- Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).
- Grakoui, A., et al. The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation. Science. 285, 221-228 (1999).
- Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells. Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).
- Lu, X., et al. Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).
- Pi, F., Dillard, P., et al. Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells. Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).
- Deeg, J., et al. T cell activation is determined by the number of presented antigens. Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).
- Delcassian, D., et al. Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells. Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).
- Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays. Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).
- Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization. Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).
- Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies. Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).
- Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion. Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).
- Sengupta, K., et al. Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid. Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).
- Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography. Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).
- Massou, S., et al. Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates. Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).
- Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion. Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).
- Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Schvartzman, M., et al. Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level. Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).
- Mossman, K., Groves, J. Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse. Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).
- Furlan, G., et al. Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters. J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).
- Hsu, C. J., et al. Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation. PloS One. 7 (2), e32398 (2012).
- Yu, C., et al. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).
